一种荷包红鲤CRISPR/Cas9基因编辑方法

一种荷包红鲤crispr/cas9基因编辑方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术，具体是涉及一种荷包红鲤crispr/cas9基因编辑方法。


背景技术：

2.鲤鱼作为世界范围内广泛养殖的淡水鱼之一，不仅具有极高的食用价值，其观赏价值也得到人们的普遍认可。荷包红鲤，cyprinus carpio var.wuyuanensis，是鲤鱼的一个变种，产于中国江西省绥源县，色泽鲜红、头小尾短、背高体宽、腹部肥大、形似荷包，肉质鲜嫩，风味极佳，具有较高的经济价值；同时荷包红鲤具有良好的杂交亲和性，能与多种鲤鲫鱼进行杂交，产生的后代具有明显的杂种优势，对我国水产养殖产业具有重要促进作用。本实验室多年来通过基因组手段展开鲤鱼发育生物学和演化机制的研究，测序、组装并注释了荷包红鲤基因组，为荷包红鲤的性状遗传解析、基因功能研究以及遗传育种的进一步开展提供了数据基础。
3.相对于传统的鱼类育种技术，如杂交育种，craspr/cas9基因编辑技术培育新品种的目的性更强、耗时较短、成本较低，能够实现靶基因的精准编辑，较快获得目标性状的纯合突变体，这对提高鱼类育种效率，改良种质资源具有一定前景。目前craspr/cas9基因编辑技术已经在尼罗罗非鱼、大西洋鲑以及各类鲤科鱼等水产经济物种中广泛应用，进行了体色形成、性别决定以及营养代谢等相关基因的功能研究，为培育和开发新品种提供了宝贵参考资料。但是在荷包红鲤中还未见有相关应用研究的报道。
4.荷包红鲤为异源四倍体鲤科鱼类，具有100条染色体，经历了鲤科鱼类特有的第四轮全基因组复制，基因具有多个拷贝，不同拷贝的基因序列相似性较高，并且在进化过程中，基因的不同拷贝可能发生了新功能化和亚功能化，这种复杂关系为基因编辑工作带来了极大挑战。但同时基因编辑技术也为探究多倍体物种基因不同拷贝的功能和进化命运提供了重要手段。在前人研究中adh8a基因在鲫鱼中鉴定有3个不同的拷贝(dhillon et al,2018)，参与了乙醛清除的重要代谢过程，和鲫鱼的耐低氧性能具有密切关系，但在荷包红鲤中尚未报道该基因的拷贝数及功能研究等内容。因此在荷包红鲤中建立crispr/cas9基因编辑系统，并进行该基因的鉴定和敲除，可为进一步研究开发荷包红鲤的新养殖品系，优化荷包红鲤养殖性状提供研究基础和资料。


