一种利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法

1.本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法。


背景技术：

2.类胡萝卜素是一类具有独特结构和功能的重要天然色素，在光养和非光养生物中广泛分布，目前已经有超过700种天然类胡萝卜素被鉴定，其化学多样性非常丰富。类胡萝卜素通过化学或酶转化成其他衍生物，如维生素a、植物激素或芳香类化合物等；维生素a缺乏症是全世界主要微量营养素缺乏症之一。研究表明富含类胡萝卜素的饮食(主要由水果和蔬菜组成)具有促进健康作用，同时有助于降低患某些癌症及心血管、眼睛、皮肤或骨骼疾病的风险。由于类胡萝卜素无法通过人体自身合成，而是在食物中与其他分子如糖类、蛋白质或脂肪酸相结合从而被人体摄取，因此研究人体从膳食中摄取及吸收类胡萝卜素的效率及其影响因素至关重要。
3.类胡萝卜素还作为饲料添加剂，对动物正常生长、发育具有特殊意义，如常见的“无症状”发热、延期排卵、卵泡囊肿、黄体减少以及胎盘停滞、繁殖发育障碍等症状，添加后均可得到很大程度的改善。另外，产蛋鸡在添加富含类胡萝卜素的饲料后，提高产蛋率的同时蛋黄颜色也会加深，提高其营养价值。本发明可以使普通玉米籽粒中类胡萝卜素含量提高2倍，具有重要的饲用价值。
4.传统高胡萝卜素玉米材料的创制主要是通过回交转育的方法，往往需要经过6个回交世代，不仅耗时长，同时经常伴随基因冗余，导致一些非目标性状的导入，限制了改良材料的应用效果。
5.类胡萝卜素是人类发现的第一种天然色素，类胡萝卜素长链分子的主链通常是由9～11个共轭c＝c键构成，其线性链的长度对应于分子铆钉穿透膜的疏水区的厚度，从而在某些真菌与动物体内起到增强细胞膜脂质功能的作用。类胡萝卜素通常根据分子组成分为两类：一类指在多烯主链的一端或两端有碳氢环的非极性类胡萝卜素(如β-胡萝卜素、番茄红素)，另一类是指结构中具有含氧基团-oh(如叶黄素)，＝o(如斑蝥黄素)，oh与＝o的结合(如虾青素)，或醇酯(如岩藻黄素)的极性类胡萝卜素。在生物体所含天然磷脂双分子层膜中，分子两端带有羟基和/或氧基的极性类胡萝卜素如叶黄素，以垂直于磷脂膜表面的长轴方向定位于磷脂的极性头，将导致脂质烷基链的运动自由度降低，模型膜和生物膜中水和氧的通透性降低，这些效应被称为膜中的固化效应；而不含氧的β-胡萝卜素中对称的脂肪链与磷脂的非极性部分发生非共价结合，增加磷脂头极性基团的运动自由度，导致膜结构的流动性增强，因此类胡萝卜素的数量与种类是影响膜功能的重要参数。类胡萝卜素的机械特性在进化后期用于保护蛋白质的相关结构，暴露的类胡萝卜素外部结构能够与蛋白质相互结合，从而对环境条件产生一定抵抗性。
6.因此，提供一种利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供了一种利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法。
8.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.一种利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法，具体步骤如下：
10.(1)针对基因zmisa2设计基于crispr/cas9的sgrna作用位点；
11.所述sgrna作用位点的核苷酸序列为：
12.zmisa2：5
’‑
gcggagatacggacacaccgcgg-3’；seq id no.4；
13.(2)以pcbc-mt1t2质粒为模板，mt1t2-f，mt1t2-f0为引物，pcr扩增目的片段；
14.所述引物序列如下：
15.mt1t2-f：5
’‑
aataatggtctcaggcgcctttgatgaactgacgca-3’；seq id no.5；
16.mt1t2-f0：5
’‑
gcctttgatgaactgacgcagttttagagctagaaatagc-3’；seq id no.6；
17.(3)针对基因zmisa3、zmzpu1设计基于crispr/cas9的sgrna作用位点；
18.所述sgrna作用位点的核苷酸序列为：
19.zmisa3：5
’‑
accacgacgaaagttcagagcgg-3’；seq id no.7；和
20.zmzpu1：5
’‑
tggtcagactgagaacagcgcgg-3’；seq id no.8；
21.(4)以pcbc-mt1t2质粒为模板，mt1t2-f’，mt1t2-f0’，mt1t2-r0’，mt1t2-r’为引物，pcr扩增目的片段；
22.所述引物序列如下：
23.mt1t2-f’：5
’‑
aataatggtctcaggcgccacgacgaaagttcagag-3’；seq id no.9；
24.mt1t2-f0’：5
’‑
gccacgacgaaagttcagaggttttagagctagaaatagc-3’；seq id no.10；
25.mt1t2-r0’：5
’‑
cgctgttctcagtctgacccgcttcttggtgcc-3’；seq id no.11；
26.mt1t2-r’：5
