一种靶向PD-1mRNA反义脱氧寡核苷酸的筛选方法及应用

一种靶向pd-1 mrna反义脱氧寡核苷酸的筛选方法及应用
技术领域
1.本发明涉及疫苗技术领域，具体为一种靶向pd-1 mrna反义脱氧寡核苷酸的筛选方法及应用。


背景技术：

2.接种疫苗是预防感染性疾病最有效的措施，疫苗包括任何用作预防接种来刺激机体产生针对特定疾病的免疫反应的物质，佐剂作为疫苗的重要组分，被用于增强和/或塑造抗原特异性免疫反应。传统的疫苗例如灭活疫苗或减毒活疫苗，虽然有效并且有良好的免疫原性，但是存在着一定的安全隐患。因此，更加安全的亚单位疫苗被开发并得到了广泛的应用，但是亚单位疫苗的免疫效果和免疫原性通常较弱，因此，新型佐剂的开发和使用在新型疫苗中尤为重要。
3.现有的佐剂大致可分为三类:递送系统、免疫调节分子及兼具前两者性质的混合佐剂，尽管作用机制有所不同，但都是通过刺激免疫激活信号而起到增强免疫反应的作用的，尚未有通过抑制免疫抑制信号而发挥增强免疫反应的佐剂。ctla-4是表达在活化的t细胞表面的一种重要的免疫卡点分子，它可以通过阻断cd28介导的共刺激信号而对t细胞的活化发挥抑制作用。验证结果表明ctla-4 mrna 3’utr的靶向性aso可以通过抑制ctla-4介导的免疫抑制性信号，促进t细胞依赖的抗体应答，从而在灭活病毒疫苗和重组亚单位疫苗中发挥增强抗体水平的佐剂效应，这提示了对免疫抑制性信号的负性调节可成为研制新型疫苗佐剂的新策略。
4.ctla-4主要在免疫应答初期抑制na
ï
ve t细胞的早期活化，与ctla-4不同，另一种抑制性免疫卡点分子程序性细胞死亡受体 1（programmed cell death 1，pd-1）主要在免疫应答的晚期被诱导表达在效应t细胞上，来限制t细胞在外周组织中发挥功能。pd-1可以通过与其配体pd-l1和pd-l2相互作用，抑制t细胞的活化、增殖并促进t细胞的凋亡。不仅如此，pd-1也可以通过促进cd8+ t细胞的失能和耗竭而参与到慢性病毒感染中，验证表明抑制pd-1可以恢复cd8+ t细胞的功能及细胞毒性作用。因此，推测与ctla-4相比，阻断pd-1可以通过促进病毒的清除而更好的控制和预防病毒引起的感染性疾病，pd-1抑制剂可能在抗病毒疫苗中可能会发挥更好的疫苗佐剂作用。为此，提出了一种靶向pd-1 mrna反义脱氧寡核苷酸的筛选方法及应用。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种靶向pd-1 mrna反义脱氧寡核苷酸的筛选方法及应用，通过网络数据库和生物信息软件，以人和小鼠pd-1 mrna的保守序列为靶点，设计了一系列靶向pd-1 mrna的候选asos，并通过生物信息软件对其进行分析，初步筛选出形成分子间或分子内二级结构所需的自由能较高、与靶区mrna结合所需的自由能较低、且不易非特异性地结合其他与pd-1无关的mrna的asos（aspd-1、aspd-12及aspd-13），可以有效解决背景技术中的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：作为本发明的一个方面，一种靶向pd-1 mrna反义脱氧寡核苷酸的筛选方法，包括以下步骤：步骤一、人和小鼠pd-1 mrna序列信息的获取，在美国国立生物技术信息中心nucleotide数据库中，以“pd-1”为检索词，检索人和小鼠pd-1 mrna的序列信息；步骤二、人和小鼠pd-1 mrna保守序列的筛选，利用dnastar lasergene序列分析软件中的子软件“megalign”对人和小鼠pd-1 mrna的序列进行比对，以筛选二者的保守序列；步骤三、人和小鼠pd-1 mrna保守序列的二级结构预测，利用sfold在线分析软件中的srna功能对人和小鼠pd-1 mrna的二级结构进行预测，检测保守序列中未配对的碱基数，以判断这三段保守序列成为aso设计靶区的可能性；步骤四、人和小鼠pd-1 mrna保守序列内部稳定性分析，利用oligo分析软件对人和小鼠pd-1 mrna的保守序列的内部稳定性进行分析；步骤五、aso的二级结构预测和分子间/分子内能量分析，利用oligo分析软件对pd-1 mrna候选靶向性aso的二级结构进行预测；步骤六、aso与靶区mrna结合的能量分析，利用sfold在线分析软件中的soligo功能对候选asos与其靶区mrna结合的能量进行分析；步骤七、aso的评分，以aso的分子间/分子内自由能及aso与靶区mrna结合的自由能为重要参数，对候选asos进行了评分；步骤八、aso的合成。
7.反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，asos）是长度为13~25个碱基的短单链脱氧寡核苷酸（oligodeoxynucleotides，asos），可以根据碱基互补配对原则与靶mrna结合，诱导细胞内源性的rnase h对dna/rna复合物中的靶mrna进行切割，从而降低目标蛋白的表达。
8.进一步的，步骤二中，人和小鼠pd-1 mrna保守序列的筛选方法，如下：从“file”菜单中，选择“enter sequences”选项，输入人和小鼠pd-1 mrna的核苷酸序列；同时选中人和小鼠pd-1 mrna的核苷酸序列，从“align”菜单中的“one pair”选择“wilbur-lipman”配对比较方法对这两个序列进行对比分析；从显示比较结果的窗口，找出匹配的序列即为人和小鼠pd-1 mrna的保守序列。
9.进一步的，步骤四中，人和小鼠pd-1 mrna保守序列内部稳定性分析方法，如下：从“file”菜单中，选择“new sequence”选项，输入人或小鼠pd-1 mrna的核苷酸序列；在“internal stability”结果窗口中检索保守序列对应的内部自由能。
10.进一步的，步骤五中，aso的二级结构预测和分子间/分子内能量分析方法，如下：从“edit”菜单中，选择“upper primer”或“lower primer”选项，输入候选aso的序列；从“analyze”菜单中，“duplex formation”或“hairpin formation”选项，对候选asos分子间形成的二聚体结构及分子内部形成的发夹结构进行及分子间/分子内的自由能进行分析。
