一种与蛋鸭繁殖性能相关的单倍型分子标记及其应用的制作方法

1.本发明涉及分子遗传学领域，特别是涉及一种与蛋鸭繁殖性能相关的单倍型分子标记及其应用。


背景技术：

2.鸭是最重要的农业禽畜动物之一。鸭肉和鸭蛋为人类提供了重要的动物蛋白来源，同时由于人们健康观念的改善，以猪牛羊为代表的红肉消费需求趋于稳定，而以鸭蛋消费需求在稳步提升。因此，加快优质蛋鸭品种的遗传改良具有重大的经济效益。
3.snp作为遗传标记已经广泛地应用于基因定位、克隆、遗传育种以及遗传多样性等研究领域。然而，受到不同实验群体地遗传背景差异，奠基者效应，多基因互作效应，基因-环境互作效应，不完全选择/平衡选择效应，遗传标记数量地限制以及连锁不平衡等因素地干扰，导致目前蛋鸭分子育种实践中仍然缺少功能明确、效应显著地分子标记。因此，挖掘在中外群体中通用的、效应巨大的、准确的分子标记是当前的研究重点。
4.kdm4c基因属于jumonji结构域2(jmjd2)家族。编码的蛋白质是一种三甲基化特异性脱甲基酶，并将特异性三甲基化组蛋白残基转化为二甲基化形式，这种酶作用调节基因表达和染色体分离，在肿瘤细胞中可发现染色体畸变和该基因表达的变化。kdm4c基因是一个相对比较新的基因，对其研究刚刚起步，在家禽中的研究尚未见报道。如果能够找到与蛋鸭繁殖性状相关的snp分子标记，将极大促进鸭的遗传改良，为家禽育种领域带来突破性进展。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种与蛋鸭繁殖性能相关的单倍型分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该分子标记能够为鸭早期繁殖性状检测提供一种快速、简便、价格低廉的基因分析方法，有利于筛选出高产蛋性状的蛋鸭个体，指导蛋鸭早期的分子标记辅助选育。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种与蛋鸭繁殖性能相关的单倍型分子标记，包括snp1-snp5共5个snp位点；
8.其中，snp1所在基因位置为seq id no.1所示序列的128bp，该处碱基为a或g；
9.snp2所在基因位置为seq id no.2所示序列的165bp，该处碱基为a或g；
10.snp3所在基因位置为seq id no.3所示序列的57bp，该处碱基为c或t；
11.snp4所在基因位置为seq id no.4所示序列的105bp，该处碱基为g或c；
12.snp5所在基因位置为seq id no.5所示序列的52bp，该处碱基为t或c。
13.进一步地，当所述单倍型分子标记按snp1-snp5依次为ggtcg纯合基因型时，对应的蛋鸭具有高产蛋性状；当所述单倍型分子标记按snp1-snp5依次为aacgt纯合基因型时，对应的蛋鸭具有低产蛋性状。
14.本发明还提供一种用于扩增如上所述的与蛋鸭繁殖性状相关的单倍型分子标记的引物组合，包括用于扩增snp1-snp5的5对引物，引物序列为：
15.snp1：
16.上游引物序列1：5
’‑
tcaggtgtacttttcatgaaatcc-3’17.下游引物序列1：5
’‑
atttccaaaataggtaagacggtc-3’18.snp2：
19.上游引物序列2：5
’‑
gtctgtgatcttatggcttaatgg-3’20.下游引物序列2：5
’‑
gtactgacagtaacgttagcaatc-3’21.snp3：
22.上游引物序列3：5
’‑
cacaagagcaatcaaatttccatc-3’23.上游引物序列3：5
’‑
tgaggtgacttggaaattaaactg-3’24.snp4：
25.上游引物序列4：5
’‑
gtgtattttctgcaaactgtgaag-3’26.上游引物序列4：5
’‑
tagaggggaaagaagataatgagg-3’27.snp5：
28.上游引物序列5：5
’‑
ttactcattgtttgcatactgagg-3’29.上游引物序列5：5
’‑
acagcatttttgttcaactctttg-3’。
30.本发明还提供一种含有如上所述引物组合的检测试剂或试剂盒。
31.本发明还提供一种如上所述的单倍型分子标记、如上所述的引物组合或如上所述的检测试剂或试剂盒在鉴定及早期筛选蛋鸭繁殖性状中的应用。
32.本发明还提供一种利用如上所述的单倍型分子标记鉴定或早期预测蛋鸭繁殖性状的方法，包括以下步骤：
33.1)提取待测蛋鸭的基因组dna；
34.2)以待测蛋鸭的基因组dna为模板，设计用于扩增如上所述单倍型分子标记的引物组合，进行pcr扩增反应；
35.3)分析pcr扩增产物。
36.进一步地，步骤2)中所用引物组合为权利要求3所述引物组合。
37.本发明还提供一种如上所述的单倍型分子标记、如上所述的引物组合或如上所述的检测试剂或试剂盒在鸭分子标记辅助育种中的应用。
38.本发明公开了以下技术效果：