’‑
attattggtctctaaaccgctgttctcagtctgacc-3’；seq id no.12；
27.(5)将步骤(2)和步骤(4)获得的目的片段分别与载体pbue411进行酶切连接，分别构建得到zmisa2基因编辑载体pbue411-1gr-zmisa2和zmisa3、zmzpu1基因编辑载体pbue411-2gr-zmisa3-zmzpu1；
28.(6)将步骤(5)获得的基因编辑载体pbue411-1gr-zmisa2和pbue411-2gr-zmisa3-zmzpu1分别单独转入农杆菌lba4404，进行玉米遗传转化，获得pbue411-1gr-zmisa2载体阳性植株和pbue411-2gr-zmisa3-zmzpu1载体阳性植株；经杂交和自交以及筛选鉴定获得类胡萝卜素含量高的玉米材料。
29.进一步，步骤(2)所述pcr扩增反应体系为：pcbc-mt1t2质粒1μl，mt1t2-f 0.5μl，mt1t2-f00.5μl，2
×
mix 10μl，ddh2o 8μl；pcr扩增反应程序为：98℃3min；98℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min，4℃∞。
30.进一步，步骤(4)所述pcr扩增反应体系为：pcbc-mt1t2质粒1μl，mt1t2-f’0.5μl，mt1t2-f0’0.5μl，mt1t2-r0’0.5μl，mt1t2-r’0.5μl，2
×
mix 10μl，ddh2o 7μl；pcr扩增反应程序为：98℃3min；98℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min，4℃∞。
31.进一步，步骤(5)所述酶切连接反应体系如下：目的片段2μl，pbue4112μl，10xneb t4 buffer 1.5μl，10xbsa 1.5μl，bsai 1μl，t4 ligase 1μl，ddh2o 6μl，total 15μl。
32.将每个sgrna作用位点通过不同表达盒串联到同一基因编辑载体上。
33.携带cas9的载体为pbue411。
34.所述玉米为自交系c01。
35.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法，基因编辑技术能精准对目的基因进行编辑，并且没有外缘基因的导入，本发明通过基因编辑技术精准敲除淀粉合成分支修饰相关基因zmisa2、zmisa3和zmzpu1，可以精准提高玉米籽粒类胡萝卜素含量，并且不改变其它农艺性状。
36.本发明首次揭示了玉米zmisa2、zmisa3和zmzpu1基因共同作用的生物学功能，通过crispr/cas9技术对玉米zmisa2、zmisa3和zmzpu1基因进行基因编辑，并进一步筛选获得含目的基因片段缺失的突变体材料，这些类胡萝卜素含量提高的材料具有重要的育种价值。本发明创制的玉米类胡萝卜素含量提高的材料属于类胡萝卜素含量显著提高的材料，其它形态学和产量性状无显著变化，通过合理的栽培管理措施可以应用于杂交玉米生产。
附图说明
37.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
38.图1附图为本发明野生型和突变型测序比对结果；
39.图2附图为本发明野生型和突变型玉米籽粒中类胡萝卜素含量检测结果。
具体实施方式
40.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.本发明利用基因编辑技术提高玉米籽粒类胡萝卜素含量，针对玉米中的目标基因zmisa2、zmisa3和zmzpu1设计基于crispr/cas9的sgrna序列，将含有编码所述sgrna序列的dna片段连接到携带cas9的载体中，用构建的载体转化玉米(如农杆菌介导法)，实现对基因zmisa2、zmisa3和zmzpu1的定点突变，进而获得zmisa2、zmisa3和zmzpu1基因功能缺失的玉米植株。
42.实施例1基因编辑载体的构建
43.(1)淀粉去分支酶基因zmisa2，其核苷酸序列如下：
44.atggcctcctccctccccgcgccgccggcctcgccctcttcctcctggcgcggactcacgccccgctgccctccgcctcgctgcggtcccctcctcgcccgcgcggtagcgcgttcttaccgttaccgcttccgaaccgacgacgacggcgtggtggacgtggccgtcgccgggaaagacggcgatgcggggtatgtggtcgctatcgaggctcctacccatggacagaggggcggtcttgtgctccgccccgccggctccggcgagggcgtccctctggccccagccgcgccgggaggtgccctcgtggctgagttgtcctacgacgtggcccgcgcgccgttccacgtctcgttcacgctggccgacgcg
