一种用于检测结直肠癌的双探针组合物及其应用的制作方法

1.本发明属于生物技术及医学领域，具体涉及一种用于检测结直肠癌的双探针组合物及其应用。


背景技术：

2.根据2020年国家癌症中心发布的中国癌症新发病例数前十的癌症分别是：肺癌82万，结直肠癌56万，胃癌48万，乳腺癌42万，肝癌41万，食管癌32万，甲状腺癌22万，胰腺癌12万，前列腺癌12万，宫颈癌11万，这十种癌症占新发癌症数的78%。
3.结直肠癌是我国发病率第二位的癌肿，2020年新发人数约56万，死亡人数约25万人，严重威胁着居民健康。中华医学会检验医学分会分子诊断学组在中华检验医学杂志刊发的《早期结直肠癌和癌前病变实验诊断技术中国专家共识》中指出，人类sdc2基因甲基化检测技术获得了专家认可和推荐，同时共识粪便dna检测是推荐的筛查方法。
4.硫酸类肝素蛋白多糖2基因（sdc2），位于人类8号染色体的长臂上，编码syndecan-2蛋白。研究发现syndecan-2蛋白可介导结直肠癌细胞的粘附等功能，与结直肠癌细胞增殖密切相关。研究证实，相对于正常结直肠组织，sdc2基因在不同分期的结直肠癌和部分肠进展期腺瘤组织中呈现高水平的甲基化现象，提示其具有结直肠癌和肠进展性腺瘤检测的临床价值。sdc2基因甲基化是结直肠癌癌前病变的重要标志物之一。研究人员发现结直肠肿瘤标本sdc2基因调控区甲基化水平显著高于配对的相邻非肿瘤组织，阳性率可达92.9%~100%，且在肿瘤发生的早期阶段甚至腺瘤阶段就可稳定检出。
5.目前市场上已出现有sdc2基因甲基化的相关检测试剂出现，主要是采用常见的荧光pcr方法学进行检测。但受限于现有荧光pcr技术的瓶颈和靶点选择，检测结果存在着特异性低、灵敏度不足等问题，造成一些临床假阴性或假阳性结果。
6.因此，研发一种特异性和灵敏度高的结肠癌检测方法具有重要意义。


