技术特征：
1.一种大熊猫胎盘间充质干细胞分离与培养方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1：大熊猫胎盘的无菌采集；步骤2：采用胶原酶消化法将大熊猫胎盘间充质干细胞原代分离，分离的组织在培养皿进行培养；步骤3：对步骤2培养的胎盘间充质干细胞进行细胞形态特征鉴定、表面标志鉴定、诱导分化鉴定；步骤4：将培养传代的胎盘间充质干细胞冻存，使用时取出进行细胞复苏。2.根据权利要求1所述的一种大熊猫胎盘间充质干细胞分离与培养方法，其特征在于：所述步骤1的具体操作为：步骤1.1：将自然分娩后的大熊猫胎盘放置于25℃含1％双抗的生理盐水中保存，并于6h内运送至实验室进行原代细胞分离，其中1％双抗为100u/ml青霉素和100u/ml链霉素；步骤1.2：在超净工作台中将胎盘组织转移至添加75％酒精的培养皿中浸泡30s，取出后用生理盐水冲洗5～10次，然后浸入含3％～5％三抗的生理盐水中清洗1min，将胎盘组织转移至新的培养皿中，用上述含3％～5％三抗的生理盐水重复浸入清洗10～15次，其中三抗为青霉素、链霉素、两性霉素；步骤1.3：步骤1.2清洗完成后，将组织转移至含1％双抗、20％胎牛血清的dmen培养液中。3.根据权利要求2所述的一种大熊猫胎盘间充质干细胞分离与培养方法，其特征在于：所述步骤2的具体操作为：步骤2.1：采用灭菌眼科剪将步骤1.3中大熊猫胎盘组织剪碎成1mm3大小，添加0.25％ⅳ型胶原酶中消化吹打40min后，1100rpm离心6min，弃上清后加入含1％双抗、20％胎牛血清的dmen培养液悬浮细胞，转移至培养皿进行培养；步骤2.2：每日观察细胞生长状态，及时更换新鲜培养基，待细胞生长至80％汇合时，采用3～5倍稀释的0.25％胰酶进行消化传代培养。4.根据权利要求3所述的一种大熊猫胎盘间充质干细胞分离与培养方法，其特征在于：所述步骤3包括：3.1：细胞形态特征鉴定胎盘间充质干细胞在生长过程中应表现对培养皿的粘附能力，细胞呈梭长扁平状，中央核突起清晰，边界不明显，高倍镜下观察可见清晰的细胞细胞肌丝结构；3.2：表面标志鉴定步骤3.2.1：提取总rna，收集胎盘间充质干细胞，trizol裂解室温吹打5min，加氯仿离心分层后收取水样层，rna通过异丙醇沉淀来还原，提取得到rna；步骤3.2.2：反转录合成cdna，步骤3.2.3：设计合成间大熊猫胎盘充质干细胞表面标志基因引物，通过qrt-pcr来鉴定其是否有表达；3.3：诱导分化鉴定，包括成骨诱导培养结果确定、成脂诱导培养结果确定、成软骨诱导培养结果确定。5.根据权利要求4所述的一种大熊猫胎盘间充质干细胞分离与培养方法，其特征在于：所述步骤4的具体操作为：细胞冻存时进行梯度降温，冷冻开始时降温速度为-1℃/min～-2
℃/min，当温度低于-25℃时可加速，温度降至-80℃后转移至液氮中保存。
技术总结
本发明属于干细胞分离与培养领域，具体涉及一种大熊猫胎盘间充质干细胞分离与培养方法。包括如下步骤：步骤1：大熊猫胎盘的无菌采集；步骤2：采用胶原酶消化法将大熊猫胎盘间充质干细胞原代分离，分离的组织在培养皿进行培养；步骤3：对步骤2培养的胎盘间充质干细胞进行细胞形态特征鉴定、表面标志鉴定、诱导分化鉴定；步骤4：将培养传代的胎盘间充质干细胞冻存，使用时取出进行细胞复苏。本发明利用收集胎盘时添加高浓度组合抗生素和多次清洗，采用胶原酶消化法分离培养以及设计大熊猫间充质干细胞标志基因特异性引物等，获得高纯度的大熊猫胎盘间充质干细胞。熊猫胎盘间充质干细胞。熊猫胎盘间充质干细胞。
技术研发人员：林鹏飞 雷颖虎 赵鹏鹏 张丹辉 沈洁娜 赵卫平 高更更
受保护的技术使用者：秦岭大熊猫研究中心（陕西省珍稀野生动物救护基地）
技术研发日：2022.03.31
技术公布日：2022/7/8