ApoA5基因敲除仓鼠模型的构建方法

apoa5基因敲除仓鼠模型的构建方法
技术领域
1.本发明属于疾病动物模型构建领域，尤其涉及apoa5基因敲除仓鼠模型的构建方法。


背景技术：

2.载脂蛋白a5(apolipoprotein a5，apoa5)(gene id：116519；omim accession number：606368)是2001年rubin等人通过比对人和小鼠调控胆固醇和甘油三酯代谢的apoa1/a5/a4基因簇编码序列时确认的一个载脂蛋白家族新成员，位于人类11号染色体长臂q23区域，apoa4基因簇下游30kbp位置。该基因全长1889bp，包含4个外显子和3个内含子，其起始密码子在第2外显子上，可编码366个氨基酸残基。人apoa5蛋白由343个氨基酸组成，分子量约为39kd，呈高疏水性，主要在肝脏合成，极少量来源于小肠。在血浆中，apoa5存在于乳糜微粒(chylomicron，cm)、ldl和hdl中，但含量很低，约为0.1-0.4mg/ml，仅为血浆apob蛋白含量的千分之一。
3.早在2001年美国研究人员即发现在小鼠体内敲除apoa5基因后，小鼠血浆甘油三酯仅升高2-4倍(150-350mg/dl)，并没有展现出与人类apoa5缺陷相似的极度高甘油三酯血症，无法模拟临床病人的甘油三酯代谢特征；然而在小鼠体内过表达apoa5，小鼠血浆甘油三酯降低约1/3，并且无论过表达还是敲除apoa5均对小鼠血浆胆固醇水平无显著影响，提示apoa5可以负向调控血浆甘油三酯水平。
4.目前，推测其对血浆甘油三酯代谢的调控可能通过三条途径：(1)lpl的激动剂，通过促进富含甘油三酯的脂蛋白(triglycerides-rich lipoprotein，trl)颗粒与血管内皮细胞表面的糖基磷脂酰肌醇高密度脂蛋白结合蛋白1(glycosylphosphatidylinositol anchored high density lipoprotein binding protein 1，gpihbp1)或硫酸肝素蛋白聚糖(heparin sulphate proteoglycans，hspg)的结合，促进trl水解；(2)抑制肝脏极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，vldl)分泌；(3)通过和低密度脂蛋白受体(ldlr)家族成员结合促进肝脏对残体脂蛋白的摄取。但是，apoa5是否还存在其他的甘油三酯调控机制目前仍然不清楚。
5.因此，针对以上现状，迫切需要开发apoa5基因敲除仓鼠模型的构建方法，以克服当前实际应用中的不足。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供apoa5基因敲除仓鼠模型的构建方法，旨在解决上述背景中提到的问题。
7.本发明是这样实现的，apoa5基因敲除仓鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
8.步骤一、设计仓鼠apoa5基因特异性打靶序列，制备cas9 mrna和sgrna；
9.步骤二、收集和培养仓鼠受精卵；
10.步骤三、显微注射：将所述sgrna和cas9 mrna共同注射至仓鼠受精卵的细胞质中；
11.步骤四、将显微注射后的受精卵植入代孕仓鼠体内，f0代仓鼠出生。
12.在ncbi中，仓鼠全基因组测序和拼接工作已经高度完成，完整数据库已经建立，并为我们的基因修饰模型制备和鉴定工作提供了基本依据。通过数据库筛查，我们找到了apoa5基因信息(geneid:101841608)，在其第二外显子中设计sgrna的靶序列位置。
13.进一步的技术方案，在步骤一中，apoa5基因特异性打靶序列为：gcaaccactcaggcgcggaa。
14.进一步的技术方案，在步骤二中，交配后第二天，即17-20小时后取卵。
15.进一步的技术方案，在步骤二中，使用m2培养基作为取卵操作培养基。
16.进一步的技术方案，在步骤二中，受精卵培养采用hecm-10培养基，并在37℃，5％co2环境下培养；12小时大约80％分裂到双细胞，36-48小时分裂到四细胞，72小时分裂到八细胞。
17.进一步的技术方案，在步骤三中，通过t7启动子将设计的模板转录成sgrna和cas9一起进行显微注射。
18.进一步的技术方案，在步骤三中，原核注射片段为sgrna和cas9-mrna。
19.进一步的技术方案，在步骤四中，回输：代孕鼠麻醉后，打开腹腔找出卵巢输卵管，每只代孕鼠植入30枚注射后受精卵，通过输卵管伞口，吹入输卵管，缝合苏醒后，正常饲养。
