一种大熊猫胎盘间充质干细胞分离与培养方法与流程

1.本发明属于干细胞分离与培养领域，具体涉及一种大熊猫胎盘间充质干细胞分离与培养方法。


背景技术：

2.大熊猫是世界生物多样性的保护旗舰物种，秦岭大熊猫是大熊猫的重要亚种种群，具有独特的形态特征和遗传特性，积极开展秦岭大熊猫种质资源保存工作，建立秦岭大熊猫种质资源干细胞库，对于保护我国大熊猫遗传多样性具有重要的作用和意义。间充质干细胞做为多能干细胞，有多向分化的潜力，可作为临床治疗的理想干细胞，为大熊猫疾病的临床治疗提供最佳原材料。胎盘做为分娩废弃产物，其对大熊猫个体的无损伤性可作为间充质干细胞来源的最佳方式。
3.但大熊猫胎盘收集后，常因污染和组织块法培养时细胞不易迁出等问题，难以获得高纯度的大熊猫胎盘间充质干细胞。


技术实现要素：

4.针对上述存在的技术问题，本发明提供了一种大熊猫胎盘间充质干细胞分离与培养方法，利用收集胎盘时添加高浓度组合抗生素和多次清洗，采用胶原酶消化法分离培养以及设计大熊猫间充质干细胞标志基因特异性引物等，获得高纯度的大熊猫胎盘间充质干细胞。
5.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
6.一种大熊猫胎盘间充质干细胞分离与培养方法，包括如下步骤：
7.步骤1：大熊猫胎盘的无菌采集；
8.步骤2：采用胶原酶消化法将大熊猫胎盘间充质干细胞原代分离，分离的组织在培养皿进行培养；
9.步骤3：对步骤2培养的胎盘间充质干细胞进行细胞形态特征鉴定、表面标志鉴定、诱导分化鉴定；
10.步骤4：将培养传代的胎盘间充质干细胞冻存，使用时取出进行细胞复苏。
11.优选的，所述步骤1的具体操作为：
12.步骤1.1：将自然分娩后的大熊猫胎盘放置于25℃含1％双抗的生理盐水中保存，并于6h内运送至实验室进行原代细胞分离，其中1％双抗为100u/ml青霉素和100u/ml链霉素；
13.步骤1.2：在超净工作台中将胎盘组织转移至添加75％酒精的培养皿中浸泡30s，取出后用生理盐水冲洗5～10次，然后浸入含3％～5％三抗的生理盐水中清洗1min，将胎盘组织转移至新的培养皿中，用上述含3％～5％三抗的生理盐水重复浸入清洗10～15次，其中三抗为青霉素、链霉素、两性霉素；
14.步骤1.3：步骤1.2清洗完成后，将组织转移至含1％双抗、20％胎牛血清的dmen培
养液中。
15.优选的，所述步骤2的具体操作为：
16.步骤2.1：采用灭菌眼科剪将步骤1.3中大熊猫胎盘组织剪碎成1mm3大小，添加0.25％ⅳ型胶原酶中消化吹打40min后，1100rpm离心6min，弃上清后加入含1％双抗、20％胎牛血清的dmen培养液悬浮细胞，转移至培养皿进行培养；
17.步骤2.2：每日观察细胞生长状态，及时更换新鲜培养基，待细胞生长至80％汇合时，采用3～5倍稀释的0.25％胰酶进行消化传代培养。
18.优选的，所述步骤3包括：
19.3.1：细胞形态特征鉴定
20.胎盘间充质干细胞在生长过程中应表现对培养皿的粘附能力，细胞呈梭长扁平状，中央核突起清晰，边界不明显，高倍镜下观察可见清晰的细胞细胞肌丝结构；
21.3.2：表面标志鉴定
22.步骤3.2.1：提取总rna，收集胎盘间充质干细胞，trizol裂解室温吹打5min，加氯仿离心分层后收取水样层，rna通过异丙醇沉淀来还原，提取得到rna；
23.步骤3.2.2：反转录合成cdna，
24.步骤3.2.3：设计合成间大熊猫胎盘充质干细胞表面标志基因引物，通过qrt-pcr来鉴定其是否有表达；
25.3.3：诱导分化鉴定，包括成骨诱导培养结果确定、成脂诱导培养结果确定、成软骨诱导培养结果确定。
