一种耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶突变体及其制备方法与应用

一种耐热
β-1,3-1,4-葡聚糖酶突变体及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于酶工程技术领域，特别涉及一种耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶突变体及其制备方法与应用。


背景技术：

2.β-1,3-1,4-葡聚糖酶(plica)是从一株分离的土壤细菌中得到的，初步鉴定为拟芽孢杆菌(paenibacillus)，具有耐碱、耐盐的特性，能够水解大麦β-葡聚糖、海带多糖。耐碱、耐盐的特征使该酶成为进一步研究和工业应用的好的候选者，可以应用于工业造纸、酿酒等领域，应用前景广泛。但该葡聚糖酶在高温下会迅速失活，在实际应用中可能损失较大，因此改善其热稳定性对拓宽其实际应用具有十分重要的意义。
3.二硫键与蛋白质高级结构的生物活性有关，是蛋白质中唯一的共价键，约需要209.3-418.6kj/mo1的能量才能将其打断，对维持蛋白质的结构和功能具有关键的作用。形成的二硫键会成为折叠后蛋白质的疏水核心，局部的疏水残基会凝聚在二硫键的周边，透过疏水性作用而联系在一起。在蛋白质中构建二硫键是提高其稳定性的主要策略之一，已经成功地应用于多种酶学研究。中国专利文献cn107177581(申请号201710456875.6)公开了一种改造的腈水合酶，改造腈水合酶的方法，是将腈水合酶氨基酸序列的α亚基的133位pro和β亚基的215位asp分别置换为cys，使两个亚基之间形成二硫键。本发明改造腈水合酶的抗逆性、耐热性和产物耐受性都有显著提升，并且没有导致腈水合酶活性的降低。中国专利文献cn104531729a(申请号201410758084.5)公开了一种突变阿魏酸酯酶a，根据来源于a.usamii e001阿魏酸酯酶a的空间结构设计突变a126c和n152c，得到突变阿魏酸酯酶a：aufaeaa126c-n152c，c126和c152可以形成一个二硫键。实验结果表明突变后该酶热稳定性有了明显的提高。中国专利文献cn103642776a(申请号201310666411.x)公开了一种突变木聚糖酶，根据来源于a.oryzae cicc40186木聚糖酶aoxyn11a的空间结构设计突变s108c和n152c，得到突变木聚糖酶：aoxyn11aelj，其成熟肽108c和152c可以形成一个跨二级结构的二硫键。实验结果表明突变后该酶热稳定性有了明显的提高。
4.二硫键的正确形成是蛋白质折叠的限速步骤之一，控制引入二硫键的位置非常必要。因此，在引入二硫键时，合理地进行添加才能最大限度地提高酶分子的热稳定性能。本发明的首要目的在于克服现有的β-1,3-1,4-葡聚糖酶(plica)在高温条件下失去活力，有针对性地设计添加二硫键，使酶的耐热性提高。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶突变体及其制备方法与应用。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶突变体，其氨基酸序列如seq id no.3所示。
8.本发明的β-1,3-1,4-葡聚糖酶突变体的原始酶为β-1,3-1,4-葡聚糖酶(plica)，
其氨基酸序列genbank accession no：agk07610.1(seq id no:1)，其核苷酸序列genbank accession no：kc513762.1(seq id no:2)。
9.本发明的β-1,3-1,4-葡聚糖酶突变体是在原始酶的基础上，将其氨基酸序列第9位的苏氨酸(thr)和第43位的甘氨酸(gly)突变成半胱氨酸(cys)得到的。
10.编码上述β-1,3-1,4-葡聚糖酶突变体的核苷酸序列，如seq id no.4所示。
11.一种含有上述β-1,3-1,4-葡聚糖酶突变体的核苷酸序列的重组质粒。
12.根据本发明优选的，所述重组质粒的载体为pet28a(+)。
13.一种含有上述β-1,3-1,4-葡聚糖酶突变体核苷酸序列或上述重组质粒的基因工程菌。
14.根据本发明优选的，所述基因工程菌的表达宿主为大肠杆菌。
15.进一步优选的，所述表达宿主菌为大肠杆菌bl21。
16.本发明所述耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
17.(1)人工合成含有原始酶β-1,3-1,4-葡聚糖酶(plica)核苷酸序列的质粒pet28a(+)eccslg，设计引物g35-69u和g35-69d以及g35-69wu和g35-69wd，以质粒pet28a(+)eccslg为模板，以g35-69u和g35-69d为引物，pcr合成目的基因eccslg69
t
，以质粒pet28a(+)eccslg为模板，以g35-69wu和g35-69wd为引物，反向pcr合成目的基因eccslg69g；
18.(2)将步骤(1)合成的目的基因eccslg69g与eccslg69
t