atgggagcggagatacggacacaccgcgggacgagcttccgcgtgcctgttggcgtcggacggggctgcccctcgccgctcggcctgtcccagtccaaggatggggccgctaacttcgcggtttacagcaagatcgccaagggcatggtgctctgcctcttcggtggtggcggcggggacggacccgcgctggagattgagctcgacccgtacgtccaccggaccggcgatgtctggcacgtctcgatggagagcgtggaggggtacgcccgctacggcttccgcagcgggctgttcgcaatgtttggcattgaccgcccgctactcgacccgtacgccaaggtgatcggggacttcgtcgctggcgactctgttgatgaggatgggctagctgtgccatccataaggtgtctcgcgtccttgaagaatgcacccaactacgattggggcagggacaagcacccatgcttgccattggagaagctggtggtctaccgggcaaatgtggctttgttcaccaaggataggtcgagtcggctggcagacaatgccgctggtactttctccggcatgtctgcaaaggtggaacacttcaggcatcttggtgtcaatgcagttttgctggagccagttttcccattccaccaagtgaagggaccatattttccataccattttttttcacctatgagcttgtatagcagtgaatgctccagtgtttcagctatcaagtctatgaaggatatggtcaaaacaatgcacagaaatgggatagaggttctcttggaggttgttttcacgcatactgctgaaggaggggcggagtgtcagatgatatcacttcgaggcatcgatggttcctcgtactacattgctgatggaatcgctggatgcaaggcaagtgtgttgaattgcaaccatccagtgactcagaagctgattttggacagcctccgccattgggtgctcgacttccatgttgatgggttctgcttcatcaatgctcctttcctcgtcagaggtccacgtggtgagggcctctcacggcctccacttctggaagccatagcatttgatcctgttctttcaaagactaagatcattgcagatccttggtctccgcttgacatatctaatgtgcaatttccattccctcattggaaaagatgggctgagatgaacacaagattctctatggatgtgcgcaagtttcttaagggagaagcacttatcagtgatcttgctacacgtttgtgtggcagtggggacttattttcctcaagggccccagcattttcgttcaattatgtatccaggaattctggactcactcttgttgatctagtgagcttcagcagtgatgagcttgcttctgagttcagctggaattgtggtgaagaaggaccatcggagaacaacgcagtccttcaaaccaggctaagacagatacgcaacttcttgtttattctattcatttcccttggtattcctgttcttaacatgggggatgaatgtggaaactcagctgctggttcaacatcatacaaggatagagggcctctgaactggaaagccttgaagaccgcttttgttaaggaagttaccgggtttatttcgtttctatctgcactaaggagtcgacgagcagacattttccagagatgcgagtttctaaaacttgaaaatatacattggtatgggagtgatttatctgagccatgttgggaggatcctactagcaactttctttgcttgcacataaatgcagagctggacgagaagctaccagattcgactggaggtgatttgtatatctgtttcaatgcaaacgaggagtcagcgagtgctactttaccagctattgcagaaggatccatgtggctgcgcttggttgatacatcacttgcatttccaggtttcttttccagagggtctagtcatgaaacacaccaggtgctaggattttcctcatatcaagtgaaggcacatagctgtgttctgttcgaatccaagagggttctttcatag；seq id no.1。
45.(2)淀粉去分支酶基因zmisa3，其核苷酸序列如下：
