一种抗虫性的苏铁毒蛋白基因、表达载体及应用的制作方法

1.本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种抗虫性的苏铁毒蛋白基因、表达载体及应用。


背景技术：

2.小麦、玉米、棉花等作物可持续性发展是保障我国粮食安全的重中之重。其中棉花不仅是世界上最重要的天然纤维作物，也是重要的油料作物和高蛋白粮食作物。
3.全球每年多达40％的农作物产量因虫害而损失，造成的损失至少为700亿美元。为了抵御害虫侵袭，科学家们在抗虫基因挖掘与抗性机制解析方面取得了一系列重要进展。目前，研究成功的抗虫基因主要有苏云金芽孢杆菌杀虫基因、豇豆胰蛋白酶抑制剂、慈菇蛋白酶抑制剂、淀粉酶抑制剂、营养杀虫蛋白、胆固醇氧化酶、雪花莲凝集素、半夏凝集素、尾穗苋凝集素及蝎毒基因等昆虫神经毒素。在棉花上应用最为成功的是郭三堆等研制的双价转基因抗虫棉新品种，其遗传转化的抗虫基因为bt杀虫基因gfmcry1a和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因cpti。
4.虽然现有转抗虫基因棉花能有效控制鳞翅目、鞘翅目、同翅目害虫，但由于这些基因在棉花整个生长期内一直表达，这就有可能使害虫易于对其产生抗性，从而成为转基因棉花发展中的最大威胁。其中，澳大利亚转基因抗虫棉已然对棉铃虫无效。
5.目前农作物抗病虫育种可用抗性基因资源匮乏，急需挖掘新的抗病虫基因，并利用基因互补的方式加强转基因作物或植物的抗虫能力，同时也应注意延缓害虫产生抗(耐)性。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种抗虫性的苏铁毒蛋白基因、表达载体及应用。
7.本发明是这样实现的，一种抗虫性的苏铁毒蛋白基因，所述抗虫性的苏铁毒蛋白基因的核苷酸序列为seq id no.1。
8.本发明的另一目的在于提供苏铁中所述抗虫性的苏铁毒蛋白基因的同源基因，所述同源基因的核苷酸序列为seq id no.2，seq id no.3，seq id no.4，seq id no.5。
9.本发明的另一目的在于提供一种由所述的抗虫性的苏铁毒蛋白基因经密码子优化得到的苏铁毒蛋白优化基因，优化物种为棉花，所述苏铁毒蛋白优化基因的核苷酸序列为seq id no.6，seq id no.7，seq id no.8，seq id no.9，seq id no.10。
10.本发明的另一目的在于提供一种编码所述的抗虫性的苏铁毒蛋白基因的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列为seq id no.11，seq id no.12，seq id no.13，seq id no.14，seq id no.15。
11.本发明的另一目的在于提供一种编码所述的抗虫性的苏铁毒蛋白基因的杀虫应用或杀虫剂制造，应用范围包括但不限于棉铃虫、小菜蛾、草地贪夜蛾、线虫等植物或作物
害虫。
12.本发明的另一目的在于提供一种应用所述的抗虫性的苏铁毒蛋白基因构建得到的植物或作物表达载体，所述表达载体的构建方法包括：
13.线性化载体制备：使用限制性内切酶bstbi和mlui双酶切pvm062-3*flag载体，使环状载体线性化。
14.带有同源臂的目标序列扩增：
15.以正向引物：
[0016]5’‑
gggcggtaccccgggttcgaaatggttatggtaattgactatccaagtc-3’；
[0017]
反向引物：5
’‑
cactagttaattaagacgcgtctatgtcatgcgtagaatggccc-3’[0018]
为引物，对苏铁毒蛋白基因进行pcr扩增。
[0019]
载体酶切产物与pcr产物的检测与回收：琼脂糖凝胶电泳检测目的基因片段与载体酶切产物，使用quick gel extraction kit回收目的片段。
[0020]
胶回收产物重组：使用-basic seamless cloning and assembly kit进行同源重组，反应体系如下：2
×
basic assembly mix 5μl；酶切载体xμl；pcr产物yμl；将灭菌水加入至10μl。*10μl反应体系中，载体与各个插入片段加入量均在0.01～0.25pmols，载体与各个插入片段的最佳摩尔比为1：2；轻轻混合，50℃反应15min，进行转化。测序鉴定：经菌落pcr和质粒pcr筛选阳性克隆，进行测序分析。
[0021]
进一步，所述扩增体系为：kod one
tm pcr master mix 25μl；上游引物10μm each 1.5μl；下游引物10μm each 1.5μl；模板2μl；灭菌水20μl；总体积50μl。
[0022]
所述pcr的程序为：pcr的程序为98℃5min；98℃30s，50℃30s，68℃3min，30个循环；68℃10min，4℃保存。
[0023]
进一步，所述转化方法包括：
[0024]