技术实现要素：

7.针对现有技术中荧光pcr检测结直肠癌特异性低、灵敏度不足的问题，本发明提供了一种用于检测结直肠癌的双探针组合物及其应用，采用双探针荧光pcr技术，能够明显的提高检测试剂的灵敏度，具有灵敏度高、特异性强的优势。
8.本发明通过以下技术方案实现：一种用于检测结直肠癌的双探针组合物，包括靶标基因sdc2和内参基因actb；所述的靶标基因sdc2包括s-f、s-r、s-p1和s-p2，其核苷酸序列如seq id no . 1~4所示；所述的内参基因actb包括a-f、a-r和a-p1，其核苷酸序列如seq id no . 5~7所示。
9.进一步地，所述的靶标基因sdc2使用fam荧光基团修饰，所述的内参基因actb使用cy5荧光基团修饰。
10.本发明中，所述的探针组合物在制备检测结直肠癌试剂盒中的应用。
11.进一步地，所述的检测结直肠癌试剂盒中s-f、s-r、a-f、a-r在pcr反应预混液中的
浓度为0.2μm，s-p1、s-p2和a-p1的浓度为0.05μm。
12.进一步地，所述的检测结直肠癌试剂盒还包括taq酶和去离子水。
13.本发明于检测结直肠癌的双探针组合物，能够明显提高检测试剂的灵敏度，具备灵敏度高、特异性强的优势，双探针荧光pcr反应原理如下图1所示。
14.有益效果（1）采用双探针荧光pcr技术，能够明显提高检测试剂的灵敏度，具备灵敏度高、特异性强的优势；（2）肠癌检测试剂的引物、探针序列特异，具备灵敏度高、特异性强的优势。
附图说明
15.图1为双探针荧光pcr反应原理；图2为实施例3中10例结直肠癌患者粪便dna检测结果图；图3为实施例3中6例正常人粪便dna检测结果图；图4为实施例4不同浓度下双荧光探针的检测结果图；图5为实施例4不同浓度普通（单荧光）探针的检测结果图。
具体实施方式
16.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
17.实施例1本发明中用于检测结直肠癌的探针组合物，包括靶标基因sdc2和内参基因actb；如下表1所示，所述的靶标基因sdc2包括s-f、s-r、s-p1和s-p2，其核苷酸序列分别为seq id no. 1、seq id no. 2、seq id no. 3和seq id no. 4；所述的内参基因actb包括a-f、a-r和a-p1，其核苷酸序列分别为seq id no. 5、seq id no. 6和seq id no. 7；所述的靶标基因sdc2使用fam荧光基团修饰，淬灭基团是bhq1；内参基因actb使用cy5荧光基团修饰，淬灭基团是bhq2。
18.表1 用于检测结直肠癌的探针组合物核苷酸序列。
19.实施例2由上述实施例1中的探针组合物构成检测结直肠癌试剂盒对检测结直肠癌进行检测，pcr反应预混液组成如下表2：表2 检测结直肠癌pcr反应预混液。
[0020] pcr反应程序如下表3所示：表3 pcr反应程序。
[0021]
实施例3（1）生物样本：10例结直肠癌患者粪便和6例正常人粪便。
[0022]
（2） dna提取：采用鲁抗好丽友生物的粪便核酸提取试剂盒进行提取，步骤如下：1）将粪便采集管中的粪便，涡旋震荡，直至粪便全部混匀，无块状，4000rpm离心5min；2）取1.5 ml上清液至5ml离心管中，再加入0.5 ml lc buffer和10 μlpk溶液，震荡混匀30s，65℃孵育30min，孵育完毕，4000rpm离心5min；3）取1.75ml的上清液至2ml离心管中，12000rpm离心3min；4）取出塑料条，将塑料条卡在仪器架子上，以塑料条上的最大孔为基准，将塑料条上的孔依次命名为1号孔、2号孔、3号孔、4号孔、5号孔；5）1号孔中加入粪便样本1.5 ml的上清液、1.5ml lbb溶液及1.8ml异丙醇，加入90μl磁珠溶液；2号孔中加入1ml wb1；3号孔中加入1ml wb1；向4号孔中加入1ml wb2；5号孔中加入0.5ml wb2；6）取2ml离心管，加入200μl elution buffer，紧挨着塑料条的5号孔，放置于仪器
架子上；7）打开全自动核酸提取仪，在仪器磁棒上套入磁棒套，同时将上述仪器架子放入仪器中；8）在仪器控制面板上设置运行程序，启动程序，如下表4所示；表4 全自动核酸提取仪程序设置9）仪器提取完成后，将2ml离心管取出，12000rpm 离心1min，将上清液转移至1.5ml离心管中，即得到核酸溶液。
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（3）dna转化（亚硫酸盐转化），采用鲁抗好丽友生物的重亚硫酸盐转化试剂盒转化步骤如下：1）取出转化剂zbs01，瞬时离心10 s，依次加入700 μl纯化水、300 μl稀释液zbs02、50 μl缓冲液zbs03，室温旋涡震荡10min;（如不立即使用，置于-20℃保存，使用时升温至37℃，旋涡震荡混匀；2）向6 ml 清洗液zbs05中加入24 ml的无水乙醇，才可使用；3）用qubit测定各个核酸样本的浓度；4）核酸样本浓度应满足≤50 ng/μl，如若超过，稀释至50 ng/μl；5）分别吸取40μl体积的各核酸样本加入各个0.2ml的pcr管中，并做好样本信息标记，再向各个pcr管中分别加入110μl的转化剂zbs01溶液，移液器反复吹打混匀；6）将上述各pcr管置于pcr仪器中处理，并设置程序如下：98℃，10 min；64℃， 2.5 hours；4℃，20 hours；7）取纯化柱zbs08放入收集管zbs09中，加入600 μl结合液zbs04于纯化柱zbs08中；8）将pcr管中的液体全部加入至纯化柱zbs08中，用移液器反复吹打10次混匀，置于离心机中12000 rpm离心30 s，弃掉收集管zbs09中的液体；9）向纯化柱zbs08中加入100 μl清洗液zbs05，12000 rpm离心30 s；10）向纯化柱zbs08中加入200μl脱磺酸液zbs06，室温静置18 min后12000 rpm离心30 s；11）向纯化柱zbs08中加入200 μl清洗液zbs05，12000 rpm离心30 s；
12）再向纯化柱zbs08中加入200 μl清洗液zbs05，12000 rpm离心30 s；13）弃掉收集管zbs09中的液体后12000 rpm离心30 s；14）将纯化柱zbs08置于新的1.5 ml离心管中，向纯化柱zbs08膜上加入18 μl洗脱液zbs07（注意：移液器枪头不要触碰到柱子中的膜）；15）拿起纯化柱zbs08与离心管在桌面上垂直轻轻敲两下，以确保加入的洗脱液zbs07落到纯化柱zbs08中间的膜上，室温静置5min后，12000 rpm离心1 min，即得到转化后的核酸。
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（4）以步骤（3）亚硫酸盐转化后的dna为模板，按照表2中pcr反应预混液组成进行pcr检测，pcr反应程序如表3所示，检测结果如图2和图3所示，图2为10结直肠癌患者粪便dna检测结果图，图3为6例正常人粪便dna检测结果图，检测结果无假阳性和假阴性出现。
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实施例4灵敏度检测（1） 生物样本：肠癌细胞hct116基因组dna、正常肠细胞ccd-18co基因组dna；（2）然后再用纯化水分别稀释至0.5ng/μl（0.01%）、1ng/μl（0.01%）、2ng/μl（0.01%）、5ng/μl（0.01%）；（3）将各个浓度的0.01%比例的dna混合液，分别平分分为2份，全部进行转化处理，转化试剂采用zymo品牌试剂盒进行转化，转化质量为100ng，转化体积为40μl；（4）以步骤（3）中转化后的dna混合液为模板（每个浓度取一份），采用表2中pcr反应预混液组成进行pcr检测，pcr反应程序如表3所示，检测结果如图4所示，由图4可知，本技术探针组合物pcr检测的结果中，0.5ng/μl（0.01%）、1ng/μl（0.01%）、2ng/μl（0.01%）、5ng/μl（0.01%）的全部有扩增曲线出现，且浓度越高，扩增现象越明显；（5）以步骤（3）中转化后的dna混合液为模板（每个浓度取一份），采用下表5中pcr反应预混液组成进行pcr检测，pcr反应程序如表3所示，检测结果如图5所示，由图5可知，只有在5ng/μl（0.01%）的稍微有扩增现象；因此，在同等条件下，双探针荧光pcr检测比普通荧光pcr检测方法的灵敏度要明显提高很多。
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表5实施例4普通探针探针检测体系表
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