一种用于检测硫化氢的荧光探针及其制备方法和应用

1.本发明属于荧光探针技术领域，特别涉及一种用于检测硫化氢的荧光探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.硫化氢(h2s)是一种无色易挥发有臭鸡蛋味毒性的可燃气体，高浓度的硫化氢对人眼和呼吸道等有刺激作用，过量吸入会导致严重的意识丧失，呼吸衰竭甚至死亡。硫化氢也被认为是继一氧化氮(no)和一氧化碳(co)之后的第三种多功能信号生物分子。内源性硫化氢主要是由酶催化产生的，涉及胱硫醚-β-合酶(cbs)，胱硫醚-γ-裂合酶(cse)和3-巯基丙酮酸硫转移酶(mst)与半胱氨酸氨基转移酶(cat)等酶的共同参与。这些酶催化半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的底物在不同组织内产生硫化氢。除了这些酶促途径以外，它还可以通过其他非酶促反应产生，例如多硫化物的代谢和存储硫的释放。内源性硫化氢参与一系列生理过程，包括血管舒张，血管生成，血管系统平滑肌松弛，胰岛素释放，调节炎症。相反，研究表明，不受管制的硫化氢异常浓度可能导致疾病，例如结肠癌，阿尔茨海默氏病，唐氏综合症，糖尿病以及肝硬化。因此，发明一种能快速、方便检测细胞内硫化氢的荧光探针对与硫化氢相关的疾病研究具有重要的科学意义和应用价值。
3.小分子有机荧光探针是一种将分子间的相互作用转换为光学信号传递给外界的工具。因其具有高选择性，高的检测灵敏度、并能实时在线检测等优点被广泛用于生物医学、环境科学等领域。它与特定目标分析物发生作用后，荧光信号会发生变化，以达到检测目的。目前有三种用于硫化氢检测策略的荧光探针，它们分别是对不饱和双键的特异性亲核加成反应、对铜离子的结合反应以及二硝基苯醚的硫解反应等。其中，基于硫解反应的2,4-二硝基苯醚作为硫化氢的识别基团，由于2,4-二硝基氟苯很容易被引入荧光团，并且由于硝基的强淬灭作用，这种探针具有非常低的背景荧光。然而目前所报道的基于二硝基苯醚硫解的硫化氢探针响应时间(约30～60min)还有待提高。因此，很有必要发展一种基于二硝基苯醚硫解反应、具有良好生物稳定性、且合成简单的用于硫化氢快速检测的荧光探针。


技术实现要素：

4.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于检测硫化氢的荧光探针。
5.本发明的另一目的在于提供所述用于检测硫化氢的荧光探针的制备方法。
6.本发明的再一目的在于提供所述用于检测硫化氢的荧光探针的应用。
7.本发明的目的通过下述技术方案实现：
8.一种用于检测硫化氢的荧光探针，该荧光探针的分子式为c
20h11
n3o6s(黄绿色荧光染料，外观呈淡黄色粉末)(hbt-cho-fb)，其化学结构式如式(i)所示：
[0009][0010]
所述的用于检测硫化氢的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0011]
(1)将2-羟基间苯二甲醛和2-氨基苯硫酚加入到无水乙醇中，在室温下进行反应，待反应结束后将反应液真空去除溶剂，然后用硅胶柱层析法纯化，得到黄色固体，即化合物hbt-cho；
[0012]
(2)将步骤(1)中得到的化合物hbt-cho、2,4-二硝基氟苯和碳酸钾加入到乙腈中，在室温条件下进行反应，待反应结束后加入饱和食盐水，用二氯甲烷萃取，再用硅胶层析柱分离纯化，二氯甲烷重结晶，得到化合物hbt-cho-fb，即所述用于检测硫化氢的荧光探针。
[0013]
步骤(1)中所述的2-羟基间苯二甲醛和2-氨基苯硫酚的摩尔比1：0.5～1.5；优选为1：1。
[0014]
步骤(1)中所述的无水乙醇的用量为按每毫摩尔(mmol)2-羟基间苯二甲醛配比2～5ml无水乙醇计算；优选为按每毫摩尔(mmol)2-羟基间苯二甲醛配比5ml无水乙醇计算。