(1)在冰上融化trans1-t1感受态细胞，静置2-5分钟，观察细胞是否已解冻，用手指轻弹管底1-2次；在50μl细胞中加入2μl的重组产物，轻轻弹动离心管壁混匀后，在冰上放置30min；
[0025]
(2)42℃水浴中热激30s后马上转至冰上冷却2min；加入450μl常温无抗lb液体培养基后，于37℃摇床中250rpm培养1h；
[0026]
(3)5000rpm离心2min，收集菌体，留100μl液体重悬，均匀涂布于含有卡那霉素抗性的lb固体平板上，37℃培养箱过夜培养。
[0027]
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的抗虫性的苏铁毒蛋白基因的植物或作物的抗虫方法，所述植物或作物的抗虫方法是将含有目标序列的植物表达载体导入到植物或作物细胞内，并由此获得对害虫有抗性或杀伤能力的转基因植物或作物及其后代，包括种子和任何部分的植物或作物组织；或者通过同源或异源表达的方法获得该蛋白施用于植物或作物，并由此植物或作物获得虫害防御能力。
[0028]
其中，所述植物或作物包括但不限于棉花、玉米、小麦和水稻等。
[0029]
本发明的另一目的在于提供一种转基因棉花植株的苏铁毒蛋白基因表达检测方法，所述转基因棉花植株的苏铁毒蛋白基因表达检测方法包括：取转基因棉花纯合株系叶片，提取叶片总蛋白，用于western blot检测；具体包括：
[0030]
(1)取新鲜样品1～2g，将样品放在研钵中用液氮研磨；研磨后置于10ml试管中，并加入蛋白提取液4℃摇匀30min；
[0031]
(2)于12000rpm 4℃离心20min；提取上清液，样品制备完成；
[0032]
(3)取上清加入loading buffer，98℃煮5～10min后用sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质表达情况。
[0033]
进一步，所述蛋白提取液包括0.01m pbs ph＝8，1mm pmsf，2mm dtt。
[0034]
结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
[0035]
针对农作物抗病虫育种可用抗性基因资源匮乏，本发明提供了一种新的能够使植物或作物(包括但不限于棉花、玉米、小麦和水稻等)产生抗虫性的苏铁毒蛋白基因，本发明提供了一个明确的转基因棉花株系，其具有草地贪夜蛾和棉铃虫抗性。
[0036]
本发明提供了一种新的抗虫性的苏铁毒蛋白基因，构建相关植物表达载体，利用农杆菌介导法转化棉花，获得转基因棉花株系，具体步骤包括对抗虫性的苏铁毒蛋白基因进行克隆，测序分析；构建所述基因的超表达载体；采用农杆菌介导法进行棉花遗传转化；其中，所述超表达载体中抗虫性的苏铁毒蛋白基因是由35s启动子驱动。本发明提供的毒蛋白基因来自苏铁，将其导入到棉花中，使棉花获得草地贪夜蛾和棉铃虫抗性，且后代能够稳定遗传。
[0037]
本发明能够进一步提供或利用上述抗虫基因获得其它转基因作物和相应的种子，也可以利用有性杂交的方式将本发明的抗虫基因转入相同背景的其它品种或相近物种，以达到加快各物种抗虫种质创新的效果。
[0038]
本发明描述了小菜蛾、草地贪夜蛾、棉铃虫等农业主要害虫注射苏铁毒蛋白及转基因植株喂养存活情况，表征如下：
[0039]
(1)取龄期一致的三龄第二天的小菜蛾(平均体重1.33mg/头)。每头小菜蛾注射2.03μg苏铁毒蛋白，设置对照组，注射等体积(207nl)的磷酸盐缓冲液(pbs)。设三次重复，每个重复注射30头幼虫。注射后24h统计死亡率，结果表明注射苏铁毒蛋白后，小菜蛾平均死亡率为89.30％，显著高于对照组的死亡率7.78％。
[0040]
(2)取龄期一致的二龄第二天的棉铃虫(平均体重是2.06mg/头)。每头棉铃虫注射3.38μg苏铁毒蛋白，设置对照组，注射等体积(345nl)的磷酸盐缓冲液(pbs)。设三次重复，每个重复注射30头幼虫。注射后24h统计死亡率，结果表明注射苏铁毒蛋白后，棉铃虫平均死亡率为37.78％，显著高于对照组的死亡率5.56％。
[0041]
(3)取龄期一致的二龄草地贪夜蛾(平均体重1.01mg/头)，统一进行8h饥饿实验，而后以转基因棉花纯合株系叶片为实验组，转基因受体材料“百棉1号”和陆地棉遗传标准系tm-1为对照组。设三次重复，每个重复培养18头幼虫，25℃培养4天统计死亡率。结果表明喂食转基因棉花4天后，草地贪夜蛾的平均死亡率为61.11％，远高于喂食“百棉1号”的平均死亡率24.07％和喂食tm-1的平均死亡率12.96％。
[0042]
(4)取龄期一致的二龄棉铃虫(平均体重3.9mg/头)用于棉铃虫的取食实验。实验前，统一进行8h饥饿实验，而后以转基因棉花纯合株系叶片为实验组，转基因受体材料“百棉1号”和陆地棉遗传标准系tm-1为对照组。设三次重复，每个重复培养18头幼虫，25℃培养4天统计死亡率。结果表明喂食转基因棉花4天后，棉铃虫的平均死亡率为59.26％，远高于
喂食“百棉1号”的平均死亡率29.63％和喂食tm-1的平均死亡率14.81％。