技术实现要素：

5.本发明旨在提供一种荷包红鲤crispr/cas9基因编辑方法，为其遗传育种提供新方法。采用显微注射的方法，将体外转录合成的靶基因sgrna和cas9蛋白与酚红溶液的混合体系注射入荷包红鲤的受精卵动物极，孵化得到靶基因突变的荷包红鲤杂合子个体。
6.为实现上述目的，本发明所述荷包红鲤crispr/cas9基因编辑方法的具体步骤为：通过序列比对鉴定荷包红鲤adh8a基因，并设计靶基因敲除靶点，然后通过体外转录的方法合成相应的sgrna，以显微注射的方式，注射适量cas9、sgrna和酚红的混合体系在1细胞期荷包红鲤受精卵的动物极。
7.所述鉴定荷包红鲤adh8a基因的方法为：以参考物种的adh8a蛋白序列通过blastp比对荷包红鲤基因组蛋白序列，鉴定得到对应的核酸序列。
8.所述设计靶基因敲除靶点的方法为：利用sgrnacas9软件设计靶点，casot软件进行靶位点唯一性的验证后得到靶点序列。
9.所述合成相应的sgrna的方法为：
10.利用带有靶点序列特异性f引物和具有sgrna_scaffold序列的通用长引物r，先合成sgrna的转录模板，然后在t7 rna转录酶的作用下体外转录合成sgrna，最后纯化得到用于敲除的sgrna；
11.所述利用带有靶点序列特异性f引物：
[0012]5‘‑
gaattaatacgactcactataggccacatgagtctcttccatggtttaagagctatgctgg-3’[0013]
所述具有sgrna_scaffold序列的通用长引物r：
[0014]5‘‑
aaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttatttaaacttgctatgctgtttccagcatagctcttaaac-3’；
[0015]
所述荷包红鲤受精卵的获得方法为：在水温24
±
0.3℃条件下，挑选性成熟的荷包红鲤，暂养于室内水泥池中，亲鱼以3～5μg/kg和1～3mg/kg的剂量注射促黄体素释放激素(lhrh-a2)和地欧酮(dom)进行催产，雄鱼的注射剂量为雌鱼的一半；待亲鱼有排卵或授精行为时，用干燥洁净的毛巾擦干泄殖孔，轻轻挤压鱼体腹部得到精子和卵子；混匀适量的荷包红鲤精子与卵子，撒入水中，待卵受精沉入水底，收集粘附在培养皿的受精卵用于显微注射。
[0016]
所述cas9、sgrna和酚红的混合体系中，sgrna的终浓度为1500ng/μl，cas9蛋白终浓度为1590ng/μl。
[0017]
所述注射的混合体系液体体积为1～2nl。
[0018]
本发明通过序列比对在荷包红鲤基因组中鉴定目的基因，设计sgrna靶点序列及验证引物，靶点验证后通过体外转录合成靶基因sgrna并进行纯化；将sgrna与cas9蛋白等体积混合后，对人工授精后的荷包红鲤胚胎进行显微注射，进行靶基因的敲除，胚胎孵化后2个月进行剪尾提取dna，经一代测序验证得到f0代突变杂合子，本发明为实现荷包红鲤的快速性状改良和遗传选育提供新途径，有利于进一步开发荷包红鲤的经济价值，增加养殖收益。
附图说明
[0019]
图1为荷包红鲤adh8a2基因结构和敲除靶点；
[0020]
图2为sgrnacas9软件靶点设计界面；
[0021]
图3为荷包红鲤adh8a2基因敲除sanger法测序检测结果。
具体实施方式
[0022]
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步解释说明。以下实施例旨在说明本发明，并不限制本发明的范围。
[0023]
本发明实施例包括以下步骤：
[0024]
1)混匀适量的荷包红鲤精子与卵子，撒入水中；
[0025]
2)待卵子沉入水中，粘附于培养皿上；
[0026]
3)冲洗去除未受精卵子，取出培养皿，并加入适量水，刚好没过受精卵；
[0027]
4)体积1︰1配制sgrna和cas9蛋白混合体系，室温孵育10min后加少量酚红作为指示剂；
[0028]
5)显微镜下观察受精卵发育时期，出现动物极后，显微注射上一步的液体，胚胎发育至二细胞期时停止注射，去除未注射区域的受精卵，加入适量提前配置好的亚甲基蓝溶液(0.1％)，26～28℃下培养，每天更换一次亚甲基蓝溶液，及时去除死卵；
[0029]
6)待荷包红鲤仔鱼2月龄时，剪取部分尾鳍，提取dna，pcr扩增基因组靶序列，进行sanger一代测序以检测突变体；
[0030]
荷包红鲤精子和卵子的获取方法为：在水温24
±
0.3℃条件下，挑选性成熟的荷包红鲤，暂养于室内水泥池中，亲鱼以3～5μg/kg和1～3mg/kg的剂量注射促黄体素释放激素(lhrh-a2)和地欧酮(dom)进行催产，雄鱼的注射剂量为雌鱼的一半；待亲鱼有排卵或授精行为时，用干燥洁净的毛巾擦干泄殖孔，轻轻挤压鱼体腹部得到精子和卵子，保存于4℃；
[0031]
所述混合体系，grna的终浓度为1500ng/μl，cas9蛋白终浓度为1590ng/μl；
[0032]
所述注射体积为1～2nl；
[0033]
所述靶基因sgrna：
[0034]
gaauuaauacgacucacuauaggccacaugagucucuuccaugguuuaagagcuaugcuggaaacagcauagcaaguuuaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuu。
[0035]
实施例1：构建荷包红鲤靶基因(adh8a2)的sgrna
[0036]
a)荷包红鲤adh8a基因的序列鉴定及分析
[0037]
从ncbi官网下载近源物种(斑马鱼、青鳉、鲫鱼)adh8a基因的蛋白序列，整理为fasta格式的文件作为参考序列。对本实验室组装注释的荷包红鲤基因组序列进行建库，通过tblastn等分析方法鉴定出荷包红鲤的adh8a1和adh8a2基因，分析其基因结构，获得adh8a2基因的cds序列，用于基因敲除靶点设计。图1给出荷包红鲤adh8a2基因结构和敲除靶点。
[0038]
b)靶点序列的设计
[0039]