连接环化，构建突变质粒，将突变质粒转入大肠杆菌bl21，构建重组大肠杆菌，诱导表达耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶突变体。
19.根据本发明优选的，步骤(1)中所述g35-69u的核苷酸序列为：5
’‑
ccgttatgctaccacaactcctccacct-3’(seq id no:9)，
20.所述g35-69d的核苷酸序列为：5
’‑
agcttgcaatcgttggtaaaagttgcatt-3’(seq id no:10)，
21.所述g35-69wu的核苷酸序列为：5
’‑
ttttaccaacgattgcaagctgcgt-3’(seq id no:7)，
22.所述g35-69wd的核苷酸序列为：5
’‑
gagttgtggtagcataacggttccca-3’(seq id no:8)。
23.上述耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶突变体在食品、饲料、造纸领域中的应用。
24.本发明的耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶突变体可以在高温条件下作用于β-葡聚糖的1,3及1,4糖苷键，产生低聚糖及葡萄糖，可以应用于食品、饲料、造纸等领域。
25.本发明中未详细说明的实验步骤均按照现有技术记载的方法进行。
26.本发明的有益效果：
27.本发明提供了一种耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶突变体，是在原始酶(seq id no:1)的基础上，将其氨基酸序列第9位的苏氨酸(thr)和第43位的甘氨酸(gly)突变成半胱氨酸(cys)得到的，与原始酶相比，显著提高了酶的最适反应温度，由60℃提升到了75℃，还在一定程度上增加了突变酶eccslg69金属离子耐受性，拓宽了耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶突变体应用范围及应用潜力。
附图说明
28.图1为野生酶和突变酶在不同温度下的酶活变化曲线。
29.图2为野生酶和突变酶在不同金属离子存在条件下的相对活性柱状图。
具体实施方式
30.以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例中涉及的实验操作，若无特殊说明，均为本领域常规技术操作。
31.材料来源：
32.材料与试剂：含有原始酶β-1,3-1,4-葡聚糖酶(plica)核苷酸序列的质粒pet28a(+)eccslg由上海金斯瑞生物公司全基因合成。质粒提取试剂盒购自诺唯赞贸易有限公司，bl21大肠杆菌感受态细胞购自诺唯赞生物公司；引物由上海生工生物工程公司合成；dpnⅰ限制性内切酶购自上海生物工程公司；pcr产物纯化回收试剂盒购自天根生物公司；lb培养基包含蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，氯化钠1％，ph 7.0～7.4；镍柱纯化试剂盒购自七海生物公司；其余试剂均为国内外购买的分析纯级别。
33.实施例1
34.以β-1,3-1,4-葡聚糖酶(plica)为模板，其氨基酸序列genbank accession no：agk07610.1(seq id no:1)，核苷酸序列genbank accession no：kc513762.1(seq id no:2)，利用swiss model软件进行β-1,3-1,4-葡聚糖酶(plica)二级结构的建模，再利用disulfide by design预测可以添加二硫键的位置，再根据三级结构当中的具体位点，避开底物结合部位，最终选择了两种不同的组合，构建二硫键，分别是在thr9和gly
43
之间以及ser
76
和asp
205
之间构建二硫键。
35.实施例2β-1,3-1,4-葡聚糖酶突变体的制备
36.在thr9和gly
43
之间构建二硫键，具体是将编码thr9的密码子acc以及编码gly
43
的密码子ggc突变为编码cys的密码子tgc，突变得到突变酶eccslg69，突变酶eccslg69的氨基酸序列如seq id no:3所示，核苷酸序列如seq id no:4；
37.在ser
76
和asp
205
之间构建二硫键，具体是将编码ser
76
的密码子agc以及编码asp
205
的密码子gat突变为编码cys的密码子tgc，突变得到突变酶eccslg102，突变酶eccslg102的氨基酸序列如seq id no:5所示，核苷酸序列如seq id no:6；
38.上述突变酶的具体制备方法如下：
39.(1)根据人工合成的含有原始酶β-1,3-1,4-葡聚糖酶(plica)核苷酸序列的质粒pet28a(+)eccslg设计引物，质粒pet28a(+)eccslg中β-1,3-1,4-葡聚糖酶的核苷酸序列经过了密码子优化，适于在大肠杆菌中表达，其中，用于突变酶eccslg69的引物为g35-69u和g35-69d以及g35-69wu和g35-69wd，用于突变酶eccslg102的引物为g102-231u和g102-231d以及g102-231wu和g102-231wd，引物的核苷酸序列信息如下表：