[0015]
步骤(1)中所述的反应的时间为10～15h；优选为12h。
[0016]
步骤(1)中所述的硅胶柱层析为在100～200目硅胶柱中进行色谱分离。
[0017]
所述的硅胶柱层析采用石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱；其中，石油醚与乙酸乙酯的体积比为20:1。
[0018]
步骤(2)中所述的化合物hbt-cho、2,4-二硝基氟苯和碳酸钾的摩尔比为1：2～5：2～5；优选为1：3：3。
[0019]
步骤(2)中所述的乙腈的用量为按每毫摩尔(mmol)化合物hbt-cho配比5～10ml乙腈计算；优选为按每毫摩尔(mmol)化合物hbt-cho配比10ml乙腈计算。
[0020]
步骤(2)中所述的乙腈、饱和食盐水和二氯甲烷的体积比优选为1:3:3。
[0021]
步骤(2)中所述的反应的时间为2～4h；优选为3～4h。
[0022]
步骤(2)中所述的硅胶柱层析为在100～200目硅胶柱中进行色谱分离。
[0023]
所述的硅胶柱层析采用石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱；其中，石油醚与乙酸乙酯的体积比为10:1。
[0024]
所述的用于检测硫化氢的荧光探针在非疾病诊断治疗目的检测硫化氢中的应用。
[0025]
所的检测的对象包括水体环境或活细胞样本等。
[0026]
所的检测包括定性和定量检测。
[0027]
一种检测硫化氢的方法(非疾病诊断治疗目的)，包括如下步骤：
[0028]
(a)将上述用于检测硫化氢的荧光探针加入到溶剂中，配制成ph值为4～7的探针溶液；
[0029]
(b)将待测样品加入到探针溶液中，得到待测样品-探针溶液；
[0030]
(c)采用如下任一种方法进行判断：
[0031]
①
用荧光光谱仪观察待测样品-探针溶液荧光光谱的变化，荧光激发波长为420nm，若在500～650发射波长(em
max
＝532nm)处观察待测样品溶液的荧光强度增强，则说明待测样品含有硫化氢；否则，则认为不含有硫化氢；
[0032]
②
用365nm紫外灯观察待测样品-探针溶液在加入待测样品前后颜色的变化，若加入待测样品后，溶液由无色变为强烈的绿色，则说明待测样品含有硫化氢；否则，则认为不含有硫化氢；
[0033]
③
通过裸眼(肉眼)观察测样品溶液的变化，若加入待测样品后，溶液由无色变为黄色，则说明待测样品含有硫化氢；否则，则认为不含有硫化氢。
[0034]
步骤(a)中所述的溶剂为水、乙腈、pbs缓冲液和生理硫醇中的任意一种；优选为水(ph值为4～7)、乙腈、pbs缓冲液、l-半胱氨酸溶液(cys)、同型半胱氨酸溶液(hcy)、谷胱甘肽(gsh)溶液中的任意一种；进一步优选为乙腈或ph值4～7的pbs缓冲液；更进一步优选为先将上述用于检测硫化氢的荧光探针溶于乙腈中，得到探针母液；然后将探针母液稀释成ph值为4～7的探针溶液。
[0035]
所述的探针母液的浓度为1～5mmol/l；优选为1mmol/l。
[0036]
步骤(b)中所述的待测样品包括水体环境或活细胞样本；其中活细胞样本包括任意的正常细胞或肿瘤细胞；优选为人乳腺癌细胞(mcf-7)。
[0037]
步骤
①
中所述的用荧光光谱仪观察的时间为30秒以上；优选为30秒～10分钟。
[0038]
步骤
①
中所述的荧光光谱仪为分子荧光光谱仪。
[0039]
步骤
①
、
②
和
③
中所述的测样品溶液中探针的浓度10～40μmol/l；优选为20μmol/l。
[0040]
一种定量检测硫化氢的方法，包括如下步骤：
[0041]
(a)将上述用于检测硫化氢的荧光探针加入到溶剂中，配制成ph值为4～7的探针溶液；