11.进一步的，步骤七中，对候选asos的评分方法，如下：（1）将1~15号asos按照分子间自由能由高到低排序，分子内自由能由高到低排序，靶区mrna结合能量由低到高排序进行排序；
（2）按照排序的1~15分别计为15~1分，将分子间自由能得分、分子内自由能得分、与靶区mrna结合能量得分计算总和，作为aso的综合得分；（3）按照综合得分将asos进行排序；（4）筛选出得分最高的三个asos作为最终的pd-1 mrna靶向性aso。
12.进一步的，步骤八中，aso的合成方法，如下：（1）通过高效液相色谱法对asos进行了纯化；（2）对asos的磷酸骨架进行了全硫代修饰；（3）将asos用无菌pbs溶解，微量多功能酶标仪定量；（4）用鲎试剂对asos的内毒素进行检测，内毒含量《5 eu/mg；（5）将溶解后的asos分装，于-20 ℃冰箱冻存备用。
13.本发明中所用的所有asos均由上海生工生物工程公司合成，用无菌pbs（nacl 8.0 g、kcl 0.2 g、na2hpo4 1.44 g及kh2po4 0.24 g，用去离子水定容至1 l， ph=7.4）溶解asos，分装，置于-20 ℃保存备用；其他试剂：edta、sds、硼酸、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、丙烯酰胺、过硫酸铵及尿素等化学药品均购自国药集团化学试剂有限公司和北京化工厂；tris及甘氨酸购自北京biotopped公司；rpim1640干粉及标准胎牛血清（fetal bovine serum，fbs）购自美国gibco公司；溴化乙锭购自美国sigma公司；temed购自德国merck公司；10
×
dna loading buffer购自大连takara生物工程公司；微量多功能酶标仪定量购自美国biotek仪器有限公司；lkb垂直电泳仪购自瑞典bromma公司；tanon1600凝胶成像仪购自上海天能科技有限公司；rki-1002恒温培养箱购自日本 rika-kogyo 有限公司；milli-ro90 plus多功能纯水系统购自美国millipore公司；sw-cj-1f超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司；移液器购自北京兴创实验仪器有限公司；1.5 ml离心管及移液器头购自美国corning公司。
14.作为本发明的另一方面，一种靶向pd-1 mrna反义脱氧寡核苷酸的应用，在疫苗中发挥佐剂效应。
15.进一步的，在灭活病毒疫苗或重组亚单位疫苗中发挥佐剂效应。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本靶向pd-1 mrna反义脱氧寡核苷酸的新型佐剂，具有以下好处：本发明通过网络数据库和生物信息软件，以人和小鼠pd-1 mrna的保守序列为靶点，设计了一系列靶向pd-1 mrna的候选asos，并通过生物信息软件对asos二级结构、自由能及靶点序列的二级结构等进行了分析，初步筛选出形成分子间或分子内二级结构所需的自由能较高、与靶区mrna结合所需的自由能较低、且不易非特异性地结合其他与pd-1无关的mrna的asos（aspd-1、aspd-12及aspd-13）。
17.通过流式细胞术证明了三种asos均可以进入t细胞中，其中aspd-1能够明显抑制pd-1 mrna及蛋白质水平，将aspd-1与灭活的小鼠流感病毒或重组hbsag抗原及乳化剂联用，可以增强抗原特异性抗体水平，从而发挥疫苗佐剂作用，流式细胞术进一步揭示aspd-1是通过抑制pd-1表达，促进t细胞的增殖活化，从而发挥疫苗佐剂作用的。
18.综上所述，aspd-1可以作为一种新型疫苗佐剂，通过抑制t细胞的pd-1免疫抑制性信号而发挥增强抗体应答的作用，这种通过抑制免疫抑制性信号从而增强免疫应答的思路为疫苗佐剂的设计提供了一种新策略。本发明不但可以拓宽免疫卡点抑制剂的应用，还可
以为新型疫苗佐剂的验证提供线索和理论基础。
附图说明
19.图1为人和小鼠pd-1 mrna的序列比对图；图2为人和小鼠pd-1 mrna保守序列的二级结构预测图；图3为人和小鼠pd-1 mrna保守序列的内部稳定性分析图；图4为靶向人和小鼠pd-1 mrna的asos的评分图；图5为pd-1 mrna靶向性asos入靶细胞的动力学分析图；图6为pd-1 mrna靶向性asos对t细胞中pd-1表达的影响图；图7为pd-1 mrna靶向性asos在小鼠脾细胞内对pd-1 mrna的作用图；图8为与靶向性asos结合的pd-1 mrna被rnase h切割的效率图；图9为aspd-1作为灭活病毒疫苗佐剂对抗体产生水平的影响图；图10为aspd-1作为重组亚单位疫苗佐剂对抗体产生水平的影响图；图11为aspd-1在体外对cd3+ t细胞表面pd-1表达的影响图；图12为aspd-1在体外对cd3+ t细胞活化能力的影响图；图13为aspd-1在体外对cd3+ t细胞增殖能力的影响图；图14为aspd-1在体外对cd11c+细胞表面cd86的影响图。
具体实施方式
20.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.本发明提供以下技术方案：作为本发明的一个方面，一种靶向pd-1 mrna反义脱氧寡核苷酸的筛选方法，包括以下步骤：步骤一 人和小鼠pd-1 mrna序列信息的获取为了以pd-1 mrna为靶点设计asos，在美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，ncbi；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）nucleotide数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）中，以“pd-1”为检索词，检索人和小鼠pd-1 mrna的序列信息；步骤二 人和小鼠pd-1 mrna保守序列的筛选由于pd-1 mrna靶向性aso既要能在小鼠模型上观察其生物学活性，又要使其具有在人体应用的潜力，利用dnastar lasergene序列分析软件中的子软件“megalign”对人和小鼠pd-1 mrna的序列进行比对，以筛选二者的保守序列，具体方法如下：从“file”菜单中，选择“enter sequences”选项，输入人和小鼠pd-1 mrna的核苷酸序列；同时选中人和小鼠pd-1 mrna的核苷酸序列，从“align”菜单中的“one pair”选择“wilbur-lipman”配对比较方法对这两个序列进行对比分析；从显示比较结果的窗口，找出匹配的序列即为人和小鼠pd-1 mrna的保守序列；通过检索和比较，获取3段长度大于15bp的保守序列，结果如图1所
