技术特征：
1.一种三磷酸核苷酸三乙胺盐的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：采用色谱法将活性成分为如式c所示的三磷酸核苷酸的待纯化物进行分离制备，得到如式d所示的三磷酸核苷酸三乙胺盐；其中，r为碱基，r’为-oh、-och3或h；色谱柱为阴离子交换柱，所述阴离子交换柱填料的配基为季铵基团或二乙胺乙基，流动相包括三乙胺-碳酸缓冲溶液。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中的一种或多种：(a)所述分离制备包括如下方案一或方案二；方案一：所述阴离子交换柱填料的配基为季铵基团；以水为buffer a，以三乙胺-碳酸缓冲溶液为buffer b进行分离制备；方案二：所述阴离子交换柱填料的配基为二乙胺乙基；以10mm三乙胺-碳酸缓冲溶液为buffer a，以1m三乙胺-碳酸缓冲溶液为buffer b进行分离制备；(b)所述碱基为天然碱基或修饰碱基；(c)所述阴离子交换柱填料的基质为交联葡聚糖、具有葡聚糖表面延伸剂的高度交联琼脂糖、聚丙烯酸酯、琼脂糖凝胶、单分散聚苯乙烯-二乙烯基苯、单分散聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸酯；(d)所述阴离子交换柱的直径为5-100mm；(e)所述阴离子交换柱的柱高为50-400mm；(f)所述阴离子交换柱的柱温为4-20℃；(g)所述流动相的起始浓度小于将三磷酸核苷酸三乙胺盐洗脱时的浓度。3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中的一种或多种：(a)方案一中，所述阴离子交换柱的填料为uniq、nanoq或generik mc-q；(b)方案二中，所述阴离子交换柱填料为deae-sephadex a250、capto deae、unideae、unicore-deae、deae sepharose 6ff或generik mc-deae；(c)所述阴离子交换柱的直径为7.7-10mm；(d)所述阴离子交换柱的柱高为100-300mm；(e)方案一中，所述阴离子交换柱填料的粒径为10-30μm；(f)方案二中，所述阴离子交换柱填料的粒径为40-120μm；(g)所述阴离子交换柱的柱温为4℃；(h)方案一中，所述buffer a为超纯水；
(i)方案一中，所述buffer b为1-2m的三乙胺-碳酸缓冲溶液；(j)方案一中，所述分离制备包括如下步骤：(1)3-5倍柱体积的a buffer平衡；(2)1-3倍柱体积a buffer洗杂；(3)5-20倍柱体积洗脱，b buffer的最终比例为18％-80％；(4)1-2倍柱体积洗脱剩余杂质，b buffer比例为50％-100％；(k)方案二中，所述分离制备包括如下步骤：(1)3-5倍柱体积的a buffer平衡；(2)0.5-2倍柱体积a buffer洗杂；(3)8～20倍柱体积洗脱，b buffer的最终比例为12％～100％；(4)1～2倍柱体积洗脱剩余杂质，b buffer的比例为60％～100％；(l)所述碱基为下述结构中的一种：4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中的一种或多种：(a)方案二中，所述阴离子交换柱填料为deae-sephadex a250、capto deae、unigel-deae或deae sepharose 6ff；(b)所述阴离子交换柱的柱高为200-220mm；(c)方案一中，所述阴离子交换柱填料的粒径为15μm；(d)方案二中，所述阴离子交换柱填料的粒径为50-90μm；(e)方案一中，所述分离制备包括如下步骤：(1)3-5倍柱体积的a buffer平衡；(2)2-2.5倍柱体积a buffer洗杂；(3)5.5-8倍柱体积洗脱，b buffer的最终比例为18％-30％；(4)1-2倍柱体积洗脱剩余杂质，b buffer比例为50％-100％。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，方案一中，所述分离制备包括如下步骤：(1)3-5倍柱体积的a buffer平衡；(2)2-2.5倍柱体积a buffer洗杂；(3)6.5倍柱体积洗脱，b buffer的最终比例为20％-30％；(4)1-2倍柱体积洗脱剩余杂质，b buffer比例为50％-100％。6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述洗脱包括线性梯度洗脱和/或阶梯梯度洗脱。7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分离制备采用下述方法中的任意一