46.atggattccgtcggtacaaatcggcccccgctgcgccccgttgccgccgcagctactcgacgcagcgcgctcctgcgcccccctagccacctcgggctcggcaatcgttttgcggagactaagcttgggatcgcgtcagggtgtggaggaggaggagggtattttggaaaggtacagggatttgatgccttgcggagtaccacgacgaaagttcagagcgggaaggcggggaggagtgtgaccaaggaaatgggacacacttcatctggcaatgaagtgcccttgaaatattcttcaggcaaagccttccccctaggagtgtcacaagttgacgatgggttaaattttgcaatattctcacaacatgcttcttctgtcaccctttgcttgaattttcctgagagaggcaaccaagatgatgtggacattgtagagtttgctttagaccgccagaagaacaaaactggagatatatggcatgtgtcagtggagggtttgcctgcttctggtgttctttatgggtatcgcattaatggtcctcaagggtggcaacaaggtcatagatttgatgacagcgttattcttctggacccctatgcaaaattagtttatggtcgaaagcactttgctgttgaaaaagagaagccaagccagcttttcggaacatatgatttcgatagctcaccttttgactggggtgacaattataagcttcctaatttgcctgagacagatcttgttatatatgaaatgaatgtccgtgccttcactgccgacgagtcaagcaggcttgctccagctattcgtggaagttaccttggtgtcatt
gataaaattcctcatttgctggaacttggcgttaatgcagtggaactacttcctgtttttgagttcgatgagctggagttgaagaggttccctaacccaagggaccacatggtaaatacatggggatattctacaatcaacttttttgcgcccatgagtcgttatgctagtgctggtggtggacctgtggctgcttccaaagagctcaaacagatggtcaaggcatttcataattctggaattgaggttattttggatgtagtttacaaccatacaaatgaagctgatgatgttaacccttacatgacttcctttcgtggtattgataacaaggtctattacatgttagatctcaacaacagtgcacagctgctgaacttctcgggttgcgggaatacactaaactgcaaccatcctgttgtcaaggagcttgtacttgacagtttaagacattgggttaaggagtatcacatagatggatttcggtttgaccttgcgagtgttctttgtcgtggaccagatggcagtcctcttgatgcacctccacttattaaggaaattgccaaagactctgtattgtctagatgtaagatcattgctgaaccttgggactgtggtggcctttatctagtagggaggttccctaattgggacaggtgggctgaatggaacgggaagtacagagatgatattcgaagatttattaagggagatcctggtatgaagggggtgtttgcaactcgcgtttctggttctgcagatctctaccaggtgaacaatcggaagccttaccatagtgtgaactttgtaattgctcatgatggatttactttatgtgaccttgtttcatataactccaagcacaatgatgcaaatggagaaggtggtcgtgatgggtgcaatgacaactacagctggaactgtggcattgaaggagaaacaaatgatttgaatgtgctaagtcttcgttcaaggcaaatgaagaacttccatgtggcattaatgatttcccagggtactccaatgatgctgatgggagatgaatatggtcacacacgttatggaaacaacaatagctatggacatgatactcacataaataattttcagtggggccagttggaagaaaggaaggatggccatttcaggtttttctcagagatgatcaagtttcggcataaccatcctatattgagacgagacaggtttctcaacaaaaatgatgtcacttggcatgaaaatcgttgggagaaccaggacagcaaatttttggcatttacgatacatgatcacagttctggtggagacatctatttggcattcaatgctcatgagtattttgtggatgctgtaattcccccaccaccacaccataaatcttggagtcgtgtggtggataccaacctggaatcaccaaaggatattgtcccagaaggggtgccattcacaggttcagggtacaggattgctccctactcttccatcttgcttaaggcaaagccttag；seq id no.2。
47.(3)淀粉去分支酶基因zmzpu1，其核苷酸序列如下：
