1-N-甲基-2-硝基-5-羟甲基咪唑制备工艺的制作方法

本发明涉及埃夫索胺合成中间体制备，特别涉及一种1-n-甲基-2-硝基-5-羟甲基咪唑的制备工艺。

背景技术：

1、th-302(evofosfamide，埃夫索胺，cas号918633-87-1)是一种2-硝基咪唑引发的乏氧激活前药(hap)溴代异磷酰胺。在乏氧情况下，无活性th-302前药可释放高毒性的br-ipm。th-302具有广谱的体内外生物活性以及特异的乏氧选择性激活活性以及诱导h2ax磷酸化、dna交联活性，从而导致细胞周期停滞，因而该化合物被多家制药公司以及科研院所进行抗癌药物的开发。

2、meng f(孟繁英)等人发表的研究文章指出：th-302对于各种肿瘤具有广谱活性，并且具有优异的缺氧选择性的活性增强效应。研究表明，缺氧条件下32个人癌细胞系中th-302的体外细胞毒性均明显强于常氧条件下的，显示该化合物对于缺氧环境下的癌细胞具有选择性的细胞毒性。使用单电子还原酶(por)过表达的人源细胞证实了th-302在乏氧条件下单电子还原酶依赖性的活性增强原理，如下反应式1：

3、

4、细胞色素p450氧化还原酶将th-302前药进行还原，得到中间体自由基负离子，然后自由基负离子不稳定而被分解为具有细胞毒性的细胞毒素br-ipm，细胞毒素br-ipm通过与dna链交联发挥药效：主要通过在dna上鸟嘌呤结构中7位发生烷剂化，与dna交联，使dna失活，从而不能正常复制，达到抑制(癌)细胞增殖的作用。

5、进一步的体内动物模型实验显示th-302可有效降低多种肿瘤中的缺氧区域(sun,j.d.,liu,q.,wang,j.,ahluwalia,d.,ferraro,d.,wang,y.,duan,j.x.,ammons,w.s.,curd,j.g.,matteucci,m.d.,&hart,c.p.(2012).selective tumor hypoxia targetingby hypoxia-activated prodrug th-302inhibits tumor growth in preclinicalmodels of cancer.clinical cancer research:an official journal of the americanassociation for cancer research,18(3),758–770.https://doi.org/10.1158/1078-0432.ccr-11-1980)，并导致免疫疗效增高(jayaprakash,p.,ai,m.,liu,a.,budhani,p.,bartkowiak,t.,sheng,j.,ager,c.,nicholas,c.,jaiswal,a.r.,sun,y.,shah,k.,balasubramanyam,s.,li,n.,wang,g.,ning,j.,zal,a.,zal,t.,&curran,m.a.(2018).targeted hypoxia reduction restores t cell infiltration and sensitizesprostate cancer to immunotherapy.the journal of clinical investigation,128(11),5137–5149.https://doi.org/10.1172/jci96268)。

6、以上发现显示th-302依然具有作为抗癌药物开发的潜力，因而开发高效的合成制备th-302的工艺依然是需要的。

7、th-302最早的合成方法由段建新(j-x·段)等在threshold公司的专利申请文件中公开，即pct/us2006/025881，wo2007/002931，对应中国专利申请公开号cn101501054a，其在实施例22至实施例26记载了以下的关键中间体1-n-甲基-2-硝基-5-羟甲基合成路线和制备方法(以下简称threshold方法)，具体如下：

8、

9、threshold方法的中间体合成路线1

10、

11、threshold方法的中间体合成路线2

12、在1-n-甲基-2-胺基咪唑-5-羧酸乙酯基础上通过重氮化反应将胺基转化为硝基：

13、

14、并经碱水解将乙酸酯水解为羧酸：

15、

16、羧酸还原为醇羟基最终得到1-n-甲基-2-硝基-5-羟甲基：

17、

18、在上述制备工艺中羧酸还原为醇羟基最终得到1-n-甲基-2-硝基-5-羟甲基的操作过程为：

19、搅拌硝基酸(30.82g，180.23mmol)和三乙胺(140ml，285mmol)在无水thf(360ml)中的混合物，同时在干冰-乙腈浴(温度＜-20℃)中冷却该反应混合物。在10分钟的期间，将氯甲酸异丁酯(37.8ml，288mmol)逐滴加入该冷却的反应混合物中，并且搅拌1小时，然后加入氢硼化钠(36g，947mmol)和在1小时期间逐滴加入水，同时保持温度在大约0℃或以下。将反应混合物升温至0℃。过滤掉固体并且用thf洗涤。蒸发组合的thf部分，产生为橙色固体(25g)的1-n-甲基-2-硝基咪唑-5-甲醇，将它们从乙酸乙酯重结晶。

