一种靶向抗肿瘤细胞和肿瘤干细胞的纳米载体及其制备方法和应用

本发明属于医药，具体涉及一种靶向抗肿瘤细胞和肿瘤干细胞的纳米载体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、手术治疗、放疗、化疗以及这三种方法相互结合的治疗是目前临床乳腺癌治疗的主要手段。临床上乳腺癌治疗方法的不断更新完善，给乳腺癌患者带来新的希望，同时也延长了患者的生存时间。但是，乳腺癌的复发和现存方法存在的缺陷(化疗药物的耐药性、全身毒副作用等)依然是临床急需解决的问题。近年来大量的研究表明，乳腺癌干细胞与乳腺癌的复发、耐药与转移存在着密切的关系。乳腺癌干细胞是乳腺癌中存在的一小部分细胞，通过不断自我更新和分化来维持乳腺肿瘤的生长和发展(zhang,y.,et al.,theeradication of breast cancer and cancer stem cells using octreotide modifiedpaclitaxel active targeting micelles and salinomycin passive targetingmicelles.biomaterials,2012.33(2):p.679-91.)。目前临床使用的大部分化疗药物对乳腺癌干细胞无效，在化疗之后存活下来的干细胞，经过一段时间的休眠后，通过自我更新和分化形成新的肿瘤，导致乳腺癌的复发和转移。因此，药物治疗乳腺癌时，同时杀死乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞显得至关重要。

2、利用纳米载体制备的纳米药物在肿瘤的靶向治疗中有许多优势，比如提高疏水药物的水溶性、提高药物的生物利用度、提高组织或者细胞靶向性等等，但是也存在着不能有效地控制药物从载体中释放、释药不够完全、靶向效果不理想、不能同时靶向肿瘤细胞和肿瘤干细胞等问题；载体材料也存在着在体内无法降解、载药量较低等问题；比如中国发明专利公开了一种聚姜黄素与透明质酸以酯键嵌合的两亲性嵌段共聚物作为纳米载体，该共聚物载体增加了姜黄素的水溶性，提高了载药量和稳定性，但是该共聚物载体姜黄素的载药量仍然有限，该共聚物载体采用dcc/dmap为缩合剂，通过姜黄素的酚羟基与透明质酸上支链的羧基进行链接形成酯键，然而这种连接方法的接枝率一般不太高，姜黄素的含量只占到1.3％左右(manju s,sreenivasan k.conjugation of curcumin onto hyaluronicacid enhances its aqueous solubility and stability[j].journal of colloid andinterface science,2011,359(1):318-325.)，姜黄素的载量较低。因此十分有必要研究出新的姜黄素高载量、同时实现肿瘤细胞和肿瘤干细胞的靶向治疗的载体。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有技术中肿瘤治疗的不足，提供一种靶向抗肿瘤细胞和肿瘤干细胞的纳米载体及其制备方法和应用。

2、本发明的目的在于提供一种两亲性嵌段共聚物，所述两亲性嵌段共聚物可作为一种靶向抗肿瘤细胞和肿瘤干细胞的纳米载体。

3、本发明的目的在于提供所述两亲性嵌段共聚物的制备方法。

4、本发明的目的在于提供所述两亲性嵌段共聚物在制备靶向抗肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的药物中的应用。

5、本发明的上述目的通过以下技术手段实现：

6、本发明提供了一种两亲性嵌段共聚物，该两亲性嵌段共聚物以具有双硫键的聚姜黄素(pcda)作为纳米载体的疏水端，以能够同时与肿瘤细胞和肿瘤干细胞表面过度表达的cd44受体特异性结合的透明质酸(ha)作为亲水端和靶头，通过酰胺键连接pcda和ha形成两亲性嵌段共聚物(ha-b-pcda)，该两亲性嵌段共聚物作为纳米载体负载药物可以高效的靶向肿瘤细胞和肿瘤干细胞，实现药物在靶细胞内的智能快速释放，从而杀死肿瘤细胞和肿瘤干细胞。该两亲性嵌段共聚物可以高效接枝姜黄素，提高姜黄素载量；同时，该两亲性嵌段共聚物中酰胺键的存在使得其作为载体时在生理环境中更稳定，可减少靶头在未到达肿瘤靶点前的脱落。

7、一种两亲性嵌段共聚物(ha-b-pcda)，以具有双硫键的聚姜黄素(pcda)作为疏水端，以透明质酸(ha)作为亲水端和靶头，具有双硫键的聚姜黄素通过酰胺键与透明质酸连接形成两亲性嵌段共聚物(ha-b-pcda)，所述具有双硫键的聚姜黄素(pcda)的结构式如式(i)所示：

8、

9、所示两亲性嵌段共聚物的结构式如式(ii)所示：

10、

11、一种两亲性嵌段共聚物的制备方法，包括以下步骤：

12、s1.具有双硫键的聚姜黄素(pcda)的制备

13、将姜黄素、3,3’-二硫二丙酸、n-n-二环已基碳二亚胺(dcc)和4-二甲氨基吡啶(dmap)与无水二氯甲烷混合，室温下充分反应；过滤，滤液以无水乙醚结晶，晶体纯化、干燥后即得具有双硫键的聚姜黄素(pcda)；所述具有双硫键的聚姜黄素为橙黄色粉末；

14、优选地，步骤s1所述姜黄素：3,3’-二硫二丙酸质量比为1～1.2：0.5～0.6。

15、进一步优选地，步骤s1所述姜黄素：3,3’-二硫二丙酸质量比为1.008：0.572。

16、s2.氨基功能化透明质酸的制备

17、将透明质酸(ha)与ph5～6的缓冲液混合后再与1,4-丁二胺混合，50～55℃下充分反应；然后添加氰基硼氢化钠，50～55℃下充分反应，反应结束后，将反应物透析，干燥即得氨基功能化透明质酸；所述氨基功能化透明质酸为乳白色固体；