48.atgttgctccacgccggtccctcgttcctgctcgcaccacctccgcgctttgccgccgctccgtcgtcagcttcgccgaggcgatccaggacaccgcaatcctcgccgccgacgtcgcatttcgcgcgccccgctgatcccgtggcccaaagggtgcgtcccgtcgcgccgaggccccccatggcgacggcggaggagggcgccagctctgacgtcggcgtcgccgtcgccgagtccgcacaggggttcttgttggatgcgagggcttactgggtgacaaaatccttgattgcatggaatatcagtgatcagaaaacttctctcttcttatatgcaagcagaaatgctacaatgtgcatgtcgagtcaggatatgaaaggttatgattccaaagttgagctgcaaccagaaaatgatggacttccatccagtgtgacccagaaattcccttttatcagctcttatagagccttcagaattccgagctccgttgatgttgccaccttggtgaaatgtcaacttgctgttgcttcatttgatgctcatgggaacaggcaagatgttactgggttgcaactacctggagtattggatgacatgttcgcctacactggaccgcttggtactatttttagtgaagaagctgatgtaagtgtgagcttctatgatggtccagctggccctttactggaaacagttcaactcaacgagttaaatggtgtttggagtgttactggtccaaggaactgggagaaccggtattatctatatgaagtcacagtatatcatcaaactacaggaaacattgagaaatgtttagccgctgatccttatgctagagggctttctgcaaatagcacacgaacttggttggttgatattaataatgaaacattaaagccacttgcctgggatggattggcggctgaaaagccaaggcttgattccttctctgacataagcatatatgaattgcacattcgtgatttcagtgcccatgatagcacagtggactgtcctttccgaggaggtttctgtgcatttacatttcaggattctgtaggcatagaacacctaaagaaactatctgatgccggtttgactcatgtccatttgttgccaagctttcaatttggtggtgttgatgacataaagagcaattggaaatgtgttgatgagattgaactgtcaaaactccctccagggtcagatttgcaacaagctgcaattgtggctattcaggaagaggacccttataattgggggtataaccctgtggtttggggcgttccaaaaggaagctatgcaagtaacccagatggtccaagtcgtatcattgagtaccggctgatggtgcagg
ccttgaatcgcttaggtcttcgagttgtcatggatgttgtatacaatcatctatactcaagtggcccttttgccatcacttccgtgcttgacaagattgtacctggatactacctcagaagggactctaatggtcagactgagaacagcgcggctgtgaacaatacagcaagtgagcatttcatggttgatagattaatcgtggatgaccttctgaattgggcagtaaattacaaagttgacgggttcagatttgatctaatgggacatatcatgaaaaagacaatgattagagcaaaatcggctcttcaaagccttacaattgatgaacatggagtagatggttcaaagatatacttgtatggtgaaggatggaacttcggtgaagttgcggaaaatcaacgtgggataaatggatcccagctaaatatgagtggcactgggattggtagtttcaacgatagaatccgtgatgctataaatggtggcagtccgtttgggaatccactgcaacaaggtttctctactggattgttcttagagccaaatggattttatcagggcaatgaaacagagacaaggctcacgcttgctacatacgctgaccatatacagattggattagctggcaatttgaaggactatgtagttatatctcatactggagaagctagaaaaggatctgaaattcgcaccttcgatggctcaccagttggctatgcttcatcccctatagaaacaataaactacgcctctgctcatgacaatgaaacactatttgatattattagtctaaagactccgatggacctctcaattgacgagcgatgcaggataaatcatttgtccacaagcatgattgcattatcccagggaataccattttttcatgctggtgatgagatactacgatctaagtcgcttgatcgagattcatatgactctggtgattggtttaacaagattgattttacctatgaaacaaacaattggggtgttgggcttccaccaagagaaaagaacgaagggagctggcctttgatgaagccaagattggagaacccgtcgttcaaacctgcaaaacatgacattattgctgccttagacaaatttattgatatcctcaagatcagatactcatcacctctctttcgcctaactacagcaagtgatattgtgcaaagggttcactttcacaacacagggccctccttggttccaggagttattgtcatgagcatcgaagatgcacgaaatgataggcatgatatggcccagatagatgaaacattctcttgtgtcgttacagtcttcaatgtatgtccgtacgaagtgtctatagaaatccctgatcttgcatcactgcggcttcagttgcatccagtgcaggtgaattcatcggatgcgttagccaggcagtctgcgtacgacaccgccacaggtcgattcaccgtgccgaaaaggacagcagcagtgttcgtggaacccaggtgctga；seq id no.3。
49.(一)构建基因编辑载体pbue411-1gr-zmisa2
50.1)针对基因zmisa2设计基于crispr/cas9的sgrna作用位点；
51.所述sgrna作用位点的核苷酸序列为：
52.zmisa2：5
’‑
gcggagatacggacacaccgcgg-3’；seq id no.4；
53.2)以pcbc-mt1t2质粒为模板，mt1t2-f，mt1t2-f0为引物，pcr扩增目的片段；
54.所述引物序列如下：
55.mt1t2-f：5
’‑
aataatggtctcaggcgcctttgatgaactgacgca-3’；seq id no.5；
56.mt1t2-f0：5
’‑
gcctttgatgaactgacgcagttttagagctagaaatagc-3’；seq id no.6；
57.pcr扩增反应体系为：pcbc-mt1t2质粒1μl，mt1t2-f 0.5μl，mt1t2-f00.5μl，2
×
mix 10μl，ddh2o 8μl。
58.pcr扩增反应程序为：98℃3min；98℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min，4℃∞。
59.将获得的目的片段与载体pbue411进行酶切连接，反应体系如下：
60.目的片段(945bp)2μl，pbue4112μl，10xneb t4 buffer 1.5μl，10xbsa 1.5μl，bsai(neb)1μl，t4 ligase(neb)/高浓度1μl，ddh2o 6μl，total 15μl。
61.反应条件：37℃5h，50℃5min，80℃10min。
62.构建得到zmisa2基因编辑载体pbue411-1gr-zmisa2。
63.(二)构建基因编辑载体pbue411-2gr-zmisa3-zmzpu1
64.1)针对基因zmisa3、zmzpu1设计基于crispr/cas9的sgrna作用位点；
65.所述sgrna作用位点的核苷酸序列为：
66.zmisa3：5
’‑
accacgacgaaagttcagagcgg-3’；seq id no.7；和
67.zmzpu1：5
’‑
tggtcagactgagaacagcgcgg-3’；seq id no.8；
68.2)以pcbc-mt1t2质粒为模板，mt1t2-f’，mt1t2-f0’，mt1t2-r0’，mt1t2-r’为引物，pcr扩增目的片段；
69.所述引物序列如下：
70.mt1t2-f’：5
’‑
aataatggtctcaggcgccacgacgaaagttcagag-3’；seq id no.9；
71.mt1t2-f0’：5
’‑
gccacgacgaaagttcagaggttttagagctagaaatagc-3’；seq id no.10；
72.mt1t2-r0’：5
’‑
cgctgttctcagtctgacccgcttcttggtgcc-3’；seq id no.11；
73.mt1t2-r’：5
’‑
attattggtctctaaaccgctgttctcagtctgacc-3’；seq id no.12；
74.3)用一轮pcr方法扩增目的片段，pcr反应使用两对引物mt1t2-f’，mt1t2-f0’，mt1t2-r0’，mt1t2-r’，以pcbc-mt1t2质粒为模板扩增。
75.pcr扩增反应体系为：pcbc-mt1t2质粒1μl，mt1t2-f’0.5μl，mt1t2-f0’0.5μl，mt1t2-r0’0.5μl，mt1t2-r’0.5μl，2
×
mix 10μl，ddh2o 7μl。
76.pcr扩增反应程序为：98℃3min；98℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min，4℃∞。
77.将获得的目的片段与载体pbue411进行酶切连接，反应体系如下：
78.目的片段(964bp)2μl，pbue4112μl，10xneb t4 buffer 1.5μl，10xbsa 1.5μl，bsai(neb)1μl，t4 ligase(neb)/高浓度1μl，ddh2o 6μl，total 15μl。