[0042]
(b)将硫化氢加入到步骤(a)中得到的探针溶液中，配制至少五个浓度梯度的硫化氢样品溶液，用荧光光谱仪观察荧光光谱的变化，并记录532nm处的荧光强度；再根据荧光强度与硫化氢的浓度，绘制标准曲线，得到线性方程；
[0043]
(c)将待测样品加入到步骤(a)中得到的探针溶液中，得到待测样品溶液；然后用荧光光谱仪观察荧光光谱的变化，并记录532nm处的荧光强度，再根据步骤(b)中得到的线性方程计算待测样品的含量。
[0044]
步骤(a)中所述的溶剂为水、乙腈、pbs缓冲液和生理硫醇中的任意一种；优选为ph值4～7的水、乙腈、pbs缓冲液、l-半胱氨酸溶液、同型半胱氨酸溶液、谷胱甘肽溶液中的任意一种；进一步优选为乙腈或ph值4～7的pbs缓冲液；更进一步优选为先将上述用于检测硫化氢的荧光探针溶于乙腈中，得到探针母液；然后将探针母液稀释成ph值为4～7的探针溶液。
[0045]
所述的探针母液的浓度为1～5mmol/l；优选为1mmol/l。
[0046]
步骤(b)中所述的硫化氢样品溶液中探针的浓度10～40μmol/l(优选为20μmol/l)；硫化氢的浓度范围为0～3000μmol/l(优选为0～200μmol/l；更优选为0～20μmol/l)。
[0047]
步骤(b)和(c)中所述的荧光光谱仪为分子荧光光谱仪。
[0048]
步骤(c)中所述的待测样品包括水体环境或活细胞样本。
[0049]
本发明的核心是利用2,4-二硝基苯筑经典的pet(光致电子转移)淬灭荧光体系，当存在硫化氢时，首先醛基与巯基发生迅速的亲核反应生成巯羟甲基中间体，紧接着进行自发的分子内的硫解反应，快速释放出荧光团2-(2-羟基苯基)苯并噻唑，从而关闭pet效应，导致荧光增强现象。反应机理如图1所示，通过上述方案设计和获得的荧光探针，能快速检测硫化氢的存在，对硫化氢的响应时间为90s，同时探针hbt-cho-fb对硫化氢具有高特异性，检测限可低到11nm；此外探针hbt-cho-fb在0～20μm硫化氢浓度范围具有良好的线性响应。本发明的硫化氢荧光探针作用于含硫化氢的水溶液，采用荧光光谱仪观察荧光光谱峰值达到最大所需时间，可以通过观察荧光光谱的变化程度判断硫化氢的含量，从而达到检测硫化氢的目的。
[0050]
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0051]
(1)本发明提供了一种用于硫化氢检测的荧光探针，简称为探针hbt-cho-fb，是一种基于2-(2-羟基苯基)苯并噻唑衍生物与硫化氢特异性识别基团2,4-二硝基苯醚的硫解反应产物，首先二硝基苯醚容易引入荧光团，且由于硝基的强淬灭作用，这种探针具有非常低的荧光背景，同时有很强的信噪比，更为重要的是，与传统的基于硫解反应的探针相比，hbt-cho-fb通过引入邻位的醛基，使硫解反应从分子间转变为分子内，从而极大地提高反应速率，实现超快检测硫化氢的目的；总的来说，hbt-cho-fb对样本中微量硫化氢具有极好的识别性能，其结构简单，合成步骤少(两步合成)，成本低廉以及易操作等特点，克服了现有的硫化氢荧光探针响应时间缓慢，特异性低等缺点。
[0052]
(2)本发明中的探针hbt-cho-fb可以检测水环境或活细胞样本中是否含有硫化氢，还能进行定量检测，具体为：
①
用分子荧光光谱仪测试(激发波长为420nm)，如果在500～650发射波长(em
max
＝532nm)范围内观察待测液的荧光强度增强，则说明待测液可以对硫化氢产生响应；
②
用裸眼和365nm紫外灯观察待测样品-探针溶液在加入待测样品前后颜色的变化，若加入待测样品后，裸眼观察到溶液由无色变成黄色或者在365nm紫外灯光照下溶液由无色变为强烈的绿色，则说明待测液与硫化氢响应；
③
