1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种提高虫草素含量的蛹虫草菌培养基组合物、液体发酵方法及虫草素制备方法。
背景技术：
2.蛹虫草为子囊菌门，肉座目，麦角菌科、虫草属的模式种。学名为cordycepsmilitaris(l.exfr.)link.蛹虫草，又叫北冬虫夏草，北虫草，简称蛹草，一般把活体虫蛹培养的北虫草称为蛹虫草，两者是同种真菌，但在营养成分上含量相差较大。
3.蛹虫草世界性分布，天然资源数量很少。1950年，德国科学家cunningham观察到被蛹虫草寄生的昆虫组织不易腐烂，进而从中分离出一种抗菌性物质，3'-脱氧腺苷，定名为虫草素。蛹虫草，多感染鳞翅目昆虫的蛹，由子座(即草部分，又称子实体)与菌核(即昆虫的尸体部分)两部分组成的复合体，简单来说，就是虫体与草的结合。中医认为，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是一种能同时平衡、调节阴阳的中药。
4.现代研究表明，蛹虫草菌丝体中虫草素的含量高于蛹虫草菌子实体，从蛹虫草菌丝体中提取虫草素，具有菌丝体生长速度快，发酵步骤简单、易于控制等优点，从菌丝体中提取虫草素可以缩短生产时间、提高生产效率。
5.鉴于此，本发明提供一种生产蛹虫草菌丝体发酵培养基组合物及其发酵方法与虫草素制备方法。
技术实现要素：
6.本发明的目的在于提供一种提高虫草素含量的蛹虫草菌培养基组合物、液体发酵方法及虫草素制备方法。
7.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
8.第一方面，本发明提供一种提高虫草素含量的蛹虫草菌培养基组合物，蛹虫草菌培养基组合物包括黄芪药渣、青枣粉、破壁刀豆粉、菊花花粉、石膏、硫酸镁。
9.进一步地，在本发明较佳的实施例中，按重量份数计，黄芪药渣为5～15份、青枣粉20～30份、破壁刀豆粉为6～16份、菊花花粉为0.3～1份、石膏为0.6～1份、硫酸镁为0.3～1份。
10.进一步地，在本发明较佳的实施例中，按重量份数计，蛹虫草菌培养基组合物还包括2,4-d。
11.进一步地，在本发明较佳的实施例中，按重量份数计，黄芪药渣为8～12份、青枣粉23～27份、破壁刀豆粉为9～11份、菊花花粉为0.3～1份、石膏为0.6～1份、硫酸镁为0.3～1份和2,4-d为0.0006～0.0010份。
12.进一步地，在本发明较佳的实施例中，按重量份数计，黄芪药渣为10份、青枣粉25
份、破壁刀豆粉为10份、菊花花粉为0.7份、石膏为0.8份、硫酸镁为0.7份、2,4-d为0.0008份。
13.第二方面，本发明提供一种蛹虫草菌丝体液体发酵方法，其包括：
14.蛹虫草菌丝体液体发酵培养基中黄芪药渣5～15g/l、青枣粉20～30g/l、破壁刀豆粉为6～16g/l、菊花花粉为0.3～1g/l、石膏为0.6～1g/l、硫酸镁为0.3～1g/l，加蒸馏水补充到规定量，ph6.2～6.8，121℃灭菌15～30min后冷却制得液体培养基，将蛹虫草菌母种按常规接种后进行液体发酵，在22℃，暗室培养7d后，光下培养，温度23～25℃，通风并搅拌，发酵时间6～10d，将培养好的发酵液过滤或离心3500～8000rpm处理，发酵上清液备用，收集菌丝体，经过洗涤、干燥得到蛹虫草菌丝体。
15.进一步地，蛹虫草菌丝体液体发酵培养基中所述黄芪药渣为8～12g/l、青枣粉23～27g/l、破壁刀豆粉为9～11g/l、菊花花粉为0.3～1g/l、石膏为0.6～1g/l、硫酸镁为0.3～1g/l和2,4-d为0.0006～0.0010g/l，加蒸馏水补充到规定量，ph6.2～6.8，121℃灭菌15～30min后冷却制得液体培养基，将蛹虫草菌母种按常规接种后进行液体发酵，在22℃，暗室培养7d后，光下培养，温度24℃，通风并搅拌，发酵时间8d，将培养好的发酵液离心4000rpm处理，发酵上清液备用，收集菌丝体，经过洗涤、干燥得到蛹虫草菌丝体。
