技术特征：
1.一种利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)针对基因zmisa2设计基于crispr/cas9的sgrna作用位点；所述sgrna作用位点的核苷酸序列为：zmisa2：5
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gcggagatacggacacaccgcgg-3’；seq id no.4；(2)以pcbc-mt1t2质粒为模板，mt1t2-f，mt1t2-f0为引物，pcr扩增目的片段；所述引物序列如下：mt1t2-f：5
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aataatggtctcaggcgcctttgatgaactgacgca-3’；seq id no.5；mt1t2-f0：5
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gcctttgatgaactgacgcagttttagagctagaaatagc-3’；seq id no.6；(3)针对基因zmisa3、zmzpu1设计基于crispr/cas9的sgrna作用位点；所述sgrna作用位点的核苷酸序列为：zmisa3：5
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accacgacgaaagttcagagcgg-3’；seq id no.7；和zmzpu1：5
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tggtcagactgagaacagcgcgg-3’；seq id no.8；(4)以pcbc-mt1t2质粒为模板，mt1t2-f’，mt1t2-f0’，mt1t2-r0’，mt1t2-r’为引物，pcr扩增目的片段；所述引物序列如下：mt1t2-f’：5
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aataatggtctcaggcgccacgacgaaagttcagag-3’；seq id no.9；mt1t2-f0’：5
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gccacgacgaaagttcagaggttttagagctagaaatagc-3’；seq id no.10；mt1t2-r0’：5
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cgctgttctcagtctgacccgcttcttggtgcc-3’；seq id no.11；mt1t2-r’：5
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attattggtctctaaaccgctgttctcagtctgacc-3’；seq id no.12；(5)将步骤(2)和步骤(4)获得的目的片段分别与载体pbue411进行酶切连接，分别构建得到zmisa2基因编辑载体pbue411-1gr-zmisa2和zmisa3、zmzpu1基因编辑载体pbue411-2gr-zmisa3-zmzpu1；(6)将步骤(5)获得的基因编辑载体pbue411-1gr-zmisa2和pbue411-2gr-zmisa3-zmzpu1分别单独转入农杆菌lba4404，进行玉米遗传转化，获得pbue411-1gr-zmisa2载体阳性植株和pbue411-2gr-zmisa3-zmzpu1载体阳性植株；经杂交和自交以及筛选鉴定获得类胡萝卜素含量高的玉米材料。2.根据权利要求1所述的一种利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法，其特征在于，步骤(2)所述pcr扩增反应体系为：pcbc-mt1t2质粒1μl，mt1t2-f0.5μl，mt1t2-f00.5μl，2
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mix 10μl，ddh2o 8μl；pcr扩增反应程序为：98℃3min；98℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min，4℃∞。3.根据权利要求1所述的一种利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法，其特征在于，步骤(4)所述pcr扩增反应体系为：pcbc-mt1t2质粒1μl，mt1t2-f’0.5μl，mt1t2-f0’0.5μl，mt1t2-r0’0.5μl，mt1t2-r’0.5μl，2
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mix 10μl，ddh2o 7μl；pcr扩增反应程序为：98℃3min；98℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min，4℃∞。4.根据权利要求1所述的一种利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法，其特征在于，步骤(5)所述酶切连接反应体系如下：目的片段2μl，pbue4112μl，10xneb t4 buffer 1.5μl，10xbsa 1.5μl，bsai 1μl，t4 ligase 1μl，ddh2o 6μl，total 15μl。
技术总结
本发明公开了一种利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法，属于基因工程技术领域。本发明公开的一种利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法，通过CRISPR/Cas9技术对玉米ZmIsa2、ZmIsa3、ZmZpu1基因同时进行基因编辑，并进一步筛选获得含目的基因突变片段的突变体材料，这些玉米籽粒类胡萝卜素含量提高的材料具有重要的育种价值。胡萝卜素含量提高的材料具有重要的育种价值。胡萝卜素含量提高的材料具有重要的育种价值。
技术研发人员：宋广树 吕庆雪 周迎鑫 孙蕾 周德龙
受保护的技术使用者：吉林省农业科学院
技术研发日：2022.04.09
技术公布日：2022/7/5