39.本发明公开了一种与蛋鸭繁殖性能相关的单倍型分子标记及其应用，从母鸭基因组中扩增性染色体z号染色体，测序获得一种蛋鸭繁殖性能相关的snp单倍型，该单倍型涉及kdm4c基因上5段产蛋数相关的基因片段，其核苷酸序列分别如序列表seq id no.1，seq id no.2，seq id no.3，seq id no.4和seq id no.5所示，该单倍型由seq id no.1的第128bp处a128g的碱基突变，seq id no.2的第165bp处a165g的碱基突变，seq id no.3的第57bp处c57t的碱基突变，seq id no.4的第105bp处g105c的碱基突变，seq id no.5的第52bp处发生t52c的碱基突变组成。本发明能够为蛋鸭繁殖性能的早期选育提供一种快速、简便、价格低廉的基因分析方法，有利于筛选出产蛋数相对较好的蛋鸭个体，指导蛋鸭繁殖性能的早期分子标记辅助选育。
具体实施方式
40.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
41.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
42.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
43.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
44.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
45.实施例1
46.金定母鸭群体从0日龄开始地面饲养，100d时开始转移至笼上饲养，每只鸭一个笼位，观察并记录每只鸭的产蛋情况。统计每只鸭从开产日到300d的产蛋数，翅静脉采血，放入含有抗凝剂的2ml ep管中，用于基因组dna的提取。采用琼脂糖凝胶电泳和生物分光光度计检测样本质量。凝胶电泳条带清晰，无拖尾现象；od260/280＝1.8左右为质量合格样本，质量合格的样本用于后续高通量测序。
47.pcr扩增seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4和seq id no.5所示核苷酸序列，核苷酸序列及所用引物对序列信息如下：
48.seq no.1：长度为215bp，在该序列的第128bp处有一个a/g突变。
49.tcaggtgtacttttcatgaaatccataaaacttcatattattcctagcagtcgcttcagattgaacagagaccacccatataagtattccttttttttttttttttttttttttttttcaatagggca/ggttgttgtgtttttaaacgaatatctcaggacttcctaaagtcccttctcagtctgtacttagaccgtcttacctattttggaaat
50.seq no.2：长度为226bp，在该序列的第165bp处有一个a/g突变。
51.gtctgtgatcttatggcttaatggaagatttatatgatagatttgttgggttaacttaaaaaattggcaaaactgtaagcagtttcatgcgtctgagctttttttgcccatggttgctgatatctgcatctcacttctggtcttgtcaccaaagctgagtttcaa/gcagagttagagtgaatgagagtgctgctaaactggggattgctaacgttactgtcagtac
52.seq no.3：长度为219bp，在该序列的第57bp处有一个c/t突变。
53.cacaagagcaatcaaatttccatcttatcacagggcctggccggggtgtctccgctc/tcactctacgctccttactgttccttacagacagcactccatgttcccctagtgtgatagcatctaaggcaggagacctagggaacttctctgtgttacagctacatagaaattgccctttctttaaaatgtgaatatcagtttaatttccaagtcacctca
54.seq no.4：长度为205bp，在该序列的第105bp处有一个g/c突变。
55.gtgtattttctgcaaactgtgaagataaaaacagtcaaacatctaacatttgttagtttagctaacattaacctttttcttaagagcttacatgaaaaaggtgcg/caaatttagcataactgattcagtttatgttcaaagctgcgatatgttctgcctttccccatccctttcccttttccctcattatcttctttcccctcta
56.seq no.5：长度为221bp，在该序列的第52bp处有一个t/c突变。