26.优选的，细胞冻存时进行梯度降温，冷冻开始时降温速度为-1℃/min～-2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，温度降至-80℃后转移至液氮中保存。
27.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
28.1.通过75％酒精浸泡30s和3％～5％三抗生理盐水的多次清洗，可有效减少胎盘收集时发生的污染现象，采用0.25％ⅳ型胶原酶消化法可获得高纯度的大熊猫胎盘间充质干细胞；
29.2.采用胶原酶消化法，成功获得间充质干细胞。现有的使用组织块贴壁法分离细胞过程中发现，在组织块贴壁后10天乃至14天后仍无细胞迁出，本发明通过使用胶原酶消化法，成功获得间充质干细胞。分析比较两次试验的不同，得出以下区别：1)胎盘组织在分娩后应当迅速运往实验室，超过6h将影响组织的细胞活性；2)传统的组织块分离法细胞迁出率低，且时间消耗长，大熊猫为自然分娩，胎盘天然暴露于污染环境，在对胎盘进行无菌处理的过程中，不可避免地对其造成影响，将胎盘组织进行机械剪碎成小块后，再用胶原酶消化，可有效减少消化时间，而未完全消化的组织再次接种于培养皿上，即可成功迁出细胞。
附图说明
30.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
31.在附图中：
32.图1为本发明的方法流程图；
33.图2为本发明的秦岭大熊猫胎盘间充质干细胞形态学特征图(a图
×
100倍，b图
×
40倍)；
34.图3为本发明分离培养的秦岭大熊猫胎盘间充质干细胞的成骨诱导分化鉴定图片；
35.图4为本发明分离培养的秦岭大熊猫胎盘间充质干细胞的成脂诱导分化鉴定图片；
36.图5为本发明分离培养的秦岭大熊猫胎盘间充质干细胞的成软骨诱导分化鉴定图片。
具体实施方式
37.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
38.因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.实施例：
40.参照附图1，为本发明的方法流程图，一种大熊猫胎盘间充质干细胞分离与培养方法，包括如下步骤：
41.步骤1：大熊猫胎盘的无菌采集，具体操作为：
42.步骤1.1：将自然分娩后的大熊猫胎盘放置于25℃含1％双抗的生理盐水中保存，并于6h内运送至实验室进行原代细胞分离；
43.步骤1.2：在超净工作台中将胎盘组织转移至添加75％酒精的培养皿中浸泡30s，取出后用生理盐水冲洗5～10次，然后浸入含3％～5％三抗的生理盐水中清洗1min，将胎盘组织转移至新的培养皿中，用上述含3％～5％三抗的生理盐水重复浸入清洗10～15次，其中三抗为青霉素、链霉素、两性霉素，其中青霉素含量10ku/ml，链霉素含量10mg/ml，两性霉素b含量25μg/ml；
44.步骤1.3：步骤1.2清洗完成后，将组织转移至含1％双抗、20％胎牛血清的dmen培养液中。
45.步骤2：采用胶原酶消化法将大熊猫胎盘间充质干细胞原代分离，分离的组织在培养皿进行培养，具体操作为：
46.步骤2.1：采用灭菌眼科剪将步骤1.3中大熊猫胎盘组织剪碎成1mm3大小，添加0.25％ⅳ型胶原酶中消化吹打40min后，1100rpm离心6min，弃上清后加入含1％双抗、20％胎牛血清的dmen培养液悬浮细胞，转移至培养皿进行培养；
47.步骤2.2：每日观察细胞生长状态，及时更换新鲜培养基，待细胞生长至80％汇合时，采用3～5倍稀释的0.25％胰酶进行消化传代培养。
48.步骤3：对步骤2培养的胎盘间充质干细胞进行细胞形态特征鉴定、表面标志鉴定、