[0043]
本发明组装了苏铁高质量基因组，通过基因组分析发现了水平基因转移现象，即苏铁基因组中发现了来自于真菌的基因。通过分析发现该基因编码蛋白含有细胞毒素结构域，具有杀虫效果。而且水平基因转移是一个自然的转基因过程，这些转移的基因通常对植物无害，因此本发明选择该基因作为抗虫候选基因。
[0044]
本发明苏铁毒蛋白基因来源于发明人组装的苏铁基因组，通过基因组分析并提取出该基因序列，设计引物并进行pcr克隆得到。
[0045]
本发明所提供的苏铁毒蛋白基因基因可显著提高植物(包括但不限于棉花、玉米、小麦和水稻等)抗虫性的一个基因，由于其来源于植物自身，转化到其他植物后一般不存在毒害效应。该基因转化棉花后，不仅可以使棉花同时获得草地贪夜蛾和棉铃虫抗性，还可以利用基因互补的方式加强转基因棉花的抗虫能力，拓宽了棉花抗虫谱，使其获得能够高效杀死主要害虫的广谱抗虫性。本发明成功克隆了苏铁毒蛋白基因，提供了该基因的核苷酸序列和编码蛋白质氨基酸序列，为植物抗虫种质的创制及新品种的选育提供理论基础和应用参考。
[0046]
本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：本发明的技术方案转化后的预期收益与后续转基因棉花品种的审定和推广面积有关，我国抗虫棉面积自2006年以来，稳定在350万公顷左右，本发明将通过传统遗传实验，培育不同背景的抗虫棉，并积极推进审定棉花抗虫新品种，商业价值十分可观。
附图说明
[0047]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0048]
图1是本发明实施例提供的苏铁毒蛋白基因的pcr扩增结果示意图。
[0049]
图2是本发明实施例提供的构建的植物表达载体示意图，利用35s启动子驱动苏铁毒蛋白基因，该植物表达载体带有壮观霉素抗性基因。
[0050]
图3是本发明实施例提供的转基因棉花植株示意图。
[0051]
图4是本发明实施例提供的对棉花遗传转化植株叶片中苏铁毒蛋白基因的表达进行pcr检测的示意图，图中可以清晰看到苏铁毒蛋白基因在棉花叶片中表达。
[0052]
图5是本发明实施例提供的对棉花遗传转化植株叶片中苏铁毒蛋白基因的表达进行western blot检测的示意图，图中可以清晰看到苏铁毒蛋白基因在棉花叶片中表达。
[0053]
图6是本发明实施例提供的对棉花遗传转化植株叶片进行抗虫检测的示意图，图中可以清晰看到苏铁毒蛋白基因显著抑制草地贪夜蛾和棉铃虫的生长发育。
具体实施方式
[0054]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0055]
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种抗虫性的苏铁毒蛋白基因、表达载体及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
[0056]
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
[0057]
本发明所涉及的kod one
tm pcr master mix购于东洋纺(上海)生物科技有限公司；quick gel extraction kit、-t1 cloning kit、-basic seamless cloning and assembly kit购于北京全式金生物技术有限公司；质粒小提试剂盒购于omega有限公司；植物rna提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司；rna反转录试剂盒购于诺唯赞生物科技有限公司；引物合成、基因测序由上海生工生物工程有限公司完成；基因优化和合成由河南尚亚生物技术有限公司完成。
[0058]
实施例1：克隆苏铁毒蛋白基因
[0059]
1.苏铁rna模板的获得
[0060]
取苏铁嫩叶，使用植物rna提取试剂盒提取rna。取苏铁嫩叶约1g，液氮速冻，放入研钵中研磨至细粉状，之后按照植物rna提取试剂盒说明书进行rna提取。rna浓度用nano drop可见光分光光度计(thermo fisher，美国)测定。
[0061]
取刚提取的苏铁rna，按照反转录试剂盒说明书将rna反转录为cdna。
[0062]
利用反转录得到的cdna为模板，seq id no.16：以正向引物：5
’‑
atggttatggtaattgactatccaagtc-3’；反向引物：5
’‑
ctatgtcatgcgtagaatggccc-3’为引物对苏铁毒蛋白基因进行pcr扩增，扩增体系为：
[0063]
kod one
tm pcr master mix 25μl
[0064]
上游引物(10μm each)1.5μl
[0065]
下游引物(10μm each)1.5μl
[0066]
模板2μl
[0067]
灭菌水20μl
[0068]
总体积50μl
[0069]