示；步骤三 人和小鼠pd-1 mrna保守序列的二级结构预测利用sfold在线分析软件（http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/index.pl）中的srna功能（http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/srna.pl）对人和小鼠pd-1 mrna的二级结构进行预测，检测保守序列中未配对的碱基数，以判断这三段保守序列成为aso设计靶区的可能性；结果如图2所示，这三段保守序列均有碱基以未配对的形式存在，提示这三段保守序列均有可能成为aso设计的靶区；步骤四 人和小鼠pd-1 mrna保守序列内部稳定性分析为了进一步比较这三段保守序列成为靶区的可能性，利用oligo分析软件对人和小鼠pd-1 mrna的保守序列的内部稳定性进行分析，具体方法如下：从“file”菜单中，选择“new sequence”选项，输入人或小鼠pd-1 mrna的核苷酸序列；在“internal stability”结果窗口中检索保守序列对应的内部自由能；结果如图3所示：1）保守序列在人和小鼠pd-1 mrna中的内部自由能相似；2）三段保守序列的内部自由能由高到低的顺序依次为：
③
＞
②
＞
①
，这提示这三段保守序中成为aso靶区的可能性依次为：
③
＞
②
＞
①
；步骤五 aso的二级结构预测和分子间/分子内能量分析为了使所设计的asos具有更好的特异性，将其长度定为15 nt，并在三段保守序列上寻找设计靶向性asos的潜在靶点，且潜在靶点的长度也应为15 nt；结果如表1所示：1）在筛选出的三段保守序列中，共存15个长度为15nt的潜在靶点；2）根据这些潜在靶点本实验例设计了15个与之互补的候选靶向性asos序列，并将这些靶点与候选asos按照表1编号，根据三段保守序列设计了15个候选asos，如表1所示；表 为了评价候选asos是否容易形成分子间/分子内的二级结构，利用oligo分析软件对pd-1 mrna候选靶向性aso的二级结构进行预测，具体方法如下：从“edit”菜单中，选择“upper primer”或“lower primer”选项，输入候选aso的序列；从“analyze”菜单中，“duplex formation”或“hairpin formation”选项，对候选asos分子间形成的二聚体结构及分子内部形成的发夹结构进行及分子间/分子内的自由能进行分析；分析结果表2所示：1）在分子间形成的二聚体结构中，1、12、13及14号asos连续配对的碱基个数相对较少，相对不易形成分子间的二聚体结构；2）1~9、14及15号asos形成分子内发夹结构的可能性极低；表2步骤六 aso与靶区mrna结合的能量分析为了评价候选asos与靶区mrna的结合能力，利用sfold在线分析软件（http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/index.pl）中的soligo功能（http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/soligo.pl）对候选asos与其靶区mrna结合的能量进行分析；分析结果如表3所示：1、12、13及14号asos分子间自由能相对较高；1~9、14及15号asos没有预测出分子内自由能；该结果提示1、12、13及14号asos相对不易形成分子间的二聚体结构，1~9、14及15号asos相对不易形成分子内的发夹结构，这与二级结构预测的结果一致；此外，还利用sfold在线分析软件预测了aso与其靶区mrna结合的自由能（binding δg），结果
显示，12、13及14号asos与靶区mrna结合所需要的能量相对较低，提示这3个asos相对容易与靶区mrna结合；表3步骤七 aso的评分为了从设计的15个候选asos中筛选出相对不易形成分子间或分子内二级结构、易与靶区mrna结合且具有良好的特异性的aso，以aso的分子间/分子内自由能及aso与靶区mrna结合的自由能为重要参数，对候选asos进行了评分；图4分为a、b、c和d四个部分，分别记为图4a、图4b、图4c和图4d，具体打分方法如图4a所示：1）筛选出与人和小鼠pd-1 mrna都能结合的asos（图4b）；2）将筛选出的asos按照gc比（接近50%）、分子间自由能（由高到低）、分子内自由能（由高到低）、与靶区mrna结合能量（由低到高）进行排序（结果如图4c所示）；3）按照排序的1~15分别计为15~1分，将gc比得分、分子间自由能得分、分子内自由能得分、与靶区mrna结合能量得分计算总和，作为aso的综合得分（结果如图4d所示），15个候选asos中，12、1、13号asos得分最高，将12、1、13号asos确定为靶向性aso，理论上讲，这三个asos相对不易形成分子间或分子内的二级结构、且相对较易与靶区mrna结合；步骤八 aso的合成本发明中所用的pd-1 mrna靶向性asos均由上海生工生物工程公司合成，并通过高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，hplc）对asos进行了纯化；
为抵抗核酸酶对aso的降解、延长其半衰期，对asos的磷酸骨架进行了全硫代修饰；将asos用无菌pbs溶解，微量多功能酶标仪定量；用鲎试剂对asos的内毒素进行检测，内毒含量《5eu/mg；将溶解后的asos分装，于-20℃冰箱冻存备用。
22.实验例一pd-1mrna靶向性asos对pd-1抑制作用的验证1.1材料与方法1.1.1实验材料1.1.1.1实验试剂本发明所用的所有asos及引物均由上海生工生物工程公司合成，所有的asos均经过全硫代修饰，其中部分在5’末端进行了cy3标记，用无菌pbs溶解asos，分装，置于-20℃保存备用；6~8周龄的雌性icr小鼠，体重约为20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