种：方法101：以nanoq为填料进行分离制备，以超纯水为buffer a，以1m的三乙胺-碳酸缓冲溶液为buffer b，所述分离制备包括下述步骤，(1)5倍柱体积的a buffer平衡；(2)2倍柱体积a buffer洗杂；(3)20倍柱体积线性梯度洗脱，b buffer的最终比例为80％；(4)1倍柱体积洗脱剩余杂质，b buffer比例为100％；方法102：以uniq为填料进行分离制备，以超纯水为buffer a，以1m的三乙胺-碳酸缓冲溶液为buffer b，所述分离制备包括下述步骤，(1)5倍柱体积的a buffer平衡；(2)2倍柱体积a buffer洗杂；(3)20倍柱体积线性梯度洗脱，b buffer的最终比例为80％；(4)1倍柱体积洗脱剩余杂质，b buffer比例为100％；方法103：以generik mc-q为填料进行分离制备，以超纯水为buffer a，以1m的三乙胺-碳酸缓冲溶液为buffer b，所述分离制备包括下述步骤，(1)5倍柱体积的a buffer平衡；(2)2倍柱体积a buffer洗杂；(3)20倍柱体积线性梯度洗脱，b buffer的最终比例为80％；(4)1倍柱体积洗脱剩余杂质，b buffer比例为100％；方法104：以generik mc-q为填料进行分离制备，以超纯水为buffer a，以2m的三乙胺-碳酸缓冲溶液为buffer b，所述分离制备包括下述步骤，(1)5倍柱体积的a buffer平衡；(2)2倍柱体积a buffer洗杂；(3)8倍柱体积线性梯度洗脱，b buffer的最终比例为22.5％；(4)1倍柱体积洗脱剩余杂质，b buffer比例为50％；方法105：以generik mc-q为填料进行分离制备，以超纯水为buffer a，以2m的三乙胺-碳酸缓冲溶液为buffer b，所述分离制备包括下述步骤，(1)5倍柱体积的a buffer平衡；(2)2倍柱体积a buffer洗杂；(3)5.5倍柱体积线性梯度洗脱，b buffer的最终比例为22.5％；(4)1倍柱体积洗脱剩余杂质，b buffer比例为50％；方法106：以generik mc-q为填料进行分离制备，以超纯水为buffer a，以2m的三乙胺-碳酸缓冲溶液为buffer b，所述分离制备包括下述步骤，(1)5倍柱体积的a buffer平衡；(2)2.5倍柱体积a buffer洗杂；(3)0.5倍柱体积阶梯梯度洗脱，b buffer的比例为20％，再用6倍柱体积线性梯度洗脱，b buffer的最终比例为30％；(4)1倍柱体积洗脱剩余杂质，b buffer比例为100％；方法107：以generik mc-q为填料进行分离制备，以超纯水为buffer a，以2m的三乙胺-碳酸缓冲溶液为buffer b，所述分离制备包括下述步骤，(1)5倍柱体积的a buffer平衡；(2)2倍柱体积a buffer洗杂；(3)8倍柱体积线性梯度洗脱，b buffer的最终比例为22.5％；(4)1倍柱体积洗脱剩余杂质，b buffer比例为50％；方法108：以generik mc-q为填料进行分离制备，以超纯水为buffer a，以2m的三乙胺-碳酸缓冲溶液为buffer b，所述分离制备包括下述步骤，(1)5倍柱体积的a buffer平衡；(2)2倍柱体积a buffer洗杂；(3)8倍柱体积线性梯度洗脱，b buffer的最终比例为18％；(4)1倍柱体积洗脱剩余杂质，b buffer比例为50％；方法201：以deae-sephadex a250为填料，以10mm的三乙胺-碳酸缓冲溶液为buffer a，以1m的三乙胺-碳酸缓冲溶液为buffer b，所述分离制备包括下述步骤，(1)5倍柱体积的a buffer平衡；(2)2倍柱体积a buffer洗杂；(3)1倍柱体积阶梯梯度洗脱，b buffer比例为12％；再以8倍柱体积线性梯度洗脱，b buffer的最终比例为30％；(4)1倍柱体积洗脱剩余杂质，b buffer比例为60％或100％；