用共聚焦荧光显微镜在532nm通道处的荧光变化，若出现强烈的绿色荧光，说明hbt-cho-fb可以对h2s进行检测，否则，则不能。
[0053]
(3)本发明中的荧光探针能够通过巯羟甲基中间体的缩合进一步进行分子内硫解对硫化氢进行检测，对环境中微量硫化氢具有极好的识别性能，且该荧光探针除了能快速检测硫化氢的存在外，在一定的硫化氢浓度范围具有良好的线性响应，因此，可将其用于水环境或生物样本中硫化氢的定性和定量检测。
附图说明
[0054]
图1是本发明的反应机理图。
[0055]
图2是实施例1中探针hbt-cho-fb的1h nmr图谱。
[0056]
图3是实施例1中探针hbt-cho-fb的
13
c nmr图谱。
[0057]
图4是实施例2中探针hbt-cho-fb加入硫化氢前后肉眼或用365nm紫外灯观察颜色的变化图；其中，(a)为肉眼观察结果(由无色变为黄色)；(b)365nm紫外灯下的观察结果(由无色变为强烈的绿色)。
[0058]
图5是实施例2探针hbt-cho-fb对不同浓度硫化氢的荧光滴定图(图中，在532nm处的荧光峰值，从下至上，硫化氢浓度依次为0～3000μm中探针hbt-cho-fb的荧光光谱)。
[0059]
图6是实施例2中探针hbt-cho-fb在532nm处的荧光强度随硫化氢浓度的变化图。
[0060]
图7是实施例2中探针hbt-cho-fb在532nm处的荧光强度在0～20μm范围内的线性关系图。
[0061]
图8是实施例3中探针hbt-cho-fb的荧光强度与硫化氢的响应时间关系图。
[0062]
图9是实施例3中探针hbt-cho-fb的荧光强度在532nm处与硫化氢的响应时间关系图。
[0063]
图10是实施例4中探针hbt-cho-fb在532nm处的荧光强度随ph值变化图。
[0064]
图11是在实施例5中荧光探针hbt-cho-fb与常见离子或生物小分子在加入硫化氢反应前后的荧光光谱图(图中，1.k
+
，2.no
2-，3.hpo
42-，4.hco
3-，5.zn
2+
，6.na
+
，7.cl-，8.nh
4+
，9.f-，10.ch3coo-，11.h2po
42-，12.hso
3-，13.s2o
32-，14.co
32-、15.so
42-，16mg
2+
、17.cys、18.hcy、19.gsh、20.nahs、21.black)。
[0065]
图12是在实施例6中荧光探针hbt-cho-fb的荧光强度比与常见离子或生物小分子在加入硫化氢反应前后的荧光对比柱形图(图中，1.k
+
，2.no
2-，3.hpo
42-，4.hco
3-，5.zn
2+
，6.na
+
，7.cl-，8.nh
4+
，9.f-，10.ch3coo-，11.h2po
42-，12.hso
3-，13.s2o
32-，14.co
32-、15.so
42-，16mg
2+
、17.cys、18.hcy、19.gsh、20.black)。
[0066]
图13是在实施例7中荧光探针hbt-cho-fb在mcf-7中的细胞毒性与探针浓度在0、10、20、40、60、80、100μm的对比柱形图。
[0067]
图14在实施例8中荧光探针hbt-cho-fb在mcf-7细胞中的细胞成像图(标尺为20μm)；其中，a为仅含探针在mcf-7细胞中的细胞成像；b为探针加硫化氢在mcf-7细胞中的细胞成像；c为探针加n-乙基马来酰亚胺(nem)在mcf-7细胞中的细胞成像。
具体实施方式
[0068]
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
[0069]
实施例1：探针hbt-cho-fb的合成
[0070]
