一种天然黄酮类化合物衍生物药物及其制备方法和应用

1.本发明涉及新药开发、3d打印生物墨水及生物材料开发技术领域，尤其是涉及一种天然黄酮类化合物衍生物药物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.天然化学小分子主要是由植物和微生物产生的化学物质，具有广泛的生物活性和立体化学性质，是一种很有前途的医学资源。3d生物打印技术是一种新兴增材制造技术，加速了健康科学相关领域的发展，如组织工程、再生医学和药物发现与开发。但由于3d生物打印的保真度在打印过程中受到散射光的显著影响，需要开发特定的生物墨水吸收生物打印过程中的散射光，从而提高打印产品的保真度。天然黄酮类化合物含有至少一个共轭大π键和不同数量的共轭双键，在一定的波长范围内吸收光。因此天然黄酮类小分子及其衍生物有望在3d生物打印过程中吸收散射光，提高打印产品的形状保真度。另一方面，天然黄酮类化合物具有相应的抗氧化、抗炎和抗凋亡特性，现已被用于治疗动脉粥样硬化、骨质疏松、风湿性疾病和临床前神经退行性疾病。但天然黄酮类化合物的吸收能力差、生物利用度低，限制了其在生物医学等领域的应用。为此，我们开发了一种天然黄酮类化合物衍生物药物，以提高3d生物打印保真度及其组织工程等医学应用。
3.与口服天然黄酮类化合物药片相比，天然黄酮类小分子衍生物不仅可以提高3d生物打印产品的形状保真度，还可以通过3d生物打印将天然黄酮类化合物的生物活性直接传递至相邻细胞，使天然黄酮类化合物被细胞有效利用。


技术实现要素：

4.本发明设计了一种天然黄酮类化合物衍生物药物及其制备方法和应用，其解决的技术问题是3d生物打印的保真度在打印过程中受到散射光的显著影响，需要开发特定的生物墨水吸收生物打印过程中的散射光，从而提高打印产品的保真度。
5.为了解决上述存在的技术问题，本发明采用了以下方案：一种天然黄酮类化合物衍生物药物的制备方法，包括以下步骤：步骤1、将柚皮苷粉末溶解于75-100℃的磷酸盐缓冲溶液pbs，ph7.0-8.0中获得柚皮苷溶液；步骤2、将甲基丙烯酸酐ma分散在磷酸盐缓冲溶液pbs中获得体积比为5-10%的ma乳浊液；步骤3、将步骤2中的ma乳浊液逐滴加入步骤1中的柚皮苷溶液，用氢氧化钠溶液调节ph8.0-9.0，75-100℃条件下避光磁力搅拌反应6-12小时；步骤4、通过向步骤3中反应液加入盐酸溶液达到ph7.0以终止反应；步骤5、透析步骤4中反应混合液，冷冻干燥处理，获得柚皮苷衍生物narma。
6.优选地，步骤3中柚皮苷溶液的质量分数为0.5-2%w.t.。
7.优选地，步骤3中ma的摩尔分数大于等于柚皮苷的摩尔分数。
8.一种天然黄酮类化合物衍生物药物，其特征在于：包括上述的柚皮苷衍生物narma。
9.一种基于柚皮苷衍生物narma的高保真3d打印水凝胶制备方法，包括以下步骤：步骤1、将权利要求1或2中所述的柚皮苷衍生物narma与甲基丙烯酰化明胶gelma或类似具有光聚合能力的聚合物大分子溶解在0.1%w.t.-1%w.t.的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂lap的水溶液或磷酸盐缓冲溶液pbs，得到的混合液中narma的最终浓度为0.01%w.t.-4.0%w.t.，gelma或类似具有光聚合能力的聚合物大分子的最终浓度为8%w.t.-30%w.t.；步骤2、将步骤1中混合液加入基于405nm波长光辅助打印的3d打印设备料槽，按预设数字模型和程序打印，光照时长为6-20s/100μm，光照强度为20-300mw/cm2，即得基于narma的高保真3d打印水凝胶。
10.优选地，步骤1中甲基丙烯酰化明胶gelma的合成步骤如下：将明胶gel粉末溶解于55-65℃的pbs中获得5-10%w.t.的gel溶液，所述gel的数均分子量为50000-100000；将体积比为2-10%的权利要求1中制得的ma乳浊液逐滴加入磁力搅拌着的gel溶液中，55-65℃条件下避光反应2-6小时，在反应过程中使用氢氧化钠溶液调节反应溶液ph8.0-9.0；通过向反应液中加入盐酸溶液达到ph7.0以终止反应；透析反应混合液，冷冻干燥处理，获得改性明胶gelma。
11.一种高保真3d打印水凝胶，其特征在于：使用上述的制备方法制得。
12.一种基于narma的组织修复用生物制造水凝胶的制备方法，包括以下步骤：步骤1、将权利要求1或2中所述的柚皮苷衍生物narma与甲基丙烯酰化明胶gelma或类似具有光聚合能力的聚合物大分子溶解在0.1%w.t.-1%w.t.的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂lap的水溶液或磷酸盐缓冲溶液pbs，得到的混合液中narma的最终浓度为0.01%w.t.-4.0%w.t.，gelma或类似具有光聚合能力的聚合物大分子的最终浓度为8%w.t.-30%w.t.；步骤2、向步骤1中pbs基混合液中加入104/ml-107/ml活细胞，在405nm波长下照0.5-5min，照射光强为20-500mw/cm2，即得基于narma的组织修复用生物制造水凝胶。
13.优选地，步骤1中甲基丙烯酰化明胶gelma的合成步骤如下：将明胶gel粉末溶解于55-65℃的pbs中获得5-10%w.t.的gel溶液，所述gel的数均分子量为50000-100000；将体积比为2-10%的权利要求1中制得的ma乳浊液逐滴加入磁力搅拌着的gel溶液中，55-65℃条件下避光反应2-6小时，在反应过程中使用氢氧化钠溶液调节反应溶液ph8.0-9.0；通过向反应液中加入盐酸溶液达到ph7.0以终止反应；透析反应混合液，冷冻干燥处理，获得改性明胶gelma。
14.一种基于narma的组织修复用生物制造水凝胶上述的制备方法制得。
15.该天然黄酮类化合物衍生物药物及其制备方法和应用具有以下有益效果：（1）本发明基于黄酮糖苷类化合物开发了一种新型药物，提高了黄酮类化合物柚皮苷的生物利用度，不仅可以解决3d生物打印的低保真度问题，还可以促进组织再生。
16.（2）本发明基于narma的生物制造水凝胶生物相容性好、生物活性高。
17.（3）本发明基于narma的生物墨水实现了高保真3d打印，有望用于个性化定制组织缺损修复。
18.（4）本发明药物使用时，分布均匀，药物含量可控度高；避免了因频繁口服送药所带来的不便；可以直接将药物递送至细胞周围，发挥药效；避免了大剂量服用带来的不可避免的毒性；（5）本发明采用的工艺简单，有利于规模化生产。
附图说明
19.图1是本发明实施例1中制备的改性柚皮苷粉末的红外光谱图。
20.图2是本发明实施例1中制备的改性柚皮苷粉末的核磁氢谱图。
21.图3是本发明实施例1中制备的改性柚皮苷粉末的紫外-可见光光谱图。
22.图4是本发明实施例2中制备的3d打印改性柚皮苷基水凝胶的宏观示意图。
23.图5是本发明实施例3中制备的改性柚皮苷基水凝胶原位封装兔关节软骨细胞培养五天后的活细胞荧光染色图。
24.图6是本发明改性柚皮苷基水凝胶原位封装兔关节软骨细胞培养四周后的番红o染色图。
具体实施方式
25.下面结合图1至图6，对本发明做进一步说明：柚皮苷是一种黄酮糖苷类化合物，具有可反应的羟基，可通过酯化反应引入碳碳双键，因此改变了分子结构特点，调节了化合物的光吸收范围和程度；在使用过程中，与gelma或类似具有光聚合能力的聚合物大分子混合，在蓝光照射下，引发剂lap与碳碳双键作用产生自由基，将narma与gelma或类似具有光聚合能力的聚合物大分子交联形成水凝胶。
26.实施例1：本发明制备柚皮苷衍生物narma包括以下步骤：步骤1、将1g柚皮苷粉末溶解于75℃的100ml pbs中获得1%w.t.柚皮苷溶液。
27.步骤2、将1ml ma分散在20ml pbs中获得ma乳浊液。
28.步骤3、将步骤2中的ma乳浊液逐滴加入步骤1中的柚皮苷溶液，用氢氧化钠溶液调节ph8.0-9.0，75℃条件下避光磁力搅拌反应8小时。
29.步骤4、通过向步骤3中反应液加入盐酸溶液达到ph7.0以终止反应。
30.步骤5、透析步骤4中反应混合液，冷冻干燥处理，获得柚皮苷衍生物narma，避光低温保存。
31.本实施例1制备的改性柚皮苷的红外光谱图如图1所示。核磁氢谱图如图2所示。紫外-可见光光谱图如图3所示，证明柚皮苷改性成功。
32.实施例2：本发明基于narma的药物墨水的3d打印水凝胶的制备，包括以下步骤：步骤1、将narma与gelma溶解在0.5%w.t.的lap溶液，得到的混合液中narma的最终浓度为1%w.t.，gelma的最终浓度为10%w.t.。
33.步骤2、将步骤1混合液加入405nm波长光辅助打印的3d打印设备料槽，按预设数字模型和程序打印，光照时长为8s/100μm，光照强度为20mw/cm2，即得本发明基于narma的高保真3d打印水凝胶。
34.本实施例制备的3d打印水凝胶的宏观示意图如图4所示。
35.实施例3：本发明基于narma的组织修复用生物制造水凝胶制备方法：步骤1、将narma与gelma溶解在0.5%w.t.的lap/pbs溶液，得到的混合液中narma的
最终浓度为1%w.t.，gelma的最终浓度为10%w.t.。
36.步骤2、向步骤1混合液中加入107/ml活关节软骨细胞，混合均匀后转入聚四氟乙烯模具中（φ10mm
×
2mm），在405nm波长下照0.5min，照射光强为300mw/cm2，即得本发明基于narma的组织修复用生物制造水凝胶。
37.步骤3、采用二乙酸荧光素对水凝胶中活细胞进行染色，观察软骨细胞在该水凝胶中第五天的生长状态，如图5所示。结果显示软骨细胞均匀分布在水凝胶三维结构中，呈圆球状且部分聚集成团生长，维持了软骨细胞在体内关节软骨中的生长状态。
38.步骤4、将细胞/水凝胶复合物连续培养四周后进行组织学染色，番红o染色结果表明，如图6所示，水凝胶中软骨细胞分泌了大量软骨细胞外基质代表性大分子糖胺聚糖，且形成了大量的软骨组织特异性陷窝结构，说明基于改性柚皮苷的水凝胶具有优异的软骨再生修复应用潜力。
39.上面结合附图对本发明进行了示例性的描述，显然本发明的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。