一种多肽MDOSR3及其合成方法与应用与流程

一种多肽mdosr3及其合成方法与应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种多肽mdosr3及其合成方法与应用。


背景技术：

2.骨肉瘤是好发于儿童和青少年最为常见的原发性恶性骨肿瘤，在上世纪80年代以前，医学界治疗骨肉瘤的共识普遍为截肢，且5年生存率仅为20％；20世纪80年代后期随着新辅助化疗药物的联合应用的推广，使得骨肉瘤5年生存率提高至50％-70％；其中，阿霉素是新辅助化疗药物的重要组成部分，然而，骨肉瘤化疗耐药现象的出现是目前临床上造成骨肉瘤患者化疗失败的主要原因。
3.肿瘤化疗耐药的发生是一个多因素，多阶段和多基因相互作用的复杂过程，是肿瘤细胞抵抗化疗药物的主要防御机制；多种途径均可导致骨肉瘤化疗耐药：
①
化疗药物在细胞内积蓄量的减少或外排增加；
②
胞内药物酶代谢的异常；
③
细胞凋亡调控基因表达的异常；
④
肿瘤微环境中细胞之间的相互作用；
⑤
肿瘤代谢相关信号通路的改变；
⑥
氧化应激稳态的失衡等；虽然科学家针对这些途径进行大量研究，但是目前仍然没有找到解决骨肉瘤化疗耐药的办法。
4.随着蛋白质组学的迅速发展，许多10～50个氨基酸组成的多肽也受到了研究者的瞩目。多肽具有高度特异性、自然可降解性、易于合成，并且可以进行简单地化学修饰等优势，已成为抗肿瘤药物研发的热点。据报道，stat3结合肽可有效降低各种癌细胞(黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌和脑癌)中stat下游分子的表达，且在异种移植和同种异体移植肿瘤动物模型中表现出强大的抗肿瘤效果。最值得注意的是，固有免疫系统刺激剂米伐木肽已被正式在欧洲批准用以临床用药，临床研究表明对于无转移可切除的骨肉瘤患者，在新辅助化疗的基础上联合米伐木肽，能将6年骨肉瘤患者的总生存率从70％提高至78％；此外，全世界已有数十种抗肿瘤的活性肽进入临床试验阶段，例如plitidepsin和hyd-pep06等。
5.因此，开发能逆转骨肉瘤耐药的功能肽具有临床应用前景。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种多肽mdosr3及其合成方法与应用。
7.为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
8.本发明的第一方面是提供一种多肽mdosr3，所述多肽mdosr3为：
9.(a)由aemgskgvtagkiasnvqkklt(seq id no：1)所示的氨基酸序列组成；或
10.(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有逆转骨肉瘤阿霉素耐药性的多肽。
11.优选地，所述多肽mdosr3为在前述氨基酸序列的n段添加rkkrrqrrr(seq id no：2)所示的氨基酸序列。
12.优选地，所述多肽mdosr3的n端由乙酰化进行修饰，所述多肽mdosr3的c端由酰胺
化进行修饰。
13.本发明的第二方面是提供一种上述多肽mdosr3的合成方法，所述合成方法为固相合成法。
14.优选地，所述固相合成法的步骤包括：
15.以氨基树脂为固相载体，将所述氨基树脂置于反应器中，依次进行洗涤、脱保护处理以及脱保护检测；依次将所述多肽mdosr3自c端至n端的氨基酸连接在所述氨基树脂上，每连接一个氨基酸后均需进行脱保护处理以及脱保护检测；待所有氨基酸连接完成后，将多肽与所述氨基树脂间进行切割处理，依次进行离心沉降、洗涤离心、冷冻干燥、hplc分离纯化以及冻干后，即得所述多肽mdosr3。
16.更优选地，所述脱保护检测为茚三酮法检测。
17.本发明的第三方面是提供一种上述多肽mdosr3在制备逆转骨肉瘤阿霉素耐药性生物制剂中的应用。
18.本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
19.本发明的多肽mdosr3为小分子多肽，具有分子量小和易于修饰等优势，能够进入细胞内部，逆转骨肉瘤耐药性。
附图说明
20.图1为实施例2中cck8实验的结果图；
21.图2为实施例2中凋亡实验的结果图；
22.图3为实施例2中蛋白印迹的结果图；
23.图4为实施例2中动物实验的结果图；
24.图1-4中的dox均为阿霉素。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
27.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
28.实施例1：多肽mdosr3的合成
29.取氨基树脂3g(0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(dcm)浸泡1h；使用树脂3倍体积的氮-二甲基甲酰胺(dmf)洗涤树脂，抽干，洗涤四次后抽干待用；加入20％哌啶(哌啶/dmf＝1:4)50ml，摇床摇晃20min，脱去fmoc基团；分别用3倍树脂体积dmf洗涤2次、甲醇洗涤2次、dmf洗涤2次，抽干；取少量树脂，茚三酮(九井水合茚三酮)法检测，树脂显色颜色即脱保护成功；