20.本发明提供的apoa5基因敲除仓鼠模型的构建方法，在动脉粥样硬化易感的apoe敲除小鼠体内过表达人apoa5，动脉粥样硬化斑块面积减少70％，不仅如此，斑块内巨噬细胞含量减少60％，而平滑肌和胶原含量却分别增加40％和60％，表明斑块更趋于稳定；在另一种动脉粥样硬化易感的apoe2敲入小鼠体内同样证实了过表达人apoa5可减少动脉粥样硬化斑块。
附图说明
21.图1为apoa5基因敲除仓鼠dnapcr电泳基因型鉴定结果；
22.图2为apoa5基因敲除仓鼠肝脏的rt-pct结果；
23.图3为apoa5基因敲除纯合子仓鼠血浆tg；
24.图4为apoa5基因敲除纯合子仓鼠血浆tc；
25.图5为apoa5基因敲除纯合子仓鼠体重；
26.图6为apoa5基因敲除纯合子仓鼠血糖；
27.图7为apoa5基因敲除纯合子仓鼠肝、肾、胰腺组织切片的he染色照片；
28.图8为apoa5基因敲除仓鼠肝脏脂质成分测定结果；
29.图9为apoa5基因敲除仓鼠葡萄糖耐量实验结果。
具体实施方式
30.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
31.以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
32.如图1-9所示，为本发明一个实施例提供的apoa5基因敲除仓鼠模型的构建方法，
仓鼠apoa5基因信息(gene id：101841608)，包括以下步骤：
33.步骤一、设计仓鼠apoa5基因特异性打靶序列，制备cas9 mrna和sgrna；
34.步骤二、收集和培养仓鼠受精卵；
35.步骤三、显微注射：将所述sgrna和cas9 mrna共同注射至仓鼠受精卵的细胞质中；
36.步骤四、将显微注射后的受精卵植入代孕仓鼠体内，f0代仓鼠出生。
37.在ncbi中，仓鼠全基因组测序和拼接工作已经高度完成，完整数据库已经建立，并为我们的基因修饰模型制备和鉴定工作提供了基本依据。通过数据库筛查，我们找到了apoa5基因信息(gene id:101841608)，在其第二外显子中设计sgrna的靶序列位置。
38.作为本发明的一种优选实施例，在步骤一中，apoa5基因特异性打靶序列为：gcaaccactcaggcgcggaa。
39.作为本发明的一种优选实施例，在步骤二中，交配后第二天，即17-20小时后取卵。
40.作为本发明的一种优选实施例，在步骤二中，使用m2培养基作为取卵操作培养基。
41.作为本发明的一种优选实施例，在步骤二中，受精卵培养采用hecm-10培养基，并在37℃，5％co2环境下培养；12小时大约80％分裂到双细胞，36-48小时分裂到四细胞，72小时分裂到八细胞。
42.作为本发明的一种优选实施例，在步骤三中，通过t7启动子将设计的模板转录成sgrna和cas9一起进行显微注射。
43.作为本发明的一种优选实施例，在步骤三中，原核注射片段为sgrna和cas9-mrna。
44.作为本发明的一种优选实施例，在步骤四中，回输：代孕鼠麻醉后，打开腹腔找出卵巢输卵管，每只代孕鼠植入30枚注射后受精卵，通过输卵管伞口，吹入输卵管，缝合苏醒后，正常饲养。
45.基因修饰动物模型是研究基因功能及其与疾病关系的重要工具，构建apoa5敲除动物模型的意义如下：
46.与临床数据相似，以小鼠为疾病模型的研究结论仍然不明确，apoa5是如何调控脂质代谢并如何影响as的进程其机理并不十分清楚。
47.在动脉粥样硬化易感的apoe敲除小鼠体内过表达人apoa5，动脉粥样硬化斑块面积减少70％，不仅如此，斑块内巨噬细胞含量减少60％，而平滑肌和胶原含量却分别增加40％和60％，表明斑块更趋于稳定；在另一种动脉粥样硬化易感的apoe2敲入小鼠体内同样证实了过表达人apoa5可减少动脉粥样硬化斑块。
48.值得需要注意的是，人群中apoa5的突变体多数属于功能丧失，最终导致肝脏和血浆中apoa5含量降低，甚至缺陷，并且该类患者并没有apoe缺陷和apoe2基因型。
49.近日，来自美国华盛顿大学的脂代谢著名专家karine.bornfeldt教授在其最新的综述“hypertriglyceridemia and atherosclerosis；using human research to guide mechanistic studies in animal models”中也提到apoa5缺陷与as的关系仍然处于未知的状态，需要用新模型来研究。
50.因此，在apoe缺陷小鼠和apoe2敲入小鼠中研究apoa5过表达对as的作用并不能客观地、真实地反映临床apoa5缺陷与甘油三酯和as的关系，导致apoa5能否作为治疗as的新靶点仍旧不明朗，甚至存在巨大争议。
51.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精
神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。