23.其他试剂：jm109大肠杆菌感受态细胞购自上海生工生物工程公司；edta、sds、triton-x100、depc、吐温20、多聚甲醛、多聚赖氨酸、皂素、乙醇、异丙醇、氢氧化钠、盐酸、硼酸、柠檬酸钠、醋酸钾、氯化铵、氯化钠、氯化钾、氯仿、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、碳酸氢钾、丙烯酰胺、过硫酸铵及尿素等化学药品均购自国药集团化学试剂有限公司和北京化工厂；2
×
easytaqpcrsupermix、2
×
transstart
®
topgreenqpcrsupermix、transscript
®
first-strandcdnasynthesissupermix、dye及dnamarker购自北京全式金公司；fitc标记的抗小鼠cd3抗体、pe标记的抗小鼠pd-1抗体购自美国bd公司；rpim1640干粉及标准胎牛血清fbs购自美国gibco公司；ova蛋白、trizol、rnaseh及megascript
®
kit购自美国thermofisherscientific公司；琼脂糖及溴化乙锭购自美国sigma公司；tris购自北京biotopped公司；isa35乳化剂购自法国seppicchezalbertfreres公司；dapi购自北京索莱宝公司。
24.1.1.1.2实验器材s1000pcr扩增仪购自美国biorad公司；tanon1600凝胶成像仪购自上海天能科技有限公司；sw-cj-1f超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司；cr20g2高速低温离心机购自日本hitachi公司；c6流式细胞仪购自美国bd公司；ix71倒置荧光显微镜购自日本olympus公司；co2细胞培养箱购自日本sanyo公司；wmzk-02恒温水浴箱购自山东潍坊医疗器械厂；hb-2加热板购自美国wealtec公司；实时定量pcr仪购自美国appliedbiosystems公司；mupid-21水平式电泳仪购自日本cosmobio公司；hzq-qx摇床购自哈尔滨东联电子技术有限公司；ultralow-80℃超低温冰箱购自青岛海尔公司；rki-1002恒温培养箱购自日本rika-kogyo有限公司；移液器购自北京兴创实验仪器有限公司；1.5/2ml离心管、移液器头、24孔板购自美国corning公司；1ml注射器购自深圳市卡帕尔科技有限公司；细胞爬片购自北京索莱宝公司。
25.1.1.2实验方法1.1.2.1小鼠外周血/脾/淋巴结的分离小鼠外周血细胞的分离：在超净台内摘取小鼠的眼球，将眼球血放入含有3.8%柠檬酸钠抗血凝剂（抗凝剂与血的体积比为1：9）的10ml离心管中，加入10ml预冷的红细胞裂解液ack（0.155mnh4cl，0.01mkhco3，0.1medta，ph=7.4），混匀，冰上裂解5min，裂解两次，1020rpm，离心5min，弃上清，所得沉淀即为外周血免疫细胞。
26.小鼠脾细胞的分离：通过颈部脱臼的方式处死小鼠，用75%乙醇浸泡小鼠2min，在超净台内将小鼠的四肢用大头针固定于鼠板上，无菌分离小鼠的脾脏，放入冰冷的含有10%fbs的1640培养基中；用毛玻璃片轻柔研磨小鼠脾脏两次，用300目滤网过滤细胞悬液，1020rpm，离心5min；弃上清，加入1ml预冷的ack重悬细胞，冰上裂解2min，加入6ml含10%fbs的1640培养基终止反应，并用300目滤网再次过滤，1020rpm，离心5min，弃上清，所得细胞沉淀即为脾细胞。
27.小鼠脾细胞的分离：通过颈部脱臼的方式处死小鼠，用75%乙醇浸泡小鼠2min，在超净台内将小鼠的四肢用大头针固于鼠板上，无菌分离小鼠的淋巴结，放入冰冷的含有10%fbs的1640培养基中；用毛玻璃片轻柔研磨小鼠淋巴结两次，300目滤网过滤细胞悬液，1020rpm，离心5min，弃上清，所得沉淀即为淋巴结细胞。
28.1.1.2.2免疫荧光检测aso在cd3+t细胞内部的运动情况为了检测asos在cd3+t细胞内部的运动情况，分离雌性na
ï
veicr小鼠的淋巴结细胞，用含有10%fbs的1640培养基将细胞的浓度调整为2
×
106个/ml，接种于24孔板中，1ml/孔；向细胞中加入cy3标记的asos（10μg/ml），在37℃，5%co2孵箱中培养2、6或12h；收集与asos共孵育的细胞，置于1.5ml离心管中，1020rpm，离心5min，弃上清；加入40μl4%多聚甲醛重悬细胞，滴加到多聚赖氨酸处理过的细胞爬片（置于24孔板中）上，室温固定10min；吸弃液体，用500μlpbst（含1
‰
triton-x100的pbs）洗涤三次，每次3min；吸弃液体，加入200μl0.1%triton-x100打孔，4℃，孵育10min；吸弃液体，用500μlpbst洗涤三次，每次3min；吸弃液体，加入200μl1%bsa溶液，室温封闭1h；吸弃液体，在干净的载玻片滴加30μlfitc标记的抗小鼠cd3抗体（1：50稀释），将细胞爬片有细胞的一面覆盖在抗体上，4℃，孵育30min后，将爬片重新放回24孔板中；用500μlpbst洗涤三次，每次3min；吸弃液体，加入200μldapi染液（终浓度2.5μg/ml），室温复染3min；吸弃液体，用500μlpbst洗涤三次，每次3min；吸弃液体，在干净的载玻片上滴一滴50%的甘油，将细胞爬片有细胞的一面覆盖在甘油上，用荧光显微镜观察并照相。
29.1.1.2.3流式细胞术检测肌肉注射的aso在小鼠体内的分布情况为了检测肌肉注射的asos在小鼠体内的分布情况，将9只雌性icr小鼠，随机分为三组，每组3只；阴性对照组小鼠不做任何处理，asos组小鼠右后肢肌肉注射cy3标记的asos（100μl/只，含5μgasos）；于注射后的第6h处死小鼠，获取其双侧腋窝、腹股沟和腘窝淋巴结、脾脏及外周血免疫细胞，具体方法如前所述；将细胞置于1.5ml离心管中，1020rpm，离心5min，弃上清；加入1ml含2%fbs的pbs洗涤细胞两次，1020rpm，离心5min；取1
×
106个细胞用300μlpbs重悬细胞，用300目滤网过滤细胞悬液，用流式细胞仪检测小鼠的双侧腋窝、腹股沟和腘窝淋巴结、脾脏及外周血免疫细胞中cy3+细胞的百分率。