30.将一定量的苏氨酸(即c端的第一个氨基酸)和3倍摩尔量的1-羟基-苯骈三唑(hobt)置于50ml离心管，加入20ml dmf、3ml n,n-二异丙基碳二亚胺(dic)振荡摇匀1min，
溶液澄清后加入反应器并置于30℃摇床。2小时后抽干溶液，dmf洗涤两遍，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐：diea:dcm＝1:1:2)半小时，3倍树脂体积的dmf洗涤四次，抽干待用；加入一定量20％哌啶(哌啶/dmf＝1:4)，脱色摇床摇晃20min脱去fmoc基团；分别用3倍树脂体积的dmf洗涤2次、甲醇洗涤2次、dmf洗涤2次，抽干；取少量树脂用茚三酮法检测，树脂显色颜色即脱保护成功；
31.称取后面一个氨基酸和hobt于50ml离心管，加入20ml的dmf、3ml的dic振荡摇匀1min，溶液澄清后加入反应器并置于30℃的摇床；1小时后，取少量树脂用茚三酮法检测，无色说明反应完全；待反应完全，dmf洗涤树脂四次，抽干，加入一定量的20％哌啶，脱色摇床摇晃20min脱去fmoc基团；分别用3倍树脂体积的dmf洗涤2次、甲醇洗涤2次、dmf洗涤2次，抽干，取少量树脂用茚三酮法检测；
32.重复上述步骤以将所述多肽mdosr3自c段至n段的氨基酸依次连接在所述氨基树脂上；
33.待最后一个精氨酸连接上，脱去保护，dmf洗涤4遍，甲醇洗涤4遍，抽干；95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3,异丙基硅烷:水＝95:2:2:1)将多肽从树脂上切割下来(10ml切割液/g树脂)，冰乙醚(切割液:乙醚＝1:9)离心沉降，乙醚洗涤离心3次，冷冻干燥粗品，hplc分离纯化，冻干。
34.即得所述多肽mdosr3：ac-rkkrrqrrraemgskgvtagkiasnvqkk lt-nh2(seq id no：3)。
35.实施例2：多肽mdosr3对骨肉瘤耐药性的作用
36.1、cck8实验
37.胰酶消化细胞后接种于96孔板中；采用倍比稀释法配置含有不同浓度的阿霉素(10μm、5μm、2.5μm、1.25μm、0.625μm、0.3125μm、0.15625μm、0.078125μm和0μm)和mdosr3(0μm、0.5μm、1μm、2μm和5μm)的培养基，每孔加入200μl相应浓度的培养基，在24h和48h测定药物ic50；在相应时间点，以10％cck8试剂(东仁，日本)和90％培养基的比例配置混合试剂，弃去96孔板中旧培养基，向每孔加入混合试剂100ml，在培养箱中孵育1-4h后，在酶标仪上测量450nm的吸光度(opticaldensity，od)值；使用prismv5.0c软件绘制拟合曲线及计算ic50；
38.结果如图1所示，2μmol/l mdosr3能够改善骨肉瘤细胞株对阿霉素的敏感性，其ic50在mdosr3作用下从0.461μg/ml下降到0.110μg/ml。
39.2、凋亡实验
40.采用annexin v fitc/pi双染试剂盒(索莱宝，中国)通过流式检测mdosr3在化疗药诱导os细胞凋亡中的作用，另设一组用浓度为0.05μg/ml的阿霉素处理用作单染管以调节流式补偿及电压；药物作用24h和48h后，收集所有细胞包括漂浮细胞，利用annexin v-fitc和pi进行流式检测(beckman，美国)，记录四个象限的细胞比例；
41.结果如图2所示，流式检测结果发现2μmol/l mdosr3在骨肉瘤细胞株mg63/dox中能增加阿霉素诱导骨肉瘤细胞凋亡比例。
42.3、蛋白印迹
43.提取细胞蛋白样品，利用bca法定量蛋白浓度，经过制胶、上样、电泳和转膜等一系列操作后，在脱脂牛奶中进行封闭，加入一抗c-parp(cst，美国)孵育过夜，加入一定浓度的
二抗抗体，利用ecl工作液显影；
44.结果如图3所示，2μmol/l mdosr3在骨肉瘤细胞株mg63中能增加阿霉素诱导c-caspase-3的表达的上调。
45.4、动物实验
46.取处于对数生长期的mg63细胞，当细胞密度达到80％-90％时，胰酶消化细胞并收集于试管中，用pbs洗涤细胞并在半小时内接种到裸鼠皮下；用1ml注射器吸取100μl细胞悬液，细胞数量大约为5
×
107，用左手拇指和食指捏紧裸鼠颈背部皮肤，小拇指夹住裸鼠尾巴，右手用注射器针尖挑起背侧皮肤，针头伸入约1cm，将细胞缓慢打入裸鼠皮下，避免液体溢出(每组3只，共4组)；待其瘤块体积形成50mm3左右大小给药，阿霉素采用腹腔注射，每周连续给药2天；mdosr3每日腹腔注射1次；分成4组：pbs；5mg/kg mdosr3；2mg/kg阿霉素；5mg/kg mdosr3联合2mg/kg阿霉素；2周后处死小鼠；
47.结果如图4所示，联合用药组可以完全抑制瘤块体积的增加，而单独低剂量阿霉素用药却无法有效控制肿瘤生长。
48.综上所述，本发明的多肽mdosr3为小分子多肽，具有分子量小和易于修饰等优势，能够进入细胞内部，逆转骨肉瘤耐药性。
49.以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。