20、该方法使用的氯甲酸异丁酯，常温下是液体，具有强刺激性和腐蚀性，大规模工业生产时不利于储存、运输；更严重的是，该化合物属剧毒化学试剂，在实际操作过程中，对设备要求较高，对操作人员身体危害性大。这些因素都制约着工业生产中使用氯甲酸异丁酯作为反应试剂，因此有必要筛选其他温和的、无毒或低毒的试剂来替代氯甲酸异丁酯。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种新的1-n-甲基-2-硝基-5-羟甲基咪唑的制备工艺。

2、本发明具体采用了以下技术方案：

3、本发明的一方面提供了以下的1-n-甲基-2-硝基-5-羟甲基咪唑a7制备工艺：

4、包括使用n,n’-羰基二咪唑与1-n-甲基-2-胺基咪唑-5-羧酸a6在45～65℃反应一段时间，再降温至15～25℃反应一段时间至反应完全，然后再与还原试剂硼氢化钠或硼氢化钾反应，最终生成1-n-甲基-2-硝基-5-羟甲基咪唑a7。

5、本发明的制备工艺，其反应公式如下：

6、

7、需要说明的是，本发明经过对比研究，使用不同的活化剂活化后与还原试剂硼氢化钠或硼氢化钾反应，最终筛选和优化得出使用n,n’-羰基二咪唑(cdi)与1-n-甲基-2-胺基咪唑-5-羧酸a6在45～65℃反应一段时间，再降温至15～25℃反应一段时间至反应完全，然后再与还原试剂硼氢化钠或硼氢化钾反应，这样操作即能完成羧酸的活化，而且不使用剧毒、刺激性的氯甲酸异丁酯，而且反应速度快，整个反应过程不超过2小时，副产物少，适合工业大规模生产使用。

8、本发明的一种实现方式中，1-n-甲基-2-硝基-5-羟甲基咪唑a7的制备工艺，具体包括以下步骤：

9、步骤一，在1-甲基-2-硝基-5-羧酸咪唑a6溶液中加入n,n’-羰基二咪唑升温至45～65℃反应一段时间，再降温至15～25℃反应一段时间至反应完全，得到a液；

10、步骤二，在0～5℃下，将硼氢化钠或硼氢化钾的水溶液缓慢滴加上述a液中，控制滴加速度，使反应液温度不超过5℃，滴毕，升温至15～25℃反应至反应完全，加入酸调节ph值至中性或弱酸性，于40～45℃减压浓缩去除有机溶剂，剩余物加入萃取剂萃取，收集有机相，有机相加入干燥剂脱水后，过滤，收集滤液，于40～45℃减压浓缩至无滴出，获得产物a7。

11、在改进后的方案中，关键在于两次不同温度下反应活化，因此步骤一中的两个反应温度45～65℃和15～25℃是反应控制的关键。

12、步骤二，在添加硼氢化钠或硼氢化钾的水溶液时会放热，应控制温度在5℃以下，当然过低的温度会使得反应时间延长，考虑到供应生产中的制冷条件，使用冰盐浴或其他制冷剂比较安全、环保，温度控制在0～5℃既能使得反应进行完全，同时又能加快反应速度，适合工业生产。

13、添加完硼氢化钠或硼氢化钾后，应升温以加快反应速度，建议的反应温度为15～25℃。在该范围的温度，反应时间比较适合，而且反应进行比较充分、完全。

14、反应完全后，加入酸中和未反应完的硼氢化钠或硼氢化钾至中性或弱酸性。

15、反应完全后并添加酸中和后的反应液，将该反应液在40～45℃减压浓缩除去有机溶剂，即减压浓缩直至无滴出，剩余物加入萃取剂进行萃取。

16、由于产物a7是硝基咪唑醇结构，且是在水溶液中，因此建议的萃取剂应是乙酸乙酯、乙酸甲酯、二氯甲烷等。

17、步骤一中1-甲基-2-硝基-5-羧酸咪唑溶液采用的溶剂为四氢呋喃或二氧六环，并且，1g质量的1-甲基-2-硝基-5-羧酸咪唑a6溶质对应10-30ml的溶剂。

18、需要说明的是，本发明步骤一中采用溶剂将1-甲基-2-硝基-5-羧酸咪唑溶解制成溶液，主要是为了便于和活化剂n,n’-羰基二咪唑反应，使用的溶剂应该是不含有碳氧双键基团的溶剂，且能溶解1-甲基-2-硝基-5-羧酸咪唑，这样能选择的溶剂包括四氢呋喃或二氧六环或其他醚类溶剂、二氯甲烷。

19、有机相加入干燥剂脱水，选用的干燥剂为能形成水合物的无机盐，比如无水硫酸钠、无水硫酸钙、无水氯化钙或无水硫酸镁等。

20、优选的，步骤一中1-甲基-2-硝基-5-羧酸咪唑a6与n,n’-羰基二咪唑的投料质量比为1:1.10-1.30。

21、优选的，步骤一中于45～65℃反应的时间为20-40分钟，于15～25℃反应的时间为20-40分钟。例如，更优选的，于45～50℃反应的时间为20-40分钟，于20～25℃反应的时间为20-40分钟。

