技术特征：
1.一种靶向pd-1 mrna反义脱氧寡核苷酸的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、人和小鼠pd-1 mrna序列信息的获取，在美国国立生物技术信息中心nucleotide数据库中，以“pd-1”为检索词，检索人和小鼠pd-1 mrna的序列信息；步骤二、人和小鼠pd-1 mrna保守序列的筛选，利用dnastar lasergene序列分析软件中的子软件“megalign”对人和小鼠pd-1 mrna的序列进行比对，以筛选二者的保守序列；步骤三、人和小鼠pd-1 mrna保守序列的二级结构预测，利用sfold在线分析软件中的srna功能对人和小鼠pd-1 mrna的二级结构进行预测，检测保守序列中未配对的碱基数，以判断这三段保守序列成为aso设计靶区的可能性；步骤四、人和小鼠pd-1 mrna保守序列内部稳定性分析，利用oligo分析软件对人和小鼠pd-1 mrna的保守序列的内部稳定性进行分析；步骤五、aso的二级结构预测和分子间/分子内能量分析，利用oligo分析软件对pd-1 mrna候选靶向性aso的二级结构进行预测；步骤六、aso与靶区mrna结合的能量分析，利用sfold在线分析软件中的soligo功能对候选asos与其靶区mrna结合的能量进行分析；步骤七、aso的评分，以aso的分子间/分子内自由能及aso与靶区mrna结合的自由能为重要参数，对候选asos进行了评分；步骤八、aso的合成。2.根据权利要求1所述的一种靶向pd-1 mrna反义脱氧寡核苷酸的筛选方法，其特征在于，步骤二中，人和小鼠pd-1 mrna保守序列的筛选方法，如下：从“file”菜单中，选择“enter sequences”选项，输入人和小鼠pd-1 mrna的核苷酸序列；同时选中人和小鼠pd-1 mrna的核苷酸序列，从“align”菜单中的“one pair”选择“wilbur-lipman”配对比较方法对这两个序列进行对比分析；从显示比较结果的窗口，找出匹配的序列即为人和小鼠pd-1 mrna的保守序列。3.根据权利要求1所述的一种靶向pd-1 mrna反义脱氧寡核苷酸的筛选方法，其特征在于，步骤四中，人和小鼠pd-1 mrna保守序列内部稳定性分析方法，如下：从“file”菜单中，选择“new sequence”选项，输入人或小鼠pd-1 mrna的核苷酸序列；在“internal stability”结果窗口中检索保守序列对应的内部自由能。4.根据权利要求1所述的一种靶向pd-1 mrna反义脱氧寡核苷酸的筛选方法，其特征在于，步骤五中，aso的二级结构预测和分子间/分子内能量分析方法，如下：从“edit”菜单中，选择“upper primer”或“lower primer”选项，输入候选aso的序列；从“analyze”菜单中，“duplex formation”或“hairpin formation”选项，对候选asos分子间形成的二聚体结构及分子内部形成的发夹结构进行及分子间/分子内的自由能进行分析。5.根据权利要求1所述的一种靶向pd-1 mrna反义脱氧寡核苷酸的筛选方法，其特征在于，步骤七中，对候选asos的评分方法，如下：（1）将1~15号asos按照分子间自由能由高到低排序、分子内自由能由高到低排序、靶区mrna结合能量由低到高排序；（2）按照排序的1~15分别计为15~1分，将分子间自由能得分、分子内自由能得分、与靶区mrna结合能量得分计算总和，作为aso的综合得分；（3）按照综合得分将asos进行排序；
（4）筛选出得分最高的三个asos作为最终的pd-1 mrna靶向性aso。6.根据权利要求1所述的一种靶向pd-1 mrna反义脱氧寡核苷酸的筛选方法，其特征在于，步骤八中，aso的合成方法，如下：（1）通过高效液相色谱法对asos进行了纯化；（2）对asos的磷酸骨架进行了全硫代修饰；（3）将asos用无菌pbs溶解，微量多功能酶标仪定量；（4）用鲎试剂对asos的内毒素进行检测，内毒含量<5 eu/mg；（5）将溶解后的asos分装，于-20 ℃冰箱冻存备用。7.根据权利要求1-6任一所述的一种靶向pd-1 mrna反义脱氧寡核苷酸的应用，其特征在于，在疫苗中发挥佐剂效应。8.根据权利要求7所述的一种靶向pd-1 mrna反义脱氧寡核苷酸的应用，其特征在于，在灭活病毒疫苗或重组亚单位疫苗中发挥佐剂效应。
技术总结
本发明公开了一种靶向PD-1 mRNA反义脱氧寡核苷酸的筛选方法及应用，包括以下步骤：人和小鼠PD-1 mRNA序列信息的获取；人和小鼠PD-1 mRNA保守序列的筛选；人和小鼠PD-1 mRNA保守序列的二级结构预测；人和小鼠PD-1 mRNA保守序列内部稳定性分析；ASO的二级结构预测和分子间/分子内能量分析；ASO与靶区mRNA结合的能量分析；ASO的评分；步骤八、ASO的合成。本发明通过网络数据库和生物信息软件，以人和小鼠PD-1 mRNA的保守序列为靶点，设计了一系列靶向PD-1 mRNA的候选ASOs，并通过生物信息软件对其进行分析，初步筛选出形成分子间或分子内二级结构所需的自由能较高、与靶区mRNA结合所需的自由能较低、且不易非特异性地结合其他与PD-1无关的mRNA的ASOs，在灭活病毒疫苗或重组亚单位疫苗中发挥佐剂效应。亚单位疫苗中发挥佐剂效应。亚单位疫苗中发挥佐剂效应。
技术研发人员：李鑫 王俊鹏 刘康栋 赵琪璐 魏慧颖 李若颍 谢祎飞
受保护的技术使用者：郑州大学
技术研发日：2022.01.14
技术公布日：2022/5/10