40.表1.引物的核苷酸序列信息
[0041][0042]
注：表格中下划线粗斜体字母表示引入半胱氨酸突变。
[0043]
以质粒pet28a(+)eccslg为模板，以g35-69u和g35-69d为引物，进行pcr扩增，获得目的基因eccslg69
t
；
[0044]
以质粒pet28a(+)eccslg为模板，以g35-69wu和g35-69wd为引物，进行反向pcr扩增，获得目的基因eccslg69g；
[0045]
以质粒pet28a(+)eccslg为模板，以g102-231u和g102-231d为引物，进行pcr扩增，获得目的基因eccslg102s；
[0046]
以质粒pet28a(+)eccslg为模板，以g102-231wu和g102-231wd为引物，进行反向pcr扩增，获得目的基因eccslg102d；
[0047]
上述pcr扩增及反向pcr扩增的反应体系如表2所示：
[0048]
表2.pcr扩增及反向pcr扩增的反应体系
[0049]
成分体积模板2μl上游引物2μl下游引物2μlphanta酶19μl双蒸水25μl总体系50μl
[0050]
上述pcr扩增及反向pcr扩增的反应条件为：95℃3min；95℃15s，70℃15s，72℃3min、30个循环；72℃5min，4℃保温。
[0051]
(2)将步骤(1)反向pcr扩增得到的产物eccslg69g和eccslg102d，分别以dpnⅰ酶消化模板，回收目的条带后，使用c112试剂盒，分别与相应的pcr扩增产物eccslg69
t
和eccslg102s连接环化，构建得到突变质粒，随后使用化转法将突变质粒转入bl21大肠杆菌感受态细胞，并涂布于含卡那霉素抗性的lb平板(卡那霉素浓度30μg/ml)上，37℃过夜培养，测序正确后获得阳性转化子，即重组大肠杆菌；
[0052]
(3)将步骤(2)构建的重组大肠杆菌接种至50ml含有卡那霉素的lb液体培养基(卡那霉素浓度为30μg/ml)中，37℃、250r/min培养4小时至od值为0.8-1.0，加入诱导剂iptg25μl，诱导表达8h，离心保留沉淀，采用镍柱纯化试剂盒纯化目的蛋白，得突变酶eccslg69和突变酶eccslg102。
[0053]
实施例3突变酶的性质分析
[0054]
(1)酶活测定
[0055]
酶活测定方法为dns法，即3,5-二硝基水杨酸法。2.0ml葡聚糖溶液(ph6.0)中加入2.0ml适当稀释的酶液，37℃反应30min，加入5.0mldns试剂，沸水浴中显色5min，分光光度计测定od
540
。
[0056]
酶活定义：1个酶活性单位(u)定义为每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量。
[0057]
蛋白浓度测定方法为bradford法，以牛血清白蛋白为标准。
[0058]
(2)最适温度测定
[0059]
在不同温度(55℃-90℃)下，测定原始酶、突变酶eccslg102和eccslg69的酶活。最适温度定义为最高酶活性(以相对活性100％计)所对应的温度。结果如图1所示，原始酶eccslg的最适温度为60℃，突变酶eccslg102的最适温度为50℃，相较于原始酶有着一定程度的下降，突变酶eccslg69的最适温度为75℃，相较于原始酶有较为明显的提高。
[0060]
(3)酶稳定性测定
[0061]
将酶液置于55℃、65℃、75℃下保温2h，测定残余酶活性，以初始酶活为100％计。结果显示原始酶eccslg以及突变酶eccslg102、eccslg69在55℃、65℃以及75℃下酶活稳定，在1h均能保持90％以上的活性。
[0062]
(4)最适ph测定
[0063]
用不同ph值(4.0-11.0)的50mmol/l乙酸-乙酸钠缓冲液配制0.5％(w/v，g/ml)葡聚糖溶液，测量原始酶、突变酶eccslg102和eccslg69的最适ph值。结果表明三种酶在ph9-10活性最高，且原始酶突变前后的ph特性保持一致。
[0064]
(5)金属离子耐受性测定
[0065]
配制0.1m浓度的zn
2+
、ni
+
、mn
2+
、co
2+
、fe
3+
、fe
2+
、na
+
、ca
2+
、k
+
、mg
2+
的金属离子溶液，取40μl加入到反应体系中，分别测定不同金属离子条件下，原始酶、突变酶eccslg69和eccslg102的酶活，其中，以不添加任何金属离子的原始酶的反应体系为空白对照组，空白对照组的原始酶相对活性以100％计，其他实验组酶的相对活性以空白对照为基准进行计算，结果如图2所示。
[0066]
结果显示，与原始酶相比，突变酶eccslg69对于ni
+
、mn
2+
、fe
3+
、fe
2+
、na
+
、ca
2+
、k
+
、mg
2+
的耐受性有不同程度的提高，而突变酶仅对于mn
2+
、fe
3+
、na
+
、ca
2+
、k
+
的耐受性有不同程度的提高。因此，增加了二硫键之间，还在一定程度上增加了突变酶eccslg69金属离子耐受性。
[0067]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。