22、优选的，步骤二中加入硼氢化钠或硼氢化钾的量与1-甲基-2-硝基-5-羧酸咪唑a6的量的物质的量的比例为3.0-4.0:1，优选为3.5-4.0:1。

23、优选的，步骤二中硼氢化钠或硼氢化钾的水溶液中硼氢化钠或硼氢化钾的含量为0.05-0.50g/ml，优选为0.05-0.15g/ml。

24、优选的，步骤二中调节ph值至中性或弱酸性的酸选自甲酸、乙酸和盐酸中的至少一种。

25、需要说明的是，加入酸调节ph值，其本质是加入酸中和多余的硼氢化钠或硼氢化钾；因此，理论上，只要调节ph值至中性，即可恰好完全中和多余的硼氢化钠或硼氢化钾；但是，实际上，为了确保硼氢化钠或硼氢化钾能够被完全中和，需要加入比理论添加量多的酸；因此，更有效的做法是，调节ph值至弱酸性，例如调节ph值至5-6。

26、还需要说明的是，由于在步骤二加入酸中和多余的硼氢化钠或硼氢化钾过程中，一般会多添加酸，即调节ph值至弱酸性；为了后续更方便的去除多添加的酸，优选采用具有一定挥发性的酸，例如甲酸、乙酸、盐酸等，能够在一定的真空减压、加热等条件下挥发除去。本技术的一种实现方式中，优选采用乙酸。

27、优选的，步骤二中调节ph值至5-6。

28、优选的，步骤二中萃取剂选自乙酸乙酯、乙酸甲酯和二氯甲烷中的至少一种。更优选的，萃取剂采用乙酸乙酯。

29、本发明的一种实现方式中，本发明的制备工艺还包括步骤三，对40～45℃减压浓缩至无滴出获得的产物1-n-甲基-2-硝基-5-羟甲基咪唑进行精制提纯；其中，精制提纯包括，将减压浓缩的产物分散到乙醇中，过滤，采用乙酸乙酯对滤饼进行洗涤，获得纯化的1-n-甲基-2-硝基-5-羟甲基咪唑。

30、需要说明的是，本发明的步骤三主要是针对大规模放大生产，例如千克级别的生产，需要对产物进行进一步的精制提纯。可以理解，在千克级别的大规模生产中，由于反应不彻底或者其他原因，容易导致40～45℃减压浓缩的产物纯度较低；因此，需要进一步的进行精制提纯。但是，对于较小规模的生产，例如百克及以下级别的生产，直接40～45℃减压浓缩的产物就能够达到99％以上的纯度；因此，不需要或不必进行进一步的精制提纯；当然，如果对纯度有特别要求，对百克及以下级别的生产也可以进行精制提纯，在此不作具体限定。

31、本发明的另一面还提供了1-n-甲基-2-硝基-5-羟甲基咪唑a7的hplc纯度检测方法，包括使用反相c18柱作为分离色谱柱，检测波长为320nm，流动相a为0.1％磷酸溶液，流动相b为乙腈，梯度洗脱程序包含流动相a从95％体积比到10％体积比，并在10％体积比等梯度洗脱一段时间；

32、1-n-甲基-2-硝基-5-羟甲基咪唑a7在流动相a体积比为75％-90％范围内出峰，

33、根据1-n-甲基-2-硝基-5-羟甲基咪唑a7的峰面积使用面积归一法计算1-n-甲基-2-硝基-5-羟甲基咪唑a7的百分比纯度。

34、优选的，使用色谱柱为zorbax eclipse plus c18柱，规格为150*4.6mm，流动相流速为1.0ml/min，

35、洗脱程序如下

36、

37、

38、1-n-甲基-2-硝基-5-羟甲基咪唑a7在3-6分钟内出峰。

39、本发明的有益效果在于：

40、本发明提出了使用工业大生产场合相对安全的试剂n,n’-羰基二咪唑制备th-302关键中间体1-n-甲基-2-硝基-5-羟甲基咪唑，其主要改进点在于使用相对安全的n,n’-羰基二咪唑代替剧毒、强刺激性、强腐蚀性、环境操作要求高的氯甲酸异丁酯。

41、本发明的制备工艺，将氯甲酸异丁酯换成n,n’-羰基二咪唑(cdi)后具有以下优点：

42、cdi是固体，没有刺激性和腐蚀性，利于储存、运输和环保，对设备要求不高，对操作人员身体伤害性不大；

43、反应操作简单，后处理简单；反应温度比使用氯甲酸异丁酯的反应温度高，从而加快了反应速度，节省了反应工时，节省了能耗；

44、收率高，副反应少，产品易于纯化：反应完毕，萃取、干燥，减压浓缩至无滴出，就可以得到纯度较高的产品。