pcr的程序为98℃5min；98℃30s，50℃30s，68℃3min，30个循环；然后68℃10min，4℃保存。pcr产物用琼脂糖凝胶电泳检测(见图1)，之后用quick gel extraction kit纯化回收pcr产物，然后用-t1 cloning kit将pcr产物连入t载体，转化大肠杆菌dh5α，利用kod one
tm pcr master mix做pcr检测，挑选阳性克隆送至上海生工生物有限公司测序。经过序列比对，测序正确的克隆利用质粒小提试剂盒提取质粒，并将其被命名为p-t_suit，序列信息见seq id no.1：
[0070]
atggttatggtaattgactatccaagtctcagagcttcgttatatgccactaagagtgcggtcccatgtcgcccgcttccgggcaatccagagcgggtgtcgcgccgggtatcacgcagaggcgcgggagagatcgggtcccatgcagatttctggatctcccgcgccaaggcatccgccatccggattttcccgcgtcaagagggtccgctccgtgaatcccggagaagattctatcttctccgcgaagcggtgttcaccggccgcaggaccgcctgggccgctaatccagcggcccaacgggcagcatgggaccgcaagagatcccctttcttcggaaggtcttccgatgatattcattcattcagcaagaatccagaagaattcttgactcaaaacactctcagctgcagtttattaactcgcaccgctcagaccgtcacaaaaagcccagtattgcccgcccaaggttgggtcaaagtgggtcgtgtgccaggaagaggagacgctctctttgttgagct
ggttgccgagaaatcagatgagacagtgaaggcgtacttacttggctacaatggtaagaacgactcccccgagccggcatacgttgatattccaaagaggggcgccgagaacggaacatttttgtttaccgtggatctctcgggctgctccgttgttgtgacacagttggacgagcagacataccgtgttttccacgacaaacgggtgaacagctccattctgtacgacaacgtcgtaatgtatgtggatttcaatcactaccgctatcccagagcccacggacacgggagagatacgggacaagcggtcgtctgtatgcaattcgccgacggagtgtggaaattgtttctccagcggcacgagacggcgaattctctcccaaagatatggtcccgtggcgatggcaaaccggagattttcagcgacgccgaaccccgtccacatatggaagatggcataaaggaatttctcaatcggcgtcgagctttgcaagacgaattgaagcacttcgccaacacgcttgaagtggacccggacatagtgtccaacgctgtcgacggcgaatacgaaggcggccagttttccaggaacgacgatgcaattcgtggatggaacgaattacgtgcaagcatgagacagaaaatggctgaaaggaagaaactgttgcaaacaaagaaaggtatgctagactcattcaacaacccggatcaccccctctataaatttcgcaaacaagtgctcgacgagctcaaggaaatgagtgcatacgacaacaccttggaggcatccgagattgcggaccgtacttggctgtggttggagatcaaaaaagccaaaggtacgaatgcagtggtaaacagtggagcagccccgaagcagccgagtcttaccgttggtgaacgctacgcagagatggaggcggccctttggatgcgtagcgacacagcggcgtttgagcaagggtatgaatcttatcaaaccgttcgcgtgccgggttacaatgaagatatgacatccattgcaatgaagaagttgttcgttgagagcagtctgactgacgagcagctgggcgccttgtgcaagcgtatatccattgctagcgatcaagagaaccatcttctgacacagaagacgcaggagattgagagcactttcaaacaattttcagatggcagctttttggagtcggcgcctcaggatttcttcctgagacgagtcggtgataaatctggaggacgctgctatcctcttgtaagggtaatggccgtcgcactgtctgaaggagaagacgttgcccagaattttatggagaacctgaggacattgtctaggaatccagagtattcaggcgaatcggcaagttcacaagccacaaatgcagggttgttcagagatgccctggccggcctgcacgcgaatgtggaagccattgccgcatctgagaaactacctgctgtgtttggactgcccgatgttgctacaatgttgagccaagcgagcgaaagcaaggtttacgctttgaataccgaaacacacagcatgctggttgcggtgattgtagacaaacagagtctggcgcgcaagtattacttctatgatcccaactttctcatggccggtttctccgacataactcgtttctcggaagccctcaagtatcactttgtgaatctccagttcgccggaaactacaaagcgtttggcacagcggaggctccccagtttaacctggtccttattgatacgaccgccatggaggatgcgcatgttgacggagggatcaccgtgaaacaattgagcgagggcgttgatcttactaatgtctttgacagcaccaaaaaggctcgtgtggtaactgaggcagcagctcgcttggctgaagaccaacaactgcgcactggcctcaccataatagaggctgaccagtgggcaaacaggtggcaagatgccgtcatacgattgaaactcaaggaaggattaagtggagagtggatgccattgctggagaaaatgcaagaaaacgcagatggttcttatcagattgatttcatcaacaccaagaatactggggaaatccgtggggtttccactagagatgcgacgttcaaagaattcaaatcctacctggataaaaatttagacgtattgcataaggatttcatctttcaggatggagttttcaaaccactggagggagagcccattgacgggttgaatgcaatgttcgcggtccaaatgattatagattggttcaaccgggggactaatgctgaggaagatgcggcctcaggatccaccaatgcccaactttccctagcgattaaagtgcacagctacattaacatggcccaagtagcgcatactgcagttacagatgttgccaaggtatacaaccttgtaaagtcagcactgtatggcgagcaggtagctggggagacatcgctgttcacatttgggaaggcgttgaaatttgcagcaacagaagggttgggagtcttactaggggcgtcctttgtgatcttggatgcctaccagctgtccctcgtggaaaacgatgtgcagaaggccattatcggcacacaactagcctttgattccgcaagctttctagcgggtattggtgcaattgttgctggagcatcgggcgtgggcatgattttgggcggagctggcgtggtattgggaggcctgggagttggctttggagccttagctcaggcattcggggaaatcacagcagacgcccaactggtgggcaagtacttcgcactcttggacgaggcataccgcggtggcggatacagatacgaatctaaagacaaggcattgatgcctcttgcaggagcagtcatcgacaaaatacgactggccgacaaacatctccaagttcatttcgacagccaattcatatatcgaacccatcatggcagcacaggatccggcaaaattaattacttcttctg
ggctggcgacatgccgcagatggtccacgatcgctcccaagctatcaatgttcgagagcaaattgggtataagaacgataatgctactttggagctaccggaggatgcctctgatctgatcctgcctgccacgcccaagtcatttatcacttaccgatacgagattctaccattcgctacttcccgccacgatacgggtttcgatgtcattagacgcctggaagaagactacagattcgattacgatttctacatcttcccatctgaatacacaatcagaaccatcaaacacgagtacgtagaaacaaaggtggcagtagtcctggataggcgctctttgcgactgggagcacctgagcttctcaaggagcaacatggctatttgatctatgagatcgaggggaccggaggacaatacgttatatgtcttaaccagggatccactgtcacactgaagaccaccggatcagaggcaaataaaacattatggatacttgatgcccgacaactcattgcaggcaacgattcaatcacggtctctcaagatagcatcaccatcggcagcacaacagtccatctccgtaaccaagatttcgattgcctacagatcgtcatgagtcgggaggagcttctccaagtggacttggcgtctggagaagcccgcgtgttttcagaagatgccagtaaatggctcgacaccaaagaaacaatccatgaacatctccataagttggctgaagaacacaggttgcatggccagtttgtagtggtgaacaattattatcgtggagtgggccgtgcctactatgatgctgctcacgatcggatgttgtatacagatgtggaagatgaaactctgactcgggatgctgttcttgccggcgttacaggcgaagatgcctacttctacaatgtaaagcagaatgccctgtggcgagtgaatgcaggcacacaccaagtaataaccaaatactatccgacgttactggaggaccctgacagcaacatggcaagagttgagcagcatggcaacatcgtcgtgatggccatgagcaggctcaaccacccggacaagggagtaaatggaatcatctatctcgttcatcaagaaagcatcgtgcttactgctgtgatcggcaattcagagatgctcaaacgtcttcgccaaacgagtacaattagcttaacagaattgcgaggtgtcaatgacatggctctggtttccacgatggacagattacccggccaaaaggttgtcgctaccaacgctgagtttgtgacacttctggctaaggatgagcaaggagccaatatcaaggagcagacggtctattgccaacaaggtacgggccagaccaacgatacatctattgaaagcatcccgattccagggctctctaatcttttaaccgtgtacggtgaagtattcgctacaactaatgatggtcgcatccttcgcctgcttggggacggctcaacatgtctcgagggcatcaatgagcattggctcatcaagcatccaaaatggtggcaggacttggctaccttggaggcagagaaagccacgacagttgcagtattcggtgttagagacctacaaaatgcagtggtgccaatttggtaccacaacggaaagatcgcggtggcctcatcaaaactgtatggcaaacaactgcaatttttggggtttaacagcaacggtgaagcttggttgttcgacttggacgacggcattctgtatagccagccgcttgtggatagctttctgtatgcaatctttagtttggacgggaagcttattgcaccaatctttattccacaagtggagcaaatgctcagcggccagcatctcagaaaccctgtcatcgtggacggccgtttgcatgtgactaccatagacggtgttgttgttggatttgacaagaagtcgccaactctggttgcagtgaacaaggcctggcagatatctcgtcagaaccgattagaagaggccctcggaaacctgctgtccaattggtctgatcacaatgatgcgattgtgttgcagggtgatccagaatcagcgccggcatggtattatgttccatcaagagaaatagtgaccgccaatggtctaacatgggcggatcatcctctatggctaggaatggctgtcggtgctgcaacgccatacatctacagcacatcccgacgccgtgtgtatgttgtggagagcaaaaacatggccaaagacaaaggagaattcgcagcagcacattgctttgcaaaatcacttgtgctacagagcatcgttcccgaggaaataacgattccgacgctggctggcatcgatttcgcactcgttgcagcgacaaatgcaaccattgtaatagaccgagacaattggaagcattacaaggccattgtgctcgacaacaaggtggatcaggacggtggcgctaaggtggtagtcggcagtgagattcccatgaaagttctggtgcgcaaatttcagggaaatctggagttcttcgatccaaacaatggtaatgttgttatactccagaatgtgttgaagggagacggagcttgttgccagatagagatcaaagtaggcgatgctgagactatgcttgtatccgatttctcggagatattctcaaagacgcatcctctggtggcaagccaagtatttgagcttggggatgtgattgcagtcacaaaacacaaatcggactatgcggatctgtgggccattctacgcatgacatag