30.1.1.2.4ova免疫的小鼠的脾细胞制备为了获取抗原特异性的免疫细胞，用于后续验证，将ova蛋白与isa35乳化剂按体积比1：1混合，制备成疫苗；用该疫苗以肌肉注射的方式在第0天和第14天免疫雌性icr小鼠，100μl/只，含有5μgova蛋白，于第28天以颈部脱臼的方式处死小鼠，分离小鼠脾脏细胞，该脾脏细胞中含有大量ova特异性的免疫细胞。
31.1.1.2.5流式细胞术检测aso对pd-1表达的影响为了检测asos对pd-1表达的影响，分离ova免疫小鼠的脾细胞，用含有10%fbs的
1640培养基将细胞的浓度调整为5
×
106个/ml，接种于24孔板中，1ml/孔；分别用ova蛋白（10μg/ml）刺激ova蛋白免疫小鼠的脾细胞，同时向细胞中加入asos（10μg/ml），在37℃，5%co2孵箱中培养48h；收集与asos共孵育的细胞，置于1.5ml离心管中，1020rpm，离心5min，弃上清；加入1ml含2%fbs的pbs洗涤细胞两次，1020rpm，离心5min；取1
×
106个细胞用20μlpbs重悬，加入抗cd3抗体及抗pd-1抗体（小鼠：fitc标记的抗cd3抗体及pe标记的pd-1抗体；人：apc标记的抗cd3抗体及pe标记的pd-1抗体），混匀，置于冰上，避光孵育30min；加入1mlpbs洗涤细胞两次，1020rpm，离心5min；用300μlpbs重悬细胞，用300目滤网过滤细胞悬液，用流式细胞仪检测cd3+细胞表面pd-1的表达百分率。
32.1.1.2.6实时定量pcr检测aso在细胞内对pd-1mrna的作用为了检测asos在细胞内对pd-1mrna的作用，将ova蛋白免疫小鼠的脾细胞与ova蛋白共孵育，同时加入asos；提取孵育后细胞的总rna，通过逆转录获取cdna;以cdna为模板，用实时定量聚合酶链式反应（real-timepolymerasechainreaction，rt-pcr）检测asos对pd-1mrna的水平的影响。
33.分离ova免疫小鼠的脾细胞，用含有10%fbs的1640培养基将细胞的浓度调整为5
×
106个/ml，接种于24孔板中，1ml/孔；向细胞中加入asos（10μg/ml），在37℃，5%co2孵箱中培养12、24、36或48h；收集与asos共孵育的细胞，置于1.5ml离心管中，1020rpm，离心5min。
34.提取处理后细胞的总rna，具体方法如下：将细胞用pbs洗涤两次，计数，取1
×
106个细胞，置于1.5ml离心管中，1020rpm，离心5min；弃上清，弹匀细胞，加入1mltrizol，盖紧离心管盖，充分混合2min以上，冰上放置10min；加入200μl氯仿，剧烈震荡混匀30s，冰上放置5min；11000rpm，离心5min，将清澈透明的上层水相约400μl，转移至另一个1.5ml离心管中；加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，冰上放置10min；11000rpm，离心10min；弃上清，加入1ml75%乙醇（用depc水配制）洗涤管壁；11000rpm，离心1min；弃上清，再离心几秒，将管壁液体用加样器完全移净；室温干燥3~5min，直至沉淀变为无色胶样透明状，避免过分干燥；取8μl冰冷depc水溶解rna，为使rna充分溶解，56℃，孵育10min。
35.以总rna为模版，用transscript
®
first-strandcdnasynthesissupermix逆转录试剂盒合成cdna，具体步骤如下：先将8μlrna模板与1μlanchoredoligo(dt)18引物混匀，置于恒温水浴箱中，65℃，孵育5min，冰上放置2min；然后向反应体系中加入2
×
tsreactionmix10μl及transscript
®
rt/rienzymemix1μl，混匀；将反应体系置于恒温水浴箱中，42℃，孵育15min；用加热板，85℃，加热5s；将通过逆转录获得的cdna按照5μl/管分装，冻存在-80℃或直接用于后续反应。
36.以cdna为模板，用引物“pd-1qf和pd-1qr”及“gapdhqf和gapdhqr”（引物具体序列如第二章1.1.2所述）分别对目的基因pd-1及capdh进行扩增，用rt-pcr仪对pd-1的mrna水平进行定量分析，具体的反应体系如表4。
mrna的相互作用，将体外转录获得的pd-1mrna（2.5μl，约100ng）和asos（1μl，约100ng）置于1.5ml离心管，充分混匀，在恒温水浴箱中，37℃，孵育30min；孵育30min后，向反应体系中加入rnaseh10
×
buffer1μl、rnaseh（约2u）1μl及nuclease-free水5.1μl，混匀，在恒温水浴箱中，37℃，继续孵育30min；取5μl反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳，110v，电泳15min，用凝胶成像系统和imagej软件分析电泳结果。
41.1.1.2.9统计学分析用spss21.0软件对数据进行统计学分析，采用t检验对两组数据进行比较，p《0.05表示差异具有统计学意义。
42.1.2实验结果1.2.1pd-1mrna靶向性asos进入靶细胞的动力学分析由于pd-1主要在t细胞上发挥在生物学功能，为了检测靶向pd-1mrna的asos是否能进入t细胞，首先，用具有红色荧光的cy3标记靶向pd-1mrna的asos，这样如果某个细胞可以被检测到红色荧光的cy3+细胞，就说明asos可以进入到该细胞；随后，分离na
ï
veicr小鼠的淋巴结细胞，将细胞与cy3标记的靶向pd-1mrna的asos共同孵育，用fitc标记cd3+t细胞，分别用流式细胞术和免疫荧光显微镜检测在不同时间点cd3+t细胞中cy3+细胞所占的比例和在不同时间点靶向pd-1mrna的asos在cd3+t细胞中的分布情况。
43.为了检测当靶向pd-1mrna的asos在体内应用时的分布状况，将cy3标记的asos以肌肉注射的给药方式注射于na
ï
veicr小鼠的右后肢，100μl/只（含5μgasos）；于注射asos6h后，分离小鼠的外周血、脾脏和注射部位同侧及对侧的淋巴结（腘窝淋巴结、腹股沟淋巴结及腋窝淋巴结）细胞，用流式细胞术检测asos是否能扩散到这些部位，即cy3+细胞占总细胞的比例。
44.结果如图5所示：1）aspd-1、aspd-12及aspd-13能以相似的效率进入体外培养淋巴结细胞中的t细胞，并随着孵育时间的延长，进入t细胞的比例逐渐增加；2）aspd-1、aspd-12及aspd-13在t细胞中的分布情况相似；3）当以肌肉注射的给药方式注射于na
ï
veicr小鼠的右后肢时，aspd-1、aspd-12及aspd-13主要分布在注射部位同侧的腘窝淋巴结；以上结果说明，aspd-1、aspd-12及aspd-13可以进入t细胞，这为asos在体内发挥作用提供了可能。
45.1.2.2pd-1mrna靶向性asos对pd-1表达的影响为了验证aspd-1、aspd-12及aspd-13在进入t细胞后是否可以对pd-1的表达发挥抑制作用，将ova蛋白免疫小鼠的脾细胞与ova蛋白（10μg/ml）共孵育48h，使t细胞活化，诱导pd-1表达，在刺激细胞的过程中加入aspd-1、aspd-12及aspd-13（10μg/ml），检测aspd-1、aspd-12及aspd-13对小鼠t表面pd-1表达水平的影响，实验方法如图6a所示，实验结果如图6b所示：1）ova蛋白免疫的小鼠的脾细胞与ova蛋白共孵育48h可以显著诱导pd-1在cd3+t细胞表面的pd-1表达（p《0.0001）；2）aspd-1可以显著降低小鼠t细胞表面pd-1的表达水平（p=0.029）；3）aspd-12及aspd-13对小鼠t细胞表面pd-1的表达没有显著抑制作用，以上结果提示，aspd-1对小鼠t细胞表面pd-1的表达有显著抑制作用。
46.1.2.3pd-1mrna靶向性asos对pd-1mrna的作用为了验证aspd-1对pd-1表达的抑制作用是否是通过干扰pd-1mrna实现的，首先检测了aspd-1、aspd-12及aspd-13在细胞内对pd-1mrna水平的影响，随后通过体外转录的方法合成了pd-1mrna，并用体外实验验证了aspd-1、aspd-12及aspd-13与pd-1mrna的作
用机制。
47.1.2.3.1pd-1mrna靶向性asos在细胞内对pd-1mrna的作用为了验证靶向性asos在细胞内是否可以干扰pd-1mrna，将ova蛋白免疫小鼠的脾细胞与ova蛋白共孵育24h，同时加入aspd-1、aspd-12及aspd-13（10μg/ml），用实时定量rt-pcr检测aspd-1、aspd-12及aspd-13对pd-1mrna水平的影响；结果如图7所示：1）与细胞共孵育后，aspd-1可以使pd-1mrna的水平几乎降为零（p《0.0001）；2）aspd-13可使pd-1mrna的水平显著降低（p=0.0213）；3）aspd-12对pd-1mrna的水平没有显著影响；由此可见，在三种asos中，aspd-1可以更显著地下调pd-1mrna的水平；以上结果提示，与aspd-12及aspd-13相比，aspd-1在细胞内可以有效诱导pd-1mrna的水平下调。
48.1.2.3.2pd-1mrna靶向性asos与pd-1mrna作用机制的验证靶向mrna的asos主要是通过与靶mrna结合，诱导rnaseh对dna-rna复合物中的mrna进行切割，促使mrna的降解，从而抑制靶蛋白的表达；为了验证aspd-1是否也是通过与pd-1mrna结合，诱导rnaseh对pd-1的mrna进行切割，从而干扰pd-1mrna水平，通过体外转录的方法获取了pd-1mrna，将pd-1mrna（100ng）与aspd-1、aspd-12及aspd-13（1pmol）在37℃共同孵育30min，在孵育体系中加入rnaseh，在37℃继续孵育30min，用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，通过检测rnaseh对pd-1的mrna的切割效率反映asos与pd-1的作用机制。
49.结果如图8所示：与对照组相比，与aspd-1共孵育的pd-1mrna被明显切割，而与aspd-12及aspd-13共孵育的mrna与对照组相比差别不大；以上结果表明，与aspd-12及aspd-13相比，aspd-1可以更好的与pd-1的mrna结合，诱导rnaseh对mrna的切割。
50.实验例一的结果表明，pd-1mrna靶向性asoaspd-1是一种有效的pd-1抑制剂，它可以进入cd3+t细胞，通过与pd-1的mrna结合，诱导rnaseh对靶mrna进行切割降解，进而抑制小鼠或人cd3+t细胞表面pd-1的表达。
51.实验例二pd-1mrna靶向性asos的佐剂效应验证2.1材料与方法2.1.1实验材料2.1.1.1实验试剂本实验例所用的所有asos及引物均由上海生工生物工程公司合成，所有的asos均经过全硫代修饰，其中部分在5’末端进行了cy3标记，用无菌pbs溶解asos，分装，置于-20℃保存备用，6~8周龄的雌性icr小鼠，体重约为20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，fm1病毒及hbsag购自郑州科邦生物科技有限公司。
52.其他试剂：tris、edta、sds、opd、tween-20、多聚甲醛、皂素、醋酸钾、氢氧化钠、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、丙烯酰胺、氯仿、异丙醇、乙醇、甲醇、盐酸、柠檬酸及磷钨酸等化学药品主要购自国药集团化学试剂有限公司和北京化工厂；抗小鼠cd3/cd11c/cd86/pd-1抗体购自美国bd公司；rpim1640干粉、标准胎牛血清购自美国gibco公司；蛋白marker、预染marker、dnamarker购自北京全式金公司；纯化的小鼠igg购自美国invitrogen公司；脱脂奶粉、琼脂糖、溴化乙锭购自美国sigma公司；hrp标记的羊抗小鼠/羊抗兔igg购自美国sigma公司；isa35乳化剂购自法国seppicchezalbertfreres公司；bfa购自上海碧云天生物技术有限公司）。
