技术特征：
1.一种抗虫性的苏铁毒蛋白基因，其特征在于，所述抗虫性的苏铁毒蛋白基因的核苷酸序列为seq id no.1，seq id no.2，seq id no.3，seq id no.4，seq id no.5。2.一种由如权利要求1所述的抗虫性的苏铁毒蛋白基因，依据不同植物或作物的密码子偏好性，使用同义密码子代替稀有密码子进行的密码子优化；本发明依据棉花密码子偏好性，使用同义密码子代替稀有密码子得到苏铁毒蛋白优化基因，其特征在于，所述苏铁毒蛋白优化基因的核苷酸序列为seq id no.6，seq id no.7，seq id no.8，seq id no.9，seq id no.10。3.一种编码如权利要求1所述的抗虫性的苏铁毒蛋白基因的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列为seq id no.11，seq id no.12，seq id no.13，seq id no.14，seq id no.15。4.一种以所述苏铁细胞毒素蛋白基因核苷酸序列为目标，在不同物种中利用软件或者网站进行同源性比对得到相关毒性基因的方法，所得到的序列相似性大于70％的核苷酸序列；与权利要求1、2任一项所述苏铁细胞毒素蛋白基因的氨基酸序列相似度大于50％的核苷酸序列或功能相似的亚片段。5.一种编码如权利要求1、2任一项所述的抗虫性的苏铁毒蛋白基因的杀虫应用或杀虫剂制造，应用范围包括但不限于棉铃虫、小菜蛾、草地贪夜蛾等植物或作物害虫。6.一种应用如权利要求1、2任一项所述的抗虫性的苏铁毒蛋白基因构建得到的植物或作物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体的构建方法包括：线性化载体制备：使用限制性内切酶bstbi和mlui双酶切vm062-3*flag载体，使环状载体线性化；带有同源臂的目标序列扩增：以正向引物：5
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gggcggtaccccgggttcgaaatggttatggtaattgactatccaagtc-3’；反向引物：5
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cactagttaattaagacgcgtctatgtcatgcgtagaatggccc-3’为引物，对苏铁毒蛋白基因进行pcr扩增；载体酶切产物与pcr产物的检测与回收：琼脂糖凝胶电泳检测目的基因片段与载体酶切产物，使用quick gel extraction kit回收目的片段；胶回收产物重组：使用-basic seamless cloning and assembly kit进行同源重组，反应体系如下：2
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basic assembly mix 5μl；酶切载体xμl；pcr产物yμl；将灭菌水加入至10μl。*10μl反应体系中，载体与各个插入片段加入量均在0.01～0.25pmols，载体与各个插入片段的最佳摩尔比为1：2；轻轻混合，50℃反应15min，进行转化；测序鉴定：经菌落pcr和质粒pcr筛选阳性克隆，进行测序分析。7.如权利要求6所述的植物表达载体的构建方法，其特征在于，所述扩增体系为：kod one
tm pcr master mix 25μl；上游引物10μm each 1.5μl；下游引物10μm each 1.5μl；模板2μl；灭菌水20μl；总体积50μl；所述pcr的程序为98℃5min；98℃30s，50℃30s，68℃3min，30个循环；68℃10min，4℃保存。8.如权利要求6所述的植物表达载体的构建方法，其特征在于，所述转化方法包括：
(1)在冰上融化trans1-t1感受态细胞，静置2-5分钟，观察细胞是否已解冻，用手指轻弹管底1-2次；在50μl细胞中加入2μl的重组产物，弹动离心管壁混匀后，在冰上放置30min；(2)42℃水浴中热激30s后马上转至冰上冷却2min；加入450μl常温无抗lb液体培养基后，于37℃摇床中250rpm培养1h；(3)5000rpm离心2min，收集菌体，留100μl液体重悬，均匀涂布于含有卡那霉素抗性的lb固体平板上，37℃培养箱过夜培养。9.一种应用如权利要求1、2任一项所述的抗虫性的苏铁毒蛋白基因的植物或作物的抗虫方法，其特征在于，所述植物或作物的抗虫方法包括：将含有目标序列的植物表达载体导入到植物细胞内，并由此获得对害虫有抗性或杀伤能力的转基因植物及其后代，包括种子和任何部分的植物组织；或者通过同源或异源表达的方法获得该蛋白施用于植物或作物；其中，所述植物或作物包括但不限于棉花、玉米、小麦和水稻。10.一种如权利要求9所述的转基因棉花植株的苏铁毒蛋白基因表达检测方法，其特征在于，所述转基因棉花植株的苏铁毒蛋白基因表达检测方法包括取转基因棉花纯合株系叶片，提取叶片总蛋白，用于western blot检测；具体包括：(1)取新鲜样品1～2g，将样品放在研钵中用液氮研磨；研磨后置于10ml试管中，并加入蛋白提取液4℃摇匀30min；(2)于12000rpm 4℃离心20min；提取上清液，样品制备完成；(3)取上清加入loading buffer，98℃煮5～10min后用sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质表达情况。11.如权利要求10所述的转基因棉花植株的苏铁毒蛋白基因表达检测方法，其特征在于，所述蛋白提取液包括0.01m pbs ph＝8，1mm pmsf，2mm dtt。
技术总结
本发明属于基因工程技术领域，公开了一种抗虫性的苏铁毒蛋白基因、表达载体及应用，所述抗虫性的苏铁毒蛋白基因及其同源基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5。本发明提供的毒蛋白基因来自苏铁，外源表达注射发现其对小菜蛾与棉铃虫幼虫具有毒性作用。将其导入到棉花中，使棉花获得草地贪夜蛾和棉铃虫抗性，且后代能够稳定遗传。本发明为抗虫植物的研制提供了一种新的抗虫基因，不仅可以使棉花等受体获得多种机制的抗虫性，还利用基因互补的方式加强转基因棉花的抗虫能力，延缓害虫产生抗性，拓宽了棉花抗虫谱，使其获得能够高效杀死主要害虫的广谱抗虫性。主要害虫的广谱抗虫性。主要害虫的广谱抗虫性。
技术研发人员：邹长松 王朋宝 张寿洲 黄锦岭 马建超 刘欢 常贯晓 李林洲 王思博 董珊珊 程祥飞 王磊 孙晓
受保护的技术使用者：深圳华大生命科学研究院 深圳市仙湖植物园（深圳市园林研究中心）
技术研发日：2022.03.29
技术公布日：2022/8/5