[0071]
本发明提供由所述的抗虫性的苏铁毒蛋白基因在苏铁中的同源基因，所述同源基因的核苷酸序列如下：
[0072]
seq id no.2：
[0073]
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[0080]
本发明提供由所述的抗虫性的苏铁毒蛋白基因优化得到的苏铁毒蛋白优化基因，所述苏铁毒蛋白优化基因的核苷酸序列如下：
[0081]
seq id no.6：
[0082]
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[0083]
seq id no.7：
[0084]
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[0085]
seq id no.8：
[0086]
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[0087]
seq id no.9：
[0088]
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[0089]
seq id no.10：
[0090]
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[0102]
实施例2：35s启动子+苏铁毒蛋白基因的植物表达载体的构建
[0103]
线性化载体制备：使用限制性内切酶bstbi和mlui双酶切vm062-3*flag载体，使环状载体线性化。
[0104]
带有同源臂的目标序列扩增：
[0105]
seq id no.17：
[0106]
以正向引物：
[0107]5’‑
gggcggtaccccgggttcgaaatggttatggtaattgactatccaagtc-3’；
[0108]
反向引物：
[0109]5’‑
cactagttaattaagacgcgtctatgtcatgcgtagaatggccc-3’为引物，对苏铁毒蛋白基因进行pcr扩增，扩增体系为：
[0110]
kod one
tm pcr master mix 25μl
[0111]
上游引物(10μm each)1.5μl
[0112]
下游引物(10μm each)1.5μl
[0113]
模板2μl
[0114]
灭菌水20μl
[0115]
总体积50μl
[0116]
pcr的程序为98℃5min；98℃30s，50℃30s，68℃3min，30个循环；然后68℃10min，4℃保存。
[0117]
载体酶切产物与pcr产物的检测与回收：琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物与载体酶切产物，使用quick gel extraction kit回收目的片段。
[0118]
胶回收产物重组：使用-basic seamless cloning and assembly kit进行同源重组，反应体系如下：
[0119]2×
basic assembly mix 5μl
[0120]
酶切载体xμl
[0121]
pcr产物yμl
[0122]
灭菌水to 10μl
[0123]
*10μl反应体系中，载体与各个插入片段加入量建议均在0.01～0.25pmols，载体与各个插入片段的最佳摩尔比为1：2。
[0124]
轻轻混合，50℃反应15分钟。
[0125]
转化方法：
[0126]
1.在冰上融化trans1-t1感受态细胞，静置2-5分钟，观察细胞是否已解冻，用手指轻弹管底1-2次。
[0127]
2.在50μl细胞中加入2μl的重组产物，轻轻弹动离心管壁混匀后，在冰上放置30分钟。
[0128]
3.42℃水浴中热激30秒，之后马上转至冰上冷却2分钟。
[0129]
4.加入450μl常温无抗lb液体培养基，之后37℃摇床中250rpm培养1小时。
[0130]
5. 5000rpm离心2分钟，收集菌体，留100μl液体重悬，将其均匀涂布于含有卡那霉素抗性的lb固体平板上，之后37℃培养箱过夜培养。
[0131]
测序鉴定：经菌落pcr和质粒pcr筛选阳性克隆，送至上海生工生物工程有限公司测序分析，结果表明：成功得到了苏铁毒蛋白基因植物超表达载体vm062-suit(见图2)。
[0132]
本发明选用vm062-3*flag载体作为基础植物表达载体，由于35s启动子与3*flag之间酶切位点易发生移码突变，加上标签位于蛋白n端有利于蛋白表达，因此本发明采用3*flag标签之后的bstbi和mlui酶切位点，用于构建最终表达载体。载体序列如序列seq id no.18。
[0133]
seq id no.18植物表达载体序列：
[0134]
gaattcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattggctagagcagcttgccaacatggtggagcacgacactctcgtctactccaagaatatcaaagatac