(1)将2-羟基间苯二甲醛(0.6g，4mmol)溶于20ml的无水乙醇中，随后在4h内将2-氨基苯硫酚(0.5g，4mmol)分三次加入反应体系中。室温下反应，反应液呈现黄色并观察到黄色固体。12h后原料消耗完毕(tlc点板监测)，停止反应，待反应结束后直接将反应液真空除去溶剂，再用硅胶层析柱分离纯化(硅胶100～200目)，洗脱液比例为石油醚/乙酸乙酯＝20：1(v/v)，得到化合物hbt-cho，为黄色固体；
[0071]
(2)化合物hbt-cho(1mmol)与2,4-二硝基氟苯(3mmol)、k2co3(3mmol)按1：3：3摩尔比用10ml乙腈溶解，室温反应3～4h，反应结束后加入30ml饱和食盐水，用30ml二氯甲烷萃取2～3次，再用硅胶层析柱分离纯化(硅胶100～200目)，洗脱液比例为石油醚/乙酸乙酯＝10：1(v/v)，随后利用二氯甲烷重结晶法将粗产物重结晶，得到淡黄色固体粉末，即荧光探针hbt-cho-fb(反应机理见图1)。
[0072]
所述的荧光探针hbt-cho-fb的合成路线如下所示：
[0073][0074]
探针hbt-cho-fb的核磁表征如图2和图3所示：
[0075]1h nmr(500mhz,chloroform-d)δ10.23(s,1h),8.98(d,j＝2.7hz,1h),8.77(dd,j＝7.9,1.8hz,1h),8.21(dd,j＝9.2,2.7hz,1h),8.18(dd,j＝7.6,1.8hz,1h),8.04(dt,j＝8.3,0.9hz,1h),7.89(dt,j＝8.0,0.8hz,1h),7.77(t,j＝7.8hz,1h),7.53(ddd,j＝8.3,7.1,1.2hz,1h),7.44(ddd,j＝8.2,7.2,1.2hz,1h),6.77(d,j＝9.2hz,1h).
[0076]
13
c nmr(126mhz,chloroform-d)δ187.37,159.37,155.81,152.56,150.60,144.75,142.00,136.95,135.45,133.96,129.29,129.05,128.42,128.13,126.88,126.24,123.69,122.45,121.63,116.02.
[0077]
实施例2：探针hbt-cho-fb对不同浓度硫化氢的荧光滴定
[0078]
取实施例1制备的探针hbt-cho-fb溶于乙腈中，制成浓度为1mm探针母液；将硫氢化钠固体(质量分数为99％)加入到蒸馏水中，并用振动机振动均匀，配制成硫化氢浓度为1mm的硫化氢母液。配制磷酸盐缓冲盐溶液(pbs)(0.01mm，ph＝6.8)的光谱溶液，每根试管1ml。从探针母液中取出20μl加入到含有1ml光谱溶液的小试管当中(探针的终浓度为20μm)，再加入不同浓度的硫化氢(终浓度：0，5，10，15，20，30，50，100，200，300，400，600，800，1000，1500，2000，3000μm)。用分子荧光光谱仪测试探针与不同当量硫化氢反应液的荧光光谱变化。同时，从探针母液中取出20μl加入到含有1ml光谱溶液的小试管当中(探针的终浓度为20μm)，再加入终浓度为1mm的硫化氢，肉眼或者用365nm紫外灯观察待测溶液在加入硫化氢前后颜色的变化，肉眼观察待测液由无色变为黄色或者365紫外光照射下待测液由无色变为强烈的绿色，则说明待测液与硫化氢响应，如图4。荧光光谱变化情况如图5所示。
[0079]
图6是实施例2探针hbt-cho-fb随不同浓度硫化氢的加入，hbt-cho-fb的荧光强度与所加硫化氢的浓度之间的线性关系图。在532nm处的荧光峰值，从下至上，硫化氢浓度范围为0～3000μm中探针hbt-cho-fb的荧光光谱。由图可见，随着加入不同当量的硫化氢，在532nm处荧光峰值逐渐增强。当硫化氢浓度为200μm时，在532nm处荧光峰值增强300倍。
[0080]