16.进一步地，在本发明较佳的实施例中，蛹虫草菌丝体液体发酵培养基中所述黄芪药渣为10g/l、青枣粉25g/l、破壁刀豆粉为10g/l、菊花花粉为0.7g/l、石膏为0.8g/l、硫酸镁为0.7g/l和2,4-d为0.0008g/l，加蒸馏水补充到规定量，ph6.2～6.8，121℃灭菌15～30min后冷却制得液体培养基，将蛹虫草菌母种按常规接种后进行液体发酵，在22℃，暗室培养7d后，光下培养，温度24℃，通风并搅拌，发酵时间8d，将培养好的发酵液离心4000rpm处理，发酵上清液备用，收集菌丝体，经过洗涤、干燥得到蛹虫草菌丝体。
17.第三方面，本发明还提供蛹虫草菌丝体虫草素制备方法，其包括：常规方法粉碎后，菌丝体粉末与水以1﹕13～1﹕23的比例混合，调节ph值为7～9，水浴85～98℃，搅拌提取3～5h，4000rpm离心取上清液；浓缩所得上清液至原来体积的10～20％，加入30～35％的乙醇，4000rpm离心并收集上清液；离心后的菌丝体残渣按上述提取步骤再提取1～2次，合并上清液；上清液与发酵上清液合并后经过d101大孔树脂层析，解析液经过浓缩干燥得虫草素。
18.进一步地，在本发明较佳的实施例中，常规方法粉碎后，菌丝体粉末与水以1﹕18的比例混合，水浴为90℃，乙醇浓度为33％。
19.本发明中液体发酵所用蛹虫草菌母种按常规方法制备。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
21.蛹虫草菌的菌丝体干重、虫草素量、虫草素纯度与现有技术相比，均有显著提高。
具体实施方式
22.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
23.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：
24.实施例1
25.蛹虫草菌丝体液体发酵培养基中黄芪药渣5g/l、青枣粉30g/l、破壁刀豆粉6g/l、菊花花粉为1g/l、石膏为0.8g/l、硫酸镁0.3g/l，加蒸馏水补充到规定量，ph6.8，121℃灭菌30min后冷却。
26.将蛹虫草菌母种按常规接种后进行液体发酵，在22℃，暗室培养7d后，光下培养，温度25℃，通风并搅拌，发酵时间6d，将培养好的发酵液离心6000rpm处理，发酵上清液备用，收集菌丝体，经过洗涤、干燥得到蛹虫草菌丝体。
27.常规方法粉碎后，菌丝体粉末与水以1﹕13的比例混合，调节ph值为9，水浴85℃，搅拌提取5h，4000rpm离心取上清液；浓缩所得上清液至原来体积的20％，加入30％的乙醇，4000rpm离心并收集上清液；离心后的菌丝体残渣按上述提取步骤再提取2次，合并上清液；上清液与发酵上清液合并后经过d101大孔树脂层析，解析液经过浓缩干燥得虫草素。
28.实施例2
29.蛹虫草菌丝体液体发酵培养基中黄芪药渣15g/l、青枣粉20g/l、破壁刀豆粉为16g/l、菊花花粉为0.3g/l、石膏为0.8g/l、硫酸镁为1g/l，加蒸馏水补充到规定量，ph6.2，121℃灭菌15min后冷却。
30.将蛹虫草菌母种按常规接种后进行液体发酵，在22℃，暗室培养7d后，光下培养，温度23℃，通风并搅拌，发酵时间10d，将培养好的发酵液用60kg的压力进行板框压滤，收集菌丝体，经过洗涤、干燥得到蛹虫草菌丝体。