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[0135]
实施例3：转基因棉花株系获得(见图3)
[0136]
将实施例2所得植物过表达载体vm062-suit送江苏未米生物科技有限公司进行转化，转化背景为棉花品种“百棉1号”。从公司获得的t0代转基因棉花株系，栽培收获t1代，seq id no.19：以正向引物：5
’‑
gactacaaggacgacgatgataagg-3’；反向引物：5
’‑
gtatgcactcatttccttgagctcg-3’为引物，对苏铁毒蛋白基因基因特异1400bp片段进行pcr扩增，筛选t1阳性植株并收获种子。结果如图4所示，确定目的基因未发生遗传分离丢失，最终获得含有苏铁毒蛋白基因稳定遗传的阳性纯合转基因棉花。
[0137]
实施例4：转基因棉花植株的苏铁毒蛋白基因蛋白水平表达检测
[0138]
取转基因棉花纯合株系叶片，提取叶片总蛋白，用于western blot检测。具体步骤：
[0139]
1、取新鲜样品1～2g；
[0140]
2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后置于10ml试管中，并加入蛋白提取液(0.01m pbs ph＝8，1mm pmsf，2mm dtt)4℃摇匀30min。
[0141]
3、12000rpm 4℃离心20min。
[0142]
4、提取上清液，样品制备完成。
[0143]
5、取上清加入loading buffer，然后98℃煮5～10分钟，后用sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质表达情况，见图5。
[0144]
实施例5：苏铁毒蛋白转基因棉花植株的抗虫性检测
[0145]
取龄期一致的三龄第二天的小菜蛾(平均体重1.33mg/头)。每头注射2.03μg苏铁蛋白，对照组注射等体积(207nl)的磷酸盐缓冲液(pbs)。设三次重复，每个重复注射30头幼虫。注射后24h统计死亡率，结果见表1。
[0146]
取龄期一致的二龄第二天的棉铃虫(平均体重是2.06mg/头)。每头注射3.38μg苏
铁蛋白，对照组注射等体积(345nl)的磷酸盐缓冲液(pbs)。设三次重复，每个重复注射30头幼虫。注射后24h统计死亡率，结果见表1。
[0147]
表1 注射苏铁蛋白后小菜蛾和棉铃虫幼虫的死亡率
[0148][0149]
取龄期一致的二龄草地贪夜蛾(平均体重1.01mg/头)用于草地贪夜蛾的取食实验。实验前，统一进行8h饥饿实验，而后以转基因棉花纯合株系叶片为实验组，转基因受体材料“百棉1号”和陆地棉遗传标准系tm-1为对照组。设三次重复，每个重复培养18头幼虫。25℃培养4天统计死亡率，取食结果见图6，死亡率统计见表2。
[0150]
取龄期一致的二龄棉铃虫(平均体重3.9mg/头)用于棉铃虫的取食实验。实验前，统一进行8h饥饿实验，而后以转基因棉花纯合株系叶片为实验组，转基因受体材料“百棉1号”和陆地棉遗传标准系tm-1为对照组。设三次重复，每个重复培养18头幼虫。25℃培养4天统计死亡率，取食结果见图6，死亡率统计见表2。
[0151]
表2 草地贪夜蛾和棉铃虫幼虫死亡率
[0152][0153]
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
[0154]
本发明提供了一种来源于苏铁的毒蛋白基因，该基因长6240bp，编码2080个氨基酸，将其导入到棉花中，使转基因棉花获得草地贪夜蛾和棉铃虫抗性，且后代能够稳定遗传。详细实施例见：
[0155]
实施例1.克隆苏铁毒蛋白基因。
[0156]
实施例2.35s启动子+苏铁毒蛋白基因的植物表达载体的构建。
[0157]
实施例3.转基因棉花株系获得。
[0158]
实施例4.转基因棉花植株的苏铁毒蛋白基因蛋白水平表达检测。
[0159]
实施例5.苏铁毒蛋白转基因棉花植株的抗虫性检测。
[0160]
三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
[0161]
本发明提供了来源于苏铁的毒蛋白基因，该基因是本发明首次发现，来源于苏铁的一种抗虫基因，将其导入到棉花中，根据苏铁毒蛋白基因的表达情况(图4)，说明该基因已成功导入棉花，并能稳定遗传；根据苏铁毒蛋白基因的表达情况(图5)，说明该基因所编码的蛋白已在棉花中成功表达；根据转基因植株的抗虫实验结果(图6，表1，表2)，发现转基
因棉花对草地贪夜蛾抗性达到61.11％，对棉铃虫抗性达59.26％。这些结果与其它研究结果相比，说明本发明单价转基因棉花所获得的抗性与他人研究的双价转基因棉花具有类似效应。
[0162]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。