诱导分化鉴定；包括：
49.3.1：细胞形态特征鉴定
50.胎盘间充质干细胞在生长过程中应表现对培养皿的粘附能力，细胞呈梭长扁平状，中央核突起清晰，边界不明显，高倍镜下观察可见清晰的细胞细胞肌丝结构，见图2；
51.3.2：表面标志鉴定
52.步骤3.2.1：提取总rna，收集胎盘间充质干细胞，trizol裂解室温吹打5min，加氯仿离心分层后收取水样层，rna通过异丙醇沉淀来还原，提取得到rna；具体为：
53.(1)使用预冷pbs对间充质干细胞进行清洗，加入rnatrizol反应5min后，反复吹打至裂解成均一溶液，将其收集于1.5ml无rna酶ep管中；
54.(2)加入200ul三氯甲烷，剧烈震荡15s使其混匀，室温放置5min后，4℃离心机中以12000rpm/min离心15分钟，将上层水相转移至一eppendorf管中；
55.(3)加入等体积异丙醇后混匀，室温放置10分钟，4℃离心机中12000rpm/min离心10分钟，观察到白色沉淀为rna；
56.(4)弃去上清置于冰上并加入75％酒精1ml，吹打振荡，4℃离心机中以7500rpm/min离心5min，弃去上清重复75％酒精清洗离心操作；
57.(5)将获得的rna沉淀在室温下干燥，待其呈透明状或半透明状时，加入30ul无rna酶水，反复吹打后分装于分光光度计检测并-80℃保存。
58.步骤3.2.2：反转录合成cdna，按照商品化逆转录试剂盒要求加入对应体积的水、引物、模板rna、dntp、buffer、逆转录酶，参照说明书设置逆转录程序，扩增获得cdna。
59.步骤3.2.3：设计合成间大熊猫胎盘充质干细胞表面标志基因引物，通过qrt-pcr来鉴定其是否有表达；利用步骤3.2.1中培养细胞的总rna和步骤3.2.2反转录合成的cdna，利用rt-pcr鉴定大熊猫胎盘间充质干细胞表达干细胞标志基因cd34、cd90、scfr和sox-2，使用引物序列参考表1。
60.表1大熊猫胎盘充质干细胞表面标志基因引物序列
[0061][0062]
3.3：诱导分化鉴定，
[0063]
3.1：成骨诱导培养结果确定
[0064]
胎盘间充质干细胞在成骨分化培养基中诱导21d后，经茜素红染色观察矿化基质
的形成(图3)，其中成骨诱导分化培养基由基础培养基中加入10％fbs，0.1μm地塞米松，10mmβ-甘油磷酸酯和2μm抗坏血酸组成，经茜素红染色后可观察到矿化基质的形成。
[0065]
3.2：成脂诱导培养结果确定
[0066]
胎盘间充质干细胞在成脂分化培养基中诱导21～28d后，经油红o染色后可观察到脂质液泡(图4)，其中成脂诱导分化培养基由基础培养基中加入10％fbs，0.5mm3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，1μm地塞米松，0.5mm罗格列酮和10μg/ml胰岛素。
[0067]
3.2：成软骨诱导培养结果确定
[0068]
胎盘间充质干细胞在成软骨分化培养基中诱导21～28d后，经阿利辛蓝染色后可观察到软骨组织中的内酸性粘多糖(图5)，成软骨诱导分化培养基由dmen培养液中加入10％fbs、1％tgf-β、0.1μm地塞米松、3μm抗坏血酸、1μm脯氨酸和1μm丙酮酸钠组成。
[0069]
步骤4：将培养的胎盘间充质干细胞分离与培养；具体操作为：细胞冻存时进行梯度降温，冷冻开始时降温速度为-1℃/min～-2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，温度降至-80℃后转移至液氮中保存。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。