79.反应条件：37℃5h，50℃5min，80℃10min。
80.构建得到zmisa3、zmzpu1基因编辑载体pbue411-2gr-zmisa3-zmzpu1。
81.实施例2基因编辑载体转入农杆菌lba4404
82.1)cacl2法制备根癌农杆菌感受态细胞
83.(1)从yep平板(rifr，strr)上挑取新鲜的lba4404单菌落接种于含50mg/l str和25mg/l rif的yep液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养过夜24～36h；
84.(2)取2ml过夜活化的对数生长期的菌液，接种于50ml yep液体培养基中，20℃培养菌液od
600
至0.4～0.6左右；
85.(3)将菌液转移到冰预冷的50ml无菌离心管中，冰浴30min，4℃，4,000
×
g离心10min，富集菌体；
86.(4)用10ml冰预冷0.05m cacl2悬浮菌体，冰浴30min，4℃，4,000
×
g离心10min，富集菌体；
87.(5)用1ml冰预冷0.05m cacl2重悬菌体，将制备好的感受态细胞于4℃保存，24～48h内使用转化效率最高，也可按每管100μl分装于无菌管中，加入终浓度20％甘油，并用液氮速冻后置于-80℃保存。
88.2)冻融法转化根癌农杆菌感受态细胞
89.(1)取出农杆菌感受态(200μl)，置于冰上，待刚解冻时加入1μg质粒dna，放入液氮中1min，而后放入37℃金属浴中5min；质粒dna pbue411-1gr-zmisa2和pbue411-2gr-zmisa3-zmzpu1分别转化农杆菌感受态；
90.(2)取出离心管，加入1ml yeb液体培养基(不含抗生素)，置于摇床上，28℃，180r/min培养35h；
91.(3)3000rpm离心1min，取出多余上清液，保留100μl，重悬，倒入yeb平板培养基(kan，rif)上，涂抹均匀，在恒温培养箱中28℃培养36-48h；
92.(4)挑取单克隆，检测，保留阳性菌落。利用引物osu3-fd3/tau3-rd进行菌液pcr鉴定。
93.其中，osu3-fd3/tau3-rd引物序列如下：
94.osu3-fd3：5
’‑
gacaggcgtcttctactggtgctac-3’；seq id no.13；
95.tau3-rd：5
’‑
ctcacaaattatcagcacgctagtc-3’；seq id no.14。
96.反应体系：
97.菌液1μl，osu3-fd31μl，tau3-rd 1μl，2
×
mix 10μl，ddh2o 7μl，total 20μl。
98.pcr扩增反应程序为：98℃3min；98℃30s，57℃45s，72℃1min，35个循环；72℃5min，4℃∞。
99.菌落pcr产物大小为831bp。
100.鉴定正确后，获得含有pbue411-1gr-zmisa2的根癌农杆菌，以及含有pbue411-2gr-zmisa3-zmzpu1的根癌农杆菌。
101.实施例3玉米遗传转化
102.(1)取胚材料为玉米自交系c01，在授粉后第九天开始观察玉米幼胚，待其长到1.5mm左右时，将果穗取回实验室进行取胚工作。
103.(2)准备农杆菌侵染液，经过活化的农杆菌(含有pbue411-1gr-zmisa2的根癌农杆菌，或含有pbue411-2gr-zmisa3-zmzpu1的根癌农杆菌)在yeb液体培养基中摇菌至特定浓度时(od
550
＝0.5)，低速离心收集菌体沉淀，然后用inf(每升组成：n6盐和维生素(sigma)2克，蔗糖68.5克，葡萄糖36克，l-proline 0.7克，mes 0.5g，1mg/ml 2,4-d 1.5ml)+as(acetosyringone，(100mm)，1ml))液体培养基重悬，25℃75r/min摇菌24h，至浓度为od
550
＝0.3-0.4即可。
104.(3)将步骤(1)中取出的幼胚用inf+as(同上)液体培养基洗涤2次，然后加入农杆菌侵染液，侵染20min-30min。
105.(4)将侵染过后的幼胚转移到共培养培养基(每升组成：n6盐和维生素4克，蔗糖40克，葡萄糖30克，l-proline 0.7克，mes 0.5g，1mg/ml 2,4-d 1.5ml，琼脂糖(低eeo)5g，8.5mg/ml硝酸银0.1ml，100mg/ml l-半胱氨酸0.4g，0.5m/l dtt 0.154g)中，幼胚的盾片朝上，胚轴与培养基表面接触，用封口膜封住培养皿，在20℃培养箱中暗培养3天。
106.(5)把幼胚从共培养培养基转移到静息培养基(每升组成：n6盐和维生素4克，蔗糖40克，葡萄糖30克，l-proline 0.7克，mes 0.5g，1mg/ml 2,4-d 1.5ml，8.5mg/ml硝酸银0.1ml，100mg/ml l-半胱氨酸0.4g，0.5m/l dtt 0.154g，timentin(蒂门汀，sigma)100mg)中，用封口膜封住培养皿，放在28℃条件下暗培养7天。