53.2.1.1.2实验器材s1000pcr扩增仪购自美国biorad公司；mupid-21水平式电泳仪购自日本cosmobio公司；tanon1600凝胶成像仪购自上海天能科技有限公司；lkb垂直电泳仪购自瑞典bromma公司；transblot转膜仪购自美国biorad公司；ketac化学发光成像系统购自美国wealtec公司；co2细胞培养箱购自日本sanyo公司；rki-1002恒温培养箱购自日本rika-kogyo有限公司；wmzk-02恒温水浴箱购自山东潍坊医疗器械厂；hzq-qx摇床购自哈尔滨东联电子技术有限公司；ckx41光学显微镜购自日本olympus公司；h-7650透射电子显微镜购自日本hitachi公司；fb-110x1高压均质机购自上海励途机械设备公司；mulyiscango全波长酶标仪购自美国thermo公司；c6流式细胞仪购自美国bd公司；yxq-ls-100s2高压蒸汽灭菌装置购自上海博迅公司；milli-ro90plus多功能纯水系统购自美国millipore公司；sw-cj-1f超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司；cr20g2高速低温离心机购自日本hitachi公司；-80℃超低温/-20℃/4℃冰箱购自青岛海尔公司；1.5/2ml离心管、移液器头、酶标板、6/24孔板购自美国corning公司）；移液器购自北京兴创实验仪器有限公司；pvdf膜购自美国millipore公司；1ml注射器购自深圳市卡帕尔科技有限公司。
54.2.1.2实验方法2.1.2.1疫苗的配制灭活fm1疫苗：用pbs稀释灭活的fm1和asos，将其浓度分别调整为20μg/ml和200μg/ml，将灭活fm1的稀释液与aso稀释液等体积混合；将混合液与isa35水包油乳化剂按体积比1：1混合，上下颠倒，充分混匀，分装后置于4℃，保存备用。
55.重组hbsag疫苗：用pbs稀释重组hbsag和asos，将其浓度分别调整为200μg/ml和200μg/ml，将重组hbsag的稀释液与aso稀释液等体积混合；将混合液与isa35水包油乳化剂按体积比1：1混合，上下颠倒，充分混匀，分装后置于4℃，保存备用。
56.2.1.2.2实验动物分组及免疫为了检测asos作为灭活病毒疫苗佐剂对抗体产生，将18只雌性icr小鼠随机分为3组，每组6只小鼠，分别为
①
灭活fm1组、
②
灭活fm1加aspd-1组、
③
灭活fm1加aspd-13组；于第0天及第14天免疫icr小鼠，免疫方式为肌肉注射，免疫位置为右后肢，每只小鼠免疫100μl疫苗（灭活fm1：0.5μg/只，asos：5μg/只）；于第14、21及28天采血，分离血清，检测血清中抗fm1igg的水平。
57.为了检测asos作为重组hbsag疫苗佐剂对抗体产生，将18只雌性icr小鼠随机分为3组，每组6只小鼠，分别为
①
重组hbsag组、
②
重组hbsag加aspd-1组及
③
重组hbsag加aspd-13组；于第0天及第14天免疫icr小鼠，免疫方式为肌肉注射，免疫位置为右后肢，每只小鼠免疫100μl疫苗（重组hbsag：5μg/只，asos：5μg/只）；于第14、21及28天采血，分离血清，检测血清中抗hbsagigg的水平。
58.2.1.2.3小鼠尾静脉采血及血清分离将小鼠固定于采血器中，用75%乙醇对小鼠尾部进行消毒后，用手术刀轻轻划破小鼠尾静脉，挤压小鼠尾静脉，用加样器吸取静脉血，置于1.5ml离心管中；将离心管置于恒温培养箱中，37℃，孵育15min后，再置于4℃，孵育30min；11000rpm，离心15min，分离血清，置于新的离心管中，冻存于-80℃备用。
59.2.1.2.4抗体水平的检测
用酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa）检测asos对抗体水平的影响，用抗原稀释液包被酶标板，100
µ
l/孔，含有0.1μg灭活fm1或重组hbsag，置于4℃，过夜包被；用pbst（含0.5
‰
吐温-20的pbs）洗涤酶标板三次后，加入封闭液（含5%脱脂奶粉的pbst），200
µ
l/孔，置于37℃恒温培养箱中，封闭2h；将小鼠血清用pbst稀释（灭活fm1疫苗免疫小鼠血清1：100稀释，重组hbsag免疫小鼠血清1：8000稀释），向酶标板中加入稀释后的血清，100
µ
l/孔，置于恒温培养箱中，37℃，孵育1h；用pbst洗涤酶标板三次后，1：5000稀释的hrp标记的山羊抗小鼠igg，100
µ
l/孔，置于37℃恒温培养箱中，孵育1h；用pbst洗涤酶标板三次后，加入现配的底物液（柠檬酸0.01m，na2hpo40.02m，30%h2o215μl，opd7.5mg，用去离子水定容至10ml），100
µ
l/孔，置于恒温培养箱中，37℃，避光显色30min；显色后加入终止液，50μl/孔，用酶标仪检测a492nm的od值；每个酶标板都包被有用包被液倍比稀释的纯化的小鼠igg作为标准曲线，通过该标准曲线计算抗体浓度。
60.2.1.2.5流式细胞术检测asos在体外对免疫细胞影响分离hbsag免疫小鼠的脾细胞，用含有10%fbs的1640培养基将细胞的浓度调整为5
×
106个/ml，接种于24孔板，1ml/孔；向细胞中加入asos（10μg/ml），不加aso的细胞作为对照，在37℃，5%co2孵箱中培养48h；收集细胞，置于1.5ml离心管中，加入1ml含2%fbs的pbs洗涤细胞两次，1020rpm，离心5min；取1
×
106个细胞，用20μl含2%fbs的pbs重悬细胞，加入荧光标记流式抗体，混匀，置于冰上，避光孵育30min；加入1ml含2%fbs的pbs洗涤细胞两次，1020rpm，离心5min；用300μl含2%fbs的pbs重悬细胞，用300目滤网过滤细胞悬液，用流式细胞术检测asos在体外对免疫细胞影响。
61.为了检测asos在体外对cd3+t细胞增殖的影响，分离hbsag免疫小鼠的脾细胞（具体方法如第二章2.1.2所述），用pbs洗涤两次，1020rpm，离心5min；弃上清，用pbs重悬细胞，加入3μmcfse对细胞进行染色，置于37℃，5%co2孵箱中，避光孵育15min；加入含有10%fbs的1640培基终止染色，置于冰上，避光孵育5min；收集细胞，将细胞用无血清1640培养基洗涤两次，1020rpm，离心5min；弃上清，用含有10%fbs的1640培养基将细胞浓度调整为5
×
106个/ml，接种于24孔板，1ml/孔；向细胞中加入asos（10μg/ml），在37℃，5%co2孵箱中培养72h；收集细胞，加入1ml含2%fbs的pbs洗涤细胞两次，1020rpm，离心5min；取1
×