如图2，本发明使用sgrnacas9软件进行靶点设计，根据结果文件筛选合适靶点，通过casot软件进行靶点唯一性验证，最终获得靶点序列(adh8a2-target)：ccacatgagtctcttccatg。
[0040]
c)靶点序列的上下游引物的设计及验证
[0041]
根据靶点序列所在荷包红鲤的基因组位置信息，在荷包红鲤基因组文件中从靶点起始位置的上游500bp的位置开始提取长度为1023bp的核酸序列，提交至ncb在线网站进行靶点验证引物的设计，得到靶点的上游引物序列(adh8a2 target_f)为：catttacccggtgggcctaa，下游引物序列(adh8a2 target_r)为：gtgttgacagcagctccgta。
[0042]
d)靶点序列sgrna的合成
[0043]
采用t7启动子合成靶点sgrna，合成sgrna上游引物(primer f)序列为：
[0044]5‘‑
gaattaatacgactcactataggccacatgagtctcttccatggtttaagagctatgctgg-3’，下游引物为通用引物(universal r)：
[0045]5‘‑
aaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttatttaaacttgctatg
ctgtttccagcatagctcttaaac-3’，上下游引物序列均交付金唯智生物科技有限公司进行合成。
[0046]
sgrna的合成分为三步：
[0047]
第一步：sgrna体外转录模板的合成
[0048]
利用上游特异性引物和下游通用引物，采用takara高保真酶进行pcr扩增，获得sgrna体外转录模板。
[0049]
反应体系：
[0050][0051]
反应程序：
[0052][0053]
第二步：sgrna的体外转录
[0054]
在超净台中，使用hiscribe t7 quick high yield rna synthesis kit(neb#e2040)对上一步的pcr产物进行体外转录。
[0055]
反应体系:
[0056][0057]
pcr程序：37℃ 1.5hour
[0058]
加入20μl无酶水和2μl dnaseⅰ(neb cat#m0303s)，37℃条件下反应15min，去除dna，终止转录。
[0059]
第三步：纯化sgrna
[0060]
上一步pcr产物使用monarch rna cleanup kit(neb t2040l)进行纯化。加入100μl rna cleanup binding buffer和150μl预冷无水乙醇与上一步pcr产物进行充分混匀，然
后转移至吸附柱中，在离心力16000
×
g条件下离心1min，弃掉液体；加入500μl rna cleanup wash buffer，在离心力16000
×
g条件下离心1min，弃掉液体；重复上一步步骤；为了减少有机试剂的影响，再进行一次空管离心，在离心力16000
×
g条件下离心1.5min，弃掉液体；将吸附柱转移至1.5ml离心管中，加入30μl nuclease-free water,在离心力16000
×
g条件下离心1min,得到sgrna；取1ul sgrna进行琼脂糖凝胶电泳(2％)，140v，20min，检测rna完整性；取1ul sgrna通过nanodrop测定od值定量rna浓度。
[0061]
实施例2：荷包红鲤受精卵的获取
[0062]
挑选成熟荷包红鲤雌雄亲鱼，分别暂养于室内水泥池中，水温控制在24℃左右。在人工繁殖24h前，对雌雄亲鱼进行注射地欧酮(dom)与促黄体素释放激素a2(lhrh-a2)混合液体，雌鱼注射剂量为dom 1-2mg/kg、lhrh-a2 3-5μg/kg，雄鱼注射剂量为雌鱼注射剂量的一半，经12h后，给雌鱼注射第二针。待雌雄亲鱼有产卵/排精现象时，干净毛巾擦干亲鱼泄殖孔周围水分，轻轻挤压腹部，精液和卵子均分别收集于干净的50ml离心管中，4℃条件下保存。胶头滴管分别取适量精子和卵子于干燥洁净的烧杯中，充分混匀后均匀撒入放有培养皿的水盆中，待受精卵沉落并粘附于培养皿后，冲洗掉未受精卵子，留有少量水于培养皿中，没过受精卵即可。
[0063]
实施例3：荷包红鲤受精卵靶基因的显微注射
[0064]
按照体积比1:1，混合靶基因的sgrna和cas9蛋白，室温下孵育10min后加入少量酚红作为显色指示剂，混合均匀后灌入石英玻璃针中。在体视显微镜下观察，受精后的卵颜色由黄色变为透明，并吸水膨大，出现动物极，进入胚胎发育1细胞期。为保证敲除效率，利用氮气加压的显微注射系统，在受精卵1细胞时期进行显微注射，每粒受精卵注射约2nl混合液体。观察受精卵进入2细胞期时，结束显微注射，去除培养皿中未进行注射的受精卵，加入适量0.1％的亚甲基蓝溶液，防止长水霉。注射后的受精卵置于24℃下孵化培养，每天及时移除死卵，并更换浓度为0.1％的亚甲基蓝溶液。
[0065]
实施例4：荷包红鲤靶基因突变体的筛选与检测
[0066]
孵化后的荷包红鲤仔鱼培养至2个月大后，对每条鱼(共18尾)进行剪尾，提取dna，利用实施例1中c)设计的上下游引物进行pcr扩增目标序列，进行突变检测。具体步骤为：取少量尾鳍于200μl离心管中，加入20μl extraction solution(东盛生物，p9052)，简短离心后，放入pcr仪，98℃，20min；加入2μl neutralization solution(东盛生物，p9052),涡旋混匀，简短离心，即可获得粗提dna；以粗提dna为模板，扩增包含靶位点的基因片段。
[0067]
反应体系：
[0068][0069][0070]
反应程序：
[0071][0072]
取2μl pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳(2％)，110v，35min，其余pcr产物送铂瑞生物科技有限公司进行一代测序，图3为荷包红鲤adh8a2基因敲除sanger法测序检测结果。测序结果序列分析显示，有两尾荷包红鲤在靶基因序列区出现双峰，数据表明首次在荷包红鲤中成功建立crispr/cas9基因编辑体系，并获得突变杂合子。