图7是实施例2中探针hbt-cho-fb在532nm处的荧光强度在0～20μm范围(硫化氢终浓度：0，5，10，15，20)内的线性关系图。检测限计算公式为：detection limit＝3σ/k；其中，σ为11次空白样品(不加硫化氢)的标准方差，k为荧光强度与硫化氢浓度的线形拟合直线的斜率。计算得到检测下限为11nm。
[0081]
实施例3：探针hbt-cho-fb对硫化氢的响应时间关系
[0082]
为考察探针对硫化氢的响应时间，取实施例1制备的探针hbt-cho-fb溶于乙腈中，制成浓度为1mm探针母液；将硫氢化钠(质量分数为99％)加入到蒸馏水中，配制成硫化氢浓度为20mm的硫化氢母液。室温下，用一次性吸管移取探针母液加入到石英比色皿中，同时加入终浓度为硫化氢溶液，使得探针浓度在20μm，硫化氢浓度在1mm。在0s、30s、60s、90s、1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min时测试探针与硫化氢反应的荧
光强度变化(532nm)。
[0083]
结果如图8和图9所示：从图中可以看出，经过30s后，探针溶液的荧光值已增强达到160倍，此后从90秒至10分钟都趋于平稳。
[0084]
实验例4：荧光探针hbt-cho-fb对不同ph的响应研究
[0085]
为考察探针对硫化氢的ph变化，取实施例1制备的探针hbt-cho-fb溶于乙腈中，制成浓度为1mm探针母液；将硫氢化钠(质量分数为99％)加入到蒸馏水中，配制成硫化氢浓度为1mm的硫化氢母液。室温下，用一次性吸管移取20μl上述探针母液加入到含有浓度为0.01mm且不同ph(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)pbs缓冲溶液的ep管中，同时加入终浓度为1mm的硫化氢溶液，静置5min后，分别取400μl于比色皿中进行测量。
[0086]
结果如图10所示：从图中可以看出，在ph为4～7范围内，hbt-cho-fb可以有效地进行测量硫化氢。
[0087]
实施例5：荧光探针hbt-cho-fb对常见分析物的选择性研究
[0088]
按实施例3中的方法，配制探针母液(1mm)，然后取出20μl加入到3ml的离心管中，相同条件下取出21等份，分别加入以下分析物：空白(不加分析物，black)，终浓度分别为1mm的氟化铵，1mm的氯化钠、1mm的硫酸镁、1mm的硫酸锌、1mm的碳酸氢钠、1mm的磷酸氢二钠、1mm的醋酸、1mm的磷酸二氢钠、1mm的亚硫酸氢钠、1mm的硫代硫酸钠、1mm的亚硝酸钾、1mm的碳酸钠、1mm的l-半胱氨酸、1mm的同型半胱氨酸、1mm的谷胱甘肽、1mm的硫化氢(配制方法同实施例2)，混合均匀后，分别取400μl不同分析物的混合溶液来检测此混合溶液的荧光光谱变化。
[0089]
结果如图11所示：从图中可以发现，相对于纯探针测试液，加入k
+
，no
2-，hpo
42-，hco
3-，zn
2+
，na
+
，cl-，nh
4+
，f-，ch3coo-，h2po
42-，hso
3-，s2o
32-，co
32-、so
42-，mg
2+
、cys、hcy、gsh、black的测试液荧光强度变化不明显。然而加入硫化氢后溶液的荧光强度发生了显著增强。实验结果说明探针对硫化氢具有良好的选择性。
[0090]
实验例6：荧光探针hbt-cho-fb对常见分析物的抗干扰性研究
[0091]