106个细胞，用20μl含2%fbs的pbs重悬细胞，加入pe标记的抗小鼠cd3抗体，混匀，置于冰上，避光孵育30min；加入1ml含2%fbs的pbs洗涤细胞两次，1020rpm，离心5min；用300μl含2%fbs的pbs重悬细胞，用300目滤网过滤细胞悬液，用流式细胞仪检测cd3+t细胞增殖。
62.2.1.2.6统计学分析用spss21.0软件对数据进行统计学分析，采用t检验对两组数据进行比较，p《0.05表示差异具有统计学意义。
63.2.2实验结果2.2.1pd-1mrna靶向性asos对疫苗免疫小鼠血清抗体水平的影响为了验证aspd-1的疫苗佐剂效应，aspd-1选择了现代商品化疫苗中最常见的两种类型的抗原，灭活病毒抗原和重组亚单位抗原，将asos分别与这两种类型的抗原混合制备疫苗，用疫苗免疫小鼠，检测asos在不同种类的疫苗中对小鼠抗体水平的影响。
64.2.2.1.1aspd-1作为灭活病毒疫苗佐剂对抗体产生水平的影响为了验证aspd-1是否能在灭活病毒疫苗中发挥疫苗佐剂效应，本实验例用灭活的小鼠流感病毒（fm1）与水包油乳化剂isa35（1：1）配伍制备疫苗，将aspd-1（5μg/只）与配制好的疫苗联用在第0天和第14天免疫icr小鼠，用不加asos或加入aspd-13（5μg/只）的疫苗免疫小鼠作为实验对照，于第14、21及28天采血，用elisa检测asos对小鼠血清抗体水平的影响，实验方法如图9a所示；结果如图9b所示：1）与不加aso组相比，在免疫的第14天和第21天，aspd-1能显著提高小鼠的血清抗体水平（p=0.0044或0.0128）；2）aspd-13对小鼠的血清抗体水平没有显著影响；以上结果表明，在灭活病毒疫苗中，aspd-1可以发挥疫苗佐剂效应，而aspd-13则不能。
65.2.2.1.2aspd-1作为重组亚单位疫苗佐剂对抗体产生水平的影响为了检测aspd-1也能否在重组亚单位疫苗中发挥佐剂效应，本实验例用hbsag与乳化剂isa35配伍（1：1）制备疫苗，将aspd-1（5μg/只）与配制好的疫苗联用，在第0天和第14天免疫icr小鼠，用不加asos或加入aspd-13（5μg/只）的疫苗免疫小鼠作为实验对照，于第14、21及28天采血，用elisa检测asos对小鼠血清抗体水平的影响，实验方法如图10a所示；结果如图10b所示：1）与不加aso组相比，在免疫的第21天和第28天，aspd-1能显著提高小鼠的血清抗体水平（p=0.03或0.0461）；2）aspd-13对小鼠的血清抗体水平没有显著影响；以上结果表明，在重组亚单位疫苗中，aspd-1可以发挥疫苗佐剂效应，而aspd-13的佐剂效应不明显。
66.2.2.2aspd-1发挥佐剂效应的机制验证为了进一步对aspd-1发挥佐剂效应的机制进行验证，利用hbsag刺激hbsag蛋白免疫小鼠的脾细胞的体外实验体系诱导t细胞活化，在刺激过程中加入asos，进一步检测asos对cd11c+细胞表面cd86的表达、cd3+t细胞的增殖活化能力及cd3+t细胞表面pd-1表达的影响。
67.2.2.2.1aspd-1在体外对cd3+t细胞表面pd-1表达的影响为了进一步检测aspd-1是否能抑制cd3+t细胞表面pd-1的表达，用hbsag蛋白（10μg/ml）刺激hbsag蛋白免疫的小鼠脾细胞48h，同时加入aspd-1或aspd-13（10μg/ml），用流式细胞术检测asos对cd3+t细胞pd-1表达的影响；结果如图11所示，与hbsag单独刺激组相比（2.13%），aspd-1能显著抑制cd3+t细胞表面pd-1的表达（1.51%），aspd-13对cd3+t细胞表面pd-1的表达（2.7%）没有明显影响。
68.2.2.2.2aspd-1在体外对cd3+t细胞活化能力的影响为了进一步检测aspd-1是否能通过抑制pd-1的表达而促进cd3+t细胞的活化能力，用hbsag蛋白（10μg/ml）刺激hbsag蛋白免疫的小鼠脾细胞48h，同时加入aspd-1或aspd-13（10μg/ml），用流式细胞术检测asos对cd3+t细胞cd69表达的影响；结果如图12所示，与hbsag单独刺激组相比（3.8%），aspd-1能显著上调cd3+cd69+t细胞的比例（6.02%），aspd-13对cd3+cd69+t细胞的比例（4.73%）没有明显影响；以上结果表明aspd-1能显著增强cd3+t细胞的活化能力。
69.2.2.2.3aspd-1在体外对cd3+t细胞增殖能力的影响为了进一步检测aspd-1是否能通过抑制pd-1的表达而促进cd3+t细胞的增殖能力，用hbsag蛋白（10μg/ml）刺激cfse标记的hbsag蛋白免疫的小鼠脾细胞72h，同时加入
aspd-1或aspd-13（10μg/ml），用流式细胞术检测asos对cd3+t细胞的增殖能力的影响；结果如图13所示，与hbsag单独刺激组相比（3.13%），aspd-1能显著上调cd3+t细胞的增殖能力（11.9%），aspd-13对cd3+t细胞的增殖能力（4.54%）没有明显影响。
70.2.2.2.4aspd-1在体外对cd11c+细胞表面cd86的影响为了进一步检测aspd-1是否能通过抑制pd-1的表达而促进促进cd11c+细胞表面cd86的维持，用hbsag蛋白（10μg/ml）刺激hbsag蛋白免疫的小鼠脾细胞48h，同时加入aspd-1或aspd-13（10μg/ml），用流式细胞术检测asos对cd11c+细胞表面cd86表达的影响；结果如图14所示，与hbsag单独刺激组相比（8.2%），aspd-1能显著上调cd11c+细胞表面cd86的表达（10.38%），aspd-13对cd11c+细胞表面cd86的表达（8.52%）没有明显影响；以上结果表明aspd-1能显著促进cd11c+细胞表面cd86的维持。
71.实验例二的结果表明，pd-1mrna靶向性asoaspd-1可以在灭活病毒疫苗和重组亚单位疫苗中发挥佐剂效应；其发挥佐剂效应的机制是通过抑制pd-1介导的抑制性信号，促进cd3+t细胞的增殖活化，进而促进dcs表面cd86的维持，并最终促进抗体的产生。
72.需要说明的是，本发明中图4a是指图4中a部分，图4b是指图4中b部分，图4c....图10b是表示图10中的b部分。
73.以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。