107.(6)再将所有的幼胚转移到选择培养基ⅰ(每升组成：n6盐和维生素4克，蔗糖40克，葡萄糖30克，l-proline 0.7克，mes 0.5g，1mg/ml 2,4-d 1.5ml，8.5mg/ml硝酸银0.1ml，100mg/ml l-半胱氨酸0.4g，0.5m/l dtt 0.154g，timentin 100mg，3mg/ml bialaphos 0.5ml)上，28℃暗培养两周。
108.(7)将所有的幼胚转移到选择培养基ⅱ(每升组成：n6盐和维生素4克，蔗糖40克，葡萄糖30克，l-proline 0.7克，mes 0.5g，1mg/ml 2,4-d 1.5ml，8.5mg/ml硝酸银0.1ml，100mg/ml l-半胱氨酸0.4g，0.5m/l dtt 0.154g，timentin 100mg，3mg/ml bialaphos 1ml)上，此时可以进行挑选，挑选颜色鲜艳的幼胚28℃暗培养两周。
109.(8)经过两次选择之后，开始进行再生，在再生培养基i(每升组成：ms(murashige and skoog)盐(sigma)4.3g，蔗糖60g，凝胶2.5克，2mg/ml甘氨酸1ml，timentin 100mg)中进行发芽生根，待见到明显叶片及根生长出来时转移到再生培养基ⅱ(每升组成：ms salts 2.9g，蔗糖30g，凝胶2.5g，2mg/ml甘氨酸1ml，timentin 100mg)上。从此步骤开始，进行光照培养。
110.(9)待再生苗长出3-4片叶时，将其转移至温室，并进行检查，阳性植株(pbue411-1gr-zmisa2载体阳性植株和pbue411-2gr-zmisa3-zmzpu1载体阳性植株)保留，缓苗2-3天后转移到土中，而后进行正常的玉米生长管理。
111.实施例4发生编辑的转基因玉米植株的鉴定
112.转移到土中一周后，进行草铵膦筛选，经过草铵膦筛选后成活的玉米叶片采用ctab法提取dna，pbue411-1gr-zmisa2载体阳性植株用zmisa2基因特异引物进行pcr鉴定；pbue411-2gr-zmisa3-zmzpu1载体阳性植株用zmisa3和zmzpu1基因特异性引物进行pcr鉴定，扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
113.zmisa2、zmisa3和zmzpu1基因特异性引物序列如下：
114.zmisa2-crispr-f1：5
’‑
taccgttaccgcttccga-3’；seq id no.15；
115.zmisa2-crispr-r1：5
’‑
ccatccttggactgggac-3’；seq id no.16；
116.zmisa3-crispr-f2：5
’‑
tgtgctcgctgtgagtct-3’；seq id no.17；
117.zmisa3-crispr-r2：5
’‑
ccagatgaagtgtgtccc-3’；seq id no.18；
118.zmzpu1-crispr-f3：5
’‑
gattgctttgttcattggc-3’；seq id no.19；
119.zmzpu1-crispr-r3：5
’‑
aacccgtcaacctaaggc-3’；seq id no.20。
120.反应体系为：
121.dna 1μl，zmisa2-crispr-f1/zmisa3-crispr-f2/zmzpu1-crispr-f3 1μl，zmisa2-crispr-r1/zmisa3-crispr-r2/zmzpu1-crispr-r31μl，2
×
mix 10μl，ddh2o 7μl，total 20μl。
122.反应程序为：94℃5min；98℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃∞。
123.引物对(zmisa2-crispr-f1/r1)用于扩增zmisa2基因突变，产物大小约为0.4kb；引物对(zmisa3-crispr-f2/r2)用于扩增zmisa3基因突变，产物大小约为0.5kb；引物对(zmzpu1-crispr-f3/r3)用于扩增zmzpu1基因突变，产物大小约为0.5kb；
124.分别将扩增产物条带大小正确的pcr产物送去测序，测序结果与野生型进行比对，结果见图1(仅显示突变位点)。
125.pbue411-1gr-zmisa2和pbue411-2gr-zmisa3-zmzpu1两个载体靶点均编辑的植株相互授粉进行杂交，然后自交，筛选3个靶点均被编辑的纯合突变体。即获得高类胡萝卜素含量的玉米。
126.筛选到3个基因编辑的突变体株系。发生编辑的纯合突变体材料明显比野生型玉
米的类胡萝卜素高。这个高类胡萝卜素材料具有重要的育种价值。
127.收获后对野生型和突变型玉米籽粒的类胡萝卜素含量进行测定，结果见图2；野生型(wildtype)玉米籽粒平均类胡萝卜素含量为2.34mg/100g，突变型(mutant)玉米籽粒平均类胡萝卜素含量为4.91mg/100g，二者差异显著。
128.本发明提供一种提高玉米籽粒类胡萝卜素含量的方法，按照上述方法制备目的基因编辑的玉米材料，然后基因编辑玉米材料进行杂交、回交、自交或无性繁殖，从而创制高类胡萝卜素材料。
129.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。