按实施例3中的方法，配制探针母液(1mm)，然后取出20μl加入到3ml的离心管中，相同条件下取出20等份，分别加入以下分析物：终浓度分别为1mm的氟化铵，1mm的氯化钠、1mm的硫酸镁、1mm的硫酸锌、1mm的碳酸氢钠、1mm的磷酸氢二钠、1mm的醋酸、1mm的磷酸二氢钠、1mm的亚硫酸氢钠、1mm的硫代硫酸钠、1mm的亚硝酸钾、1mm的碳酸钠、1mm的l-半胱氨酸、1mm的同型半胱氨酸、1mm的谷胱甘肽和一组空白对照(black)，混合均匀后探针终浓度为20μm。分别在20管中各取400μl混合溶液来检测此混合溶液的荧光光谱变化(与硫化氢反应前)；然后分别在20管内添加终浓度为1mm的硫化氢(配制方法同实施例2)，混合均匀后，分别取400μl上述探针待测液与不同分析物和硫化氢的混合溶液来检测此混合溶液的荧光光谱变化(与硫化氢反应后)。
[0092]
结果如图12所示：从图中可以发现，相对于对照组纯探针测试液，加入k
+
，no
2-，hpo
42-，hco
3-，zn
2+
，na
+
，cl-，nh
4+
，f-，ch3coo-，h2po
42-，hso
3-，s2o
32-，co
32-、so
42-，mg
2+
、cys、hcy、gsh、black的测试液荧光强度变化不明显。进一步加入硫化氢后，荧光强度有很明显的增强。实验结果说明探针hbt-cho-fb对硫化氢具有良好的抗干扰性。
[0093]
实施例7：荧光探针hbt-cho-fb的细胞毒性实验
[0094]
从培养瓶消化mcf-7细胞(常规市售)传到96孔板内，然后放回培养箱孵育12h保证
细胞的存活贴壁。继而用pbs(0.01mm，ph＝6.8)清洗培养基三遍，按实施例3中的方法，配制探针母液(1mm)，然后取出0、10、20、40、60、80、100μl加入到1.5ml的ep管中，分别加入细胞培养液(dmem,gibco,grand island,new york)至1ml，此时将这7个不同浓度的探针溶液各取100μl加入到其中35个孔板中，每个浓度设有相应的5个副孔。放入培养箱孵育1h，继而将上清液吸出并将其用pbs清洗一遍，再加入20μl噻唑蓝(mtt)，孵育4h后吸出再加入150μl的乙腈，振荡10min，最后用酶标仪在490nm处测吸光度。
[0095]
结果如图13所示：探针浓度在80μm以内时，细胞存活率大于80％，有较好的存活性；而当探针浓度大于80μm时，细胞存活率低于80％，表明探针对细胞造成了损伤。实验结果说明探针有良好的mcf-7细胞毒性。
[0096]
实施例8：荧光探针hbt-cho-fb的活细胞成像实验
[0097]
先用200μl，ph6.8的培养液(dmem,gibco,grand island,new york)润洗共聚焦培养皿，处理后保证皿底部润湿，再从培养瓶消化1ml mcf-7细胞到ep管内，分别取200μl细胞传到4个共聚焦培养皿上，孵育24h。继而用pbs(0.01mm，ph＝6.8)将共聚焦培养皿清洗三遍。设置a，b，c三个待测皿，将配置好的10μm探针hbt-cho-fb取200μl到a皿，培养30min，然后用pbs清洗三遍；将b皿加入200μm nahs培养30min，继续用pbs清洗三遍，最后将配置好的10μm探针hbt-cho-fb取200μl加入其中；将c皿加入200μm nahs培养30min，接着用pbs清洗三遍，然后加入n-乙基马来酰亚胺(nem)培养30min，继续用pbs清洗三遍，最后将配置好的10μm探针hbt-cho-fb取200μl加入其中培养30min。最后，所有培养皿加入无血清的dmem培养基(其含有各种非必需氨基酸)，用共聚焦荧光显微镜(ex/em＝420/532nm)成像。
[0098]
结果如图14所示：仅孵育探针的培养皿中观察到微弱的绿色荧光(图14a)；先孵育h2s，再孵育探针的培养皿中显示强烈的绿色荧光(图14b)；而nem(一种巯基的氧化抑制剂)后，再先后孵育h2s和探针的培养皿则基本观察不到任何绿色荧光(图14c)。这些结果说明探针hbt-cho-fb可以在活细胞内检测硫化氢。
[0099]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。