31.常规方法粉碎后，菌丝体粉末与水以1﹕23的比例混合，调节ph值为7，水浴98℃，搅拌提取3h，4000rpm离心取上清液；浓缩所得上清液至原来体积的10％，加入35％的乙醇，4000rpm离心并收集上清液；离心后的菌丝体残渣按上述提取步骤再提取1次，合并上清液；上清液与发酵上清液合并后经过d101大孔树脂层析，解析液经过浓缩干燥得虫草素。
32.实施例3
33.蛹虫草菌丝体液体发酵培养基中黄芪药渣为8g/l、青枣粉27g/l、破壁刀豆粉为9g/l、菊花花粉为1g/l、石膏为0.8g/l、硫酸镁为0.3g/l和2,4-d为0.0006g/l，加蒸馏水补充到规定量，ph6.8，121℃灭菌20min后冷却。
34.将蛹虫草菌母种按常规接种后进行液体发酵，在22℃，暗室培养7d后，光下培养，温度23℃，通风并搅拌，发酵时间10d，将培养好的发酵液离心2800rpm处理，发酵上清液备用，收集菌丝体，经过洗涤、干燥得到蛹虫草菌丝体。
35.常规方法粉碎后，菌丝体粉末与水以1﹕13的比例混合，调节ph值为9，水浴85℃，搅拌提取5h，4000rpm离心取上清液；浓缩所得上清液至原来体积的20％，加入30％的乙醇，4000rpm离心并收集上清液；离心后的菌丝体残渣按上述提取步骤再提取2次，合并上清液；上清液与发酵上清液合并后经过d101大孔树脂层析，解析液经过浓缩干燥得虫草素。
36.实施例4
37.蛹虫草菌丝体液体发酵培养基中黄芪药渣为12g/l、青枣粉23g/l、破壁刀豆粉为11g/l、菊花花粉为0.3g/l、石膏为0.8g/l、硫酸镁为1g/l和2,4-d为0.0010g/l，加蒸馏水补充到规定量，ph6.5，121℃灭菌20min后冷却。
38.将蛹虫草菌母种按常规接种后进行液体发酵，在22℃，暗室培养7d后，光下培养，温度24℃，通风并搅拌，发酵时间8d，将培养好的发酵液离心3000rpm处理，发酵上清液备
用，收集菌丝体，经过洗涤、干燥得到蛹虫草菌丝体。
39.常规方法粉碎后，菌丝体粉末与水以1﹕23的比例混合，调节ph值为7，水浴98℃，搅拌提取3h，4000rpm离心取上清液；浓缩所得上清液至原来体积的10％，加入35％的乙醇，4000rpm离心并收集上清液；离心后的菌丝体残渣按上述提取步骤再提取1次，合并上清液；上清液与发酵上清液合并后经过d101大孔树脂层析，解析液经过浓缩干燥得虫草素。
40.实施例5
41.蛹虫草菌丝体液体发酵培养基中黄芪药渣为10g/l、青枣粉25g/l、破壁刀豆粉为10g/l、菊花花粉为0.7g/l、石膏为0.8g/l、硫酸镁为0.7g/l和2,4-d为0.0008g/l，加蒸馏水补充到规定量，ph6.5，121℃灭菌25min后冷却。
42.将蛹虫草菌母种按常规接种后进行液体发酵，在22℃，暗室培养7d后，光下培养，温度24℃，通风并搅拌，发酵时间8d，将培养好的发酵液离心4000rpm处理，发酵上清液备用，收集菌丝体，经过洗涤、干燥得到蛹虫草菌丝体。
43.常规方法粉碎后，菌丝体粉末与水以1﹕18的比例混合，调节ph值为8，水浴90℃，搅拌提取4h，4000rpm离心取上清液；浓缩所得上清液至原来体积的15％，加入33％的乙醇，4000rpm离心并收集上清液；离心后的菌丝体残渣按上述提取步骤再提取1次，合并上清液；上清液与发酵上清液合并后经过d101大孔树脂层析，解析液经过浓缩干燥得虫草素。
44.对比例1
45.蛹虫草菌丝体液体发酵培养基中葡萄糖为10g/l、黄芪药渣为10g/l、青枣粉25g/l、破壁刀豆粉为10g/l、菊花花粉为0.7g/l、石膏为0.8g/l、硫酸镁为0.7g/l和2,4-d为0.0008g/l，加蒸馏水补充到规定量，ph6.5，121℃灭菌25min后冷却。
46.将蛹虫草菌母种按常规接种后进行液体发酵，在22℃，暗室培养7d后，光下培养，温度24℃，通风并搅拌，发酵时间8d，将培养好的发酵液离心4000rpm处理，发酵上清液备用，收集菌丝体，经过洗涤、干燥得到蛹虫草菌丝体。
47.常规方法粉碎后，菌丝体粉末与水以1﹕18的比例混合，调节ph值为8，水浴90℃，搅拌提取4h，4000rpm离心取上清液；浓缩所得上清液至原来体积的15％，加入33％的乙醇，4000rpm离心并收集上清液；离心后的菌丝体残渣按上述提取步骤再提取1次，合并上清液；上清液与发酵上清液合并后经过d101大孔树脂层析，解析液经过浓缩干燥得虫草素。
48.对比例2
49.蛹虫草菌丝体液体发酵培养基中蛋白胨为10g/l、黄芪药渣为10g/l、青枣粉25g/l、破壁刀豆粉为10g/l、菊花花粉为0.7g/l、石膏为0.8g/l、硫酸镁为0.7g/l和2,4-d为0.0008g/l，加蒸馏水补充到规定量，ph6.5，121℃灭菌25min后冷却。
50.将蛹虫草菌母种按常规接种后进行液体发酵，在22℃，暗室培养7d后，光下培养，温度24℃，通风并搅拌，发酵时间8d，将培养好的发酵液离心4000rpm处理，发酵上清液备用，收集菌丝体，经过洗涤、干燥得到蛹虫草菌丝体。
51.常规方法粉碎后，菌丝体粉末与水以1﹕18的比例混合，调节ph值为8，水浴90℃，搅拌提取4h，4000rpm离心取上清液；浓缩所得上清液至原来体积的15％，加入33％的乙醇，4000rpm离心并收集上清液；离心后的菌丝体残渣按上述提取步骤再提取1次，合并上清液；上清液与发酵上清液合并后经过d101大孔树脂层析，解析液经过浓缩干燥得虫草素。
52.对比例3
53.蛹虫草菌丝体液体发酵培养基中党参药渣为10g/l、黄芪药渣为10g/l、青枣粉25g/l、破壁刀豆粉为10g/l、菊花花粉为0.7g/l、石膏为0.8g/l、硫酸镁为0.7g/l和2,4-d为0.0008g/l，加蒸馏水补充到规定量，ph6.5，121℃灭菌25min后冷却。
54.将蛹虫草菌母种按常规接种后进行液体发酵，在22℃，暗室培养7d后，光下培养，温度24℃，通风并搅拌，发酵时间8d，将培养好的发酵液离心4000rpm处理，发酵上清液备用，收集菌丝体，经过洗涤、干燥得到、蛹虫草菌丝体。
55.常规方法粉碎后，菌丝体粉末与水以1﹕18的比例混合，调节ph值为8，水浴90℃，搅拌提取4h，4000rpm离心取上清液；浓缩所得上清液至原来体积的15％，加入33％的乙醇，4000rpm离心并收集上清液；离心后的菌丝体残渣按上述提取步骤再提取1次，合并上清液；上清液与发酵上清液合并后经过d101大孔树脂层析，解析液经过浓缩干燥得虫草素。
56.对比例4
57.蛹虫草菌丝体液体发酵培养基中葡萄糖为10g/l、青枣粉25g/l、破壁刀豆粉为10g/l、菊花花粉为0.7g/l、石膏为0.8g/l、硫酸镁为0.7g/l和2,4-d为0.0008g/l，加蒸馏水补充到规定量，ph6.5，121℃灭菌25min后冷却。
58.将蛹虫草菌母种按常规接种后进行液体发酵，在22℃，暗室培养7d后，光下培养，温度24℃，通风并搅拌，发酵时间8d，将培养好的发酵液离心4000rpm处理，发酵上清液备用，收集菌丝体，经过洗涤、干燥得到蛹虫草菌丝体。
59.常规方法粉碎后，菌丝体粉末与水以1﹕18的比例混合，调节ph值为8，水浴90℃，搅拌提取4h，4000rpm离心取上清液；浓缩所得上清液至原来体积的15％，加入33％的乙醇，4000rpm离心并收集上清液；离心后的菌丝体残渣按上述提取步骤再提取1次，合并上清液；上清液与发酵上清液合并后经过d101大孔树脂层析，解析液经过浓缩干燥得虫草素。
60.对比例5
61.蛹虫草菌丝体液体发酵培养基中蛋白胨为10g/l、黄芪药渣为10g/l、青枣粉25g/l、菊花花粉为0.7g/l、石膏为0.8g/l、硫酸镁为0.7g/l和2,4-d为0.0008g/l，加蒸馏水补充到规定量，ph6.5，121℃灭菌25min后冷却。