57.ttactcattgtttgcatactgaggtagcaagttctgtgtgccttctataatt/cctttactttgtgttgttatgttctgtgtcttttgaaacctatttaacacagaatctgtcactagaatttatcttaactctaatgatcctgcatgaggaaagatggaattggctttgcagaagaagacctgggggtcatggtggacaaagagttgaacaaaaatgctgt
58.上游引物序列1：5
’‑
tcaggtgtacttttcatgaaatcc-3’(seq id no.6)
59.下游引物序列1：5
’‑
atttccaaaataggtaagacggtc-3’(seq id no.7)
60.上游引物序列2：5
’‑
gtctgtgatcttatggcttaatgg-3’(seq id no.8)
61.下游引物序列2：5
’‑
gtactgacagtaacgttagcaatc-3’(seq id no.9)
62.上游引物序列3：5
’‑
cacaagagcaatcaaatttccatc-3’(seq id no.10)
63.上游引物序列3：5
’‑
tgaggtgacttggaaattaaactg-3’(seq id no.11)
64.上游引物序列4：5
’‑
gtgtattttctgcaaactgtgaag-3’(seq id no.12)
65.上游引物序列4：5
’‑
tagaggggaaagaagataatgagg-3’(seq id no.13)
66.上游引物序列5：5
’‑
ttactcattgtttgcatactgagg-3’(seq id no.14)
67.上游引物序列5：5
’‑
acagcatttttgttcaactctttg-3’(seq id no.15)
68.采用多重pcr方法对样本进行扩增，其中，第一轮pcr配置方法为，5对引物工作液配制pcr mix，分装于219个个体相对应的96孔板中。取样本板充分解冻、震荡，1000rpm离心1s后进行加样。加样时每板预留2个孔，分别加入阳性及阴性对照。
69.一轮扩增体系为primer(50nm)2μl，dntp(2.5mm)0.8μl，taq酶(5u/μl)0.1μl，10x buffer 1μl，基因组dna(20ng/μl)2μl，mg
2+
(100mm)1μl，石蜡油10μl，ddh2o 3.2μl，共计20μl。
70.第一轮pcr反应条件如下：
①
95℃ 15min，1cycle；
②
94℃ 30s，60℃ 10min，4cycles；
③
94℃ 30s，60℃ 1min，72℃ 30s，20cycles。
71.第二轮pcr扩增体系为，一轮产物每孔加ddh2o 100μl，瞬时离心，室温静置10min。以稀释液作为二轮扩增模板，扩增体系barcode(2μm)3.6μl，dntp(2.5mm)0.8μl，taq酶(5u/μl)0.1μl，一轮产物样本10μl，mg
2+
(100mm)1μl，10x buffer 2μl，ddh2o 3.6μl，石蜡油20μl，总体系40μl。
72.第二轮pcr扩增反应条件为：
①
95℃ 15min，1cycle；
②
94℃ 30s，60℃ 4min，5cycles；
③
94℃ 30s，65℃ 1min，72℃ 30s，10cycles。
73.对二轮扩增获得的产物进行混样，对混样后的文库进行纯化，对纯化产物精确定量并稀释至测序所需浓度(10ng/μl)。
74.定量后的纯化产物，由上海翼和生物有限公司采用illumina x-10测序平台进行高通量测序。
75.测序后获得5个突变位点，采用生物信息学的方法对测序后获得的5个突变位点的信息进行分类汇总，获得每个样本每个突变位点的信息，得到与蛋鸭繁殖性状最显著相关
的5个snp位点，这5个snp位点均位于鸭的性染色体z号染色体，分别为kdm4c基因内含子8的第79201位核苷酸a
→
g的突变，第79542位核苷酸a
→
g的突变和第81085位核苷酸c
→
t的突变，内含子17位第237146位核苷酸g
→
c突变和第239497位核苷酸t
→
c位核苷酸的突变，在金定鸭群体中共检测到六种单倍型，分别为aacgt、aacct、aaccg、ggtcg、ggtcg、ggtgt和ggtgg。
76.利用sas 9.0软件的一般线性模型对6种单倍型与300日龄金定鸭产蛋数进行关联分析，关联分析结果见表1，数据以mean
±
s.d的方式呈现。
77.表1 6种单倍型与300日龄金定鸭产蛋性状的关联分析
[0078][0079]
注：不同小写字母表示差异显著
[0080]
由表1可知，金定鸭aacgt单倍型频率最高，为0.425，但300日龄时的产蛋数最低；ggtcg单倍型频率次之，为0.370，300日龄时的平均产蛋数最高，为131.41个，显著高于aacgt基因型和aacct基因型，因此，ggtcg单倍型为高产蛋的优选单倍型，可用于金定鸭早期产蛋数的选育。
[0081]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。