方法202：以capto deae为填料，以10mm的三乙胺-碳酸缓冲溶液为buffer a，以1m的三乙胺-碳酸缓冲溶液为buffer b，所述分离制备包括下述步骤，(1)5倍柱体积的a buffer平衡；(2)2倍柱体积a buffer洗杂；(3)20倍柱体积线性梯度洗脱，b buffer的最初比例为10％，最终比例为100％；(4)1倍柱体积洗脱剩余杂质，b buffer比例为100％；方法203：以unigel-deae为填料，以10mm的三乙胺-碳酸缓冲溶液为buffer a，以1m的三乙胺-碳酸缓冲溶液为buffer b，所述分离制备包括下述步骤，(1)5倍柱体积的a buffer平衡；(2)2倍柱体积a buffer洗杂；(3)20倍柱体积线性梯度洗脱，b buffer的最终比例为100％；(4)1倍柱体积洗脱剩余杂质，b buffer比例为100％；方法204：以deae sepharose 6ff为填料，以10mm的三乙胺-碳酸缓冲溶液为buffer a，以1m的三乙胺-碳酸缓冲溶液为buffer b，所述分离制备包括下述步骤，(1)5倍柱体积的a buffer平衡；(2)2倍柱体积a buffer洗杂；(3)10倍柱体积线性梯度洗脱，b buffer的最初比例为10％，最终比例为100％；(4)1倍柱体积洗脱剩余杂质，b buffer比例为100％。8.如权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中的一种或多种：(1)所述的待纯化物在洗脱前进行预处理，所述的预处理包括下述步骤：将所述的待纯化物溶于teab溶液获得上样样品；(2)所述的待纯化物的合成包括下述步骤：(i)在三磷酸甲酯中，将如式a所示的化合物与三氯氧磷进行如下所示的磷酰化反应，得到如式b所示的化合物；(ii)将(bu3n)2h4p2o7、三正丁胺与如式b所示的化合物进行如下所示的反应，并加入水进行淬灭，得到如式c所示的化合物；其中，r、r’的定义如权利要求1所述；(3)所述三磷酸核苷酸三乙胺盐的制备方法还包括如下步骤：在洗脱后，收集纯化后的样品溶液，浓缩，冻干。9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中的一种或多种：(1)所述的待纯化物在teab溶液中的浓度为0-100mg/ml；(2)步骤(i)中，所述的三氯氧磷与所述的如式a所示的化合物的摩尔比为1-2：1；(3)步骤(i)中，所述的三磷酸甲酯与所述的如式a所示的化合物的体积质量比为10-20ml/g；(4)步骤(i)中，所述反应的反应温度为-10℃-20℃；(5)步骤(ii)中，所述的水为超纯水；(6)步骤(ii)中，所述的(bu3n)2h4p2o7与所述的如式b所示的化合物的摩尔比为(5-10)：1；(7)步骤(ii)中，所述的三正丁胺与所述的如式b所示的化合物的摩尔比为(4-8)：1；
(8)步骤(ii)中，所述反应的反应温度为5℃-20℃。10.如权利要9所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中的一种或多种：(1)所述的待纯化物在teab溶液中的浓度为10-20mg/ml；(2)步骤(i)中，所述的三氯氧磷与所述的如式a所示的化合物的摩尔比为1.5：1；(3)步骤(i)中，所述的三磷酸甲酯与所述的如式a所示的化合物的体积质量比为14.9ml/g；(4)步骤(i)中，所述反应的反应温度为15℃；(5)步骤(ii)中，所述的(bu3n)2h4p2o7与所述的如式b所示的化合物的摩尔比为5：1；(6)步骤(ii)中，所述的三正丁胺与所述的如式b所示的化合物的摩尔比为6：1；(7)步骤(ii)中，所述反应的反应温度为15℃。
技术总结
本发明公开了一种三磷酸核苷酸盐的制备方法。本发明提供的一种三磷酸核苷酸三乙胺盐的制备方法，其包括如下步骤：采用色谱法将活性成分为如式C所示的三磷酸核苷酸的待纯化物进行分离制备，得到如式D所示的三磷酸核苷酸三乙胺盐。该制备方法实现了多种修饰及非修饰三磷酸核苷酸的大规模自动化制备，通用性好，分离度高。分离度高。分离度高。
技术研发人员：蔡晓茹 郭传鑫 彭祥然 李松 钱其军
受保护的技术使用者：浙江吉量科技有限公司
技术研发日：2022.03.29
技术公布日：2022/7/12