62.将蛹虫草菌母种按常规接种后进行液体发酵，在22℃，暗室培养7d后，光下培养，温度24℃，通风并搅拌，发酵时间8d，将培养好的发酵液离心4000rpm处理，发酵上清液备用，收集菌丝体，经过洗涤、干燥得到蛹虫草菌丝体。
63.常规方法粉碎后，菌丝体粉末与水以1﹕18的比例混合，调节ph值为8，水浴90℃，搅拌提取4h，4000rpm离心取上清液；浓缩所得上清液至原来体积的15％，加入33％的乙醇，4000rpm离心并收集上清液；离心后的菌丝体残渣按上述提取步骤再提取1次，合并上清液；上清液与发酵上清液合并后经过d101大孔树脂层析，解析液经过浓缩干燥得虫草素。
64.对比例6
65.蛹虫草菌丝体液体发酵培养基中黄芪药渣为10g/l、青枣粉25g/l、刀豆粉为10g/l、菊花花粉为0.7g/l、石膏为0.8g/l、硫酸镁为0.7g/l和2,4-d为0.0008g/l，加蒸馏水补充到规定量，ph6.5，121℃灭菌25min后冷却。
66.将蛹虫草菌母种按常规接种后进行液体发酵，在22℃，暗室培养7d后，光下培养，温度24℃，通风并搅拌，发酵时间8d，将培养好的发酵液离心4000rpm处理，发酵上清液备用，收集菌丝体，经过洗涤、干燥得到、蛹虫草菌丝体。
67.常规方法粉碎后，菌丝体粉末与水以1﹕18的比例混合，调节ph值为8，水浴90℃，搅拌提取4h，4000rpm离心取上清液；浓缩所得上清液至原来体积的15％，加入33％的乙醇，4000rpm离心并收集上清液；离心后的菌丝体残渣按上述提取步骤再提取1次，合并上清液；上清液与发酵上清液合并后经过d101大孔树脂层析，解析液经过浓缩干燥得虫草素。
68.对比例7
69.蛹虫草菌丝体液体发酵培养基中黄芪药渣为12g/l、青枣粉30g/l、破壁刀豆粉为12g/l、菊花花粉为0.84g/l、石膏为0.96g/l、硫酸镁为0.84g/l和2,4-d为0.00096g/l，加蒸馏水补充到规定量，ph6.5，121℃灭菌25min后冷却。
70.将蛹虫草菌母种按常规接种后进行液体发酵，在22℃，暗室培养7d后，光下培养，温度24℃，通风并搅拌，发酵时间8d，将培养好的发酵液离心4000rpm处理，发酵上清液备用，收集菌丝体，经过洗涤、干燥得到蛹虫草菌丝体。
71.常规方法粉碎后，菌丝体粉末与水以1﹕18的比例混合，调节ph值为8，水浴90℃，搅拌提取4h，4000rpm离心取上清液；浓缩所得上清液至原来体积的15％，加入33％的乙醇，4000rpm离心并收集上清液；离心后的菌丝体残渣按上述提取步骤再提取1次，合并上清液；上清液与发酵上清液合并后经过d101大孔树脂层析，解析液经过浓缩干燥得虫草素。
72.本发明的有益效果如下表：
[0073] 虫草素量(g/l)虫草素纯度(％)实施例112.886.6实施例213.787.9实施例313.589.5实施例415.290.8实施例516.892.5对比例19.580.0对比例28.676.1对比例39.079.6对比例49.281.2对比例58.978.5对比例68.679.9对比例710.582.4
[0074]
从上表可以看出，本发明实施例1～5中利用本发明提高虫草素含量的蛹虫草菌培养基组合物进行液体发酵得到的虫草素含量、虫草素纯度与对比例1～7相比，均有显著提高。
[0075]
本发明中未详细说明的环节均为本领域普通技术人员可自行选择的公知常识。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域普通技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。