18、优选地，步骤s2所述缓冲液为ph5.6的2wt％乙酸缓冲液。

19、优选地，步骤s2所述充分反应为50～55℃下搅拌20～24h。

20、进一步优选地，步骤s2所述充分反应为50℃下磁力搅拌24h。

21、优选地，步骤s2所述添加氰基硼氢化钠并充分反应的步骤，分3次进行。

22、优选地，步骤s2所述透析是在去离子水中透析70～72h。

23、优选地，步骤s2所述透析是在去离子水中透析72h。

24、s3.聚姜黄素琥珀酰亚胺酯(pcda-nhs)的制备

25、将步骤s1制备的具有双硫键的聚姜黄素(pcda)的二氯甲烷溶液、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)混合，室温下充分反应，然后用无水乙醚0～10℃下结晶反应产物，将结晶的固体干燥即得聚姜黄素琥珀酰亚胺酯(pcda-nhs)；所述pcda-nhs为橙黄色胶状固体。

26、优选地，步骤s3所述二氯甲烷为无水二氯甲烷。

27、优选地，步骤s3所述充分反应是室温下搅拌20～22h。

28、进一步优选地，步骤s3所述充分反应是室温下搅拌20h。

29、优选地，步骤s3所述具有双硫键的聚姜黄素(pcda)：n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)的质量比为0.5～0.6：0.1～0.2：0.2～0.3。

30、进一步优选地，步骤s3所述具有双硫键的聚姜黄素(pcda)：n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)的质量比为0.506：0.134：0.234。

31、优选地，步骤s3所述结晶的温度为3～6℃。

32、进一步优选地，步骤s3所述结晶的温度为4℃。

33、优选地，步骤s3所述结晶的时间为10～12h。

34、进一步优选地，步骤s3所述结晶的时间为12h。

35、s4.两亲性嵌段纳米载体(ha-b-pcda)的制备

36、将步骤s2制备的氨基功能化透明质酸和步骤s3制备的聚姜黄素琥珀酰亚胺酯(pcda-nhs)与二甲亚砜(dmso)混合，然后再与n,n-二异丙基乙胺混合，在45～55℃下充分反应。将反应溶液透析，干燥即得两亲性嵌段共聚物(ha-b-pcda)；所述ha-b-pcda为橙色粉末。

37、优选地，步骤s4所述充分反应为45～55℃下搅拌46～48h。

38、优选地，步骤s4所述充分反应为50℃油浴下搅拌48h。

39、优选地，步骤s4所述氨基功能化透明质酸：聚姜黄素琥珀酰亚胺酯：n,n-二异丙基乙胺的质量体积比为0.2～0.8g：0.3～0.4g：15～20μl。

40、进一步优选地，步骤s4所述氨基功能化透明质酸：聚姜黄素琥珀酰亚胺酯：n,n-二异丙基乙胺的质量体积比为0.280g：0.352g：20μl。

41、优选地，所述透析以去离子水透析70～72h。

42、进一步优选地，所述透析以去离子水透析72h，每12h更换一次去离子水。

43、利用上述制备方法制备得到的两亲性嵌段共聚物也在本发明的保护范围之内。

44、所述两亲性嵌段共聚物在制备靶向抗肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的药物中的应用也在本发明的保护范围之内。

45、优选地，所述两亲性嵌段共聚物作为纳米载体在制备抗肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的纳米药物中的应用。

46、优选地，所述肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞为表面表达cd44受体的肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞。

47、进一步优选地，所述肿瘤为乳腺癌、胰腺癌、唾液腺癌肿瘤、胃癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌或白血病中的一种或多种。

48、进一步优选地，所述肿瘤为乳腺癌。

49、一种靶向抗肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞的药物，以所述两亲性嵌段共聚物制备得到。

50、一种靶向抗肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞药物的制备方法，将所述两亲性嵌段共聚物(ha-b-pcda)的二甲亚砜(dmso)溶液与水混合，或两亲性嵌段共聚物(ha-b-pcda)和抗肿瘤药物的二甲亚砜(dmso)溶液与水混合，混合液透析，即得药物。

51、优选地，所述药物以低毒的二甲亚砜作为有机溶剂，安全性更高，通过简单的混合及透析即可制备纳米药物，制备工艺简单。

52、优选地，所述水为超纯水。

53、优选地，所述两亲性嵌段共聚物：抗肿瘤药物质量比为1～2：0.1～0.2。

54、进一步优选地，所述两亲性嵌段共聚物：抗肿瘤药物质量比为1：0.1。

55、优选地，所述抗肿瘤药物为阿霉素或多西紫杉醇。

56、相比现有技术，本发明具有以下有益效果：

57、本发明提供了一种两亲性嵌段共聚物，所述两亲性嵌段共聚物通过酰胺键将聚姜黄素和透明质酸连接，该两亲性嵌段共聚物可作为载体负载化疗药物，同时能够靶向乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞，负载药物后在细胞水平和动物体内均可靶向乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞，并发挥抗乳腺癌效果，可作为抗肿瘤药物新的载体；同时，该两亲性嵌段共聚物具有更高的姜黄素载量，姜黄素的含量能够达到25％；同时酰胺键的存在使两亲性嵌段共聚物作为载体时在生理环境中更稳定，可减少靶头在未到达肿瘤靶点前的脱落，为抗肿瘤的治疗提供了新的药物选择。