用于检测对硝基酚的全细胞生物传感器及检测方法

1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及用于检测对硝基酚的全细胞生物传感器及检测方法。


背景技术：

2.对硝基酚是一类被广泛应用于化工原料和药物中间体的芳香烃化合物，在自然环境中半衰期较长，对生态环境造成威胁，被认定为环境内分泌干扰物。目前，各种检测手段在对硝基酚的污染风险防控工作中发挥着重要的作用，如高效液相色谱法(hplc)和新型快速检测法(新型纳米材料的传感器)。现有方法不能直接且及时地反映各种有毒物质在复杂环境介质中对生物的综合影响(生物可利用性)。全细胞生物传感器作为一种由微生物介导且环境友好型的污染物检测方法，与化学检测方法相比，在使用效率和生态环保方面具有明显优势。
3.基于全细胞生物传感器在环境污染物检测及生态毒性评估方面占有一席之地，其具有环境的兼容性和原位检测的潜能，已引起了研究者的广泛关注。目前，基于全细胞的生物传感器的菌株和细胞系能够检测和报告有关化学物质和胁迫压力的信息，包括有机化合物、异源生物、金属、辐射、ph值的变化等。由于其简单的检测流程，基于全细胞的生物传感器的应用已扩展到土壤中污染物的监测领域。hansen等人建立的检测方法存在报告基因表达不稳定和检测周期较长(1天以上)等缺陷，且未能给出合理的污染物浓度计算公式、检出限和线性范围等检测指标。由于特定的全细胞生物传感器只对某一类化学物存在特异性响应，对硝基酚的检测需要开发新型生物传感器菌株。当前的微生物全细胞生物传感器检测方法不能满足对对硝基酚的快速、高通量、精确检测的需要。
4.因此，现有技术还有待于改进和发展。


技术实现要素：

5.鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测对硝基酚的全细胞生物传感器及检测方法，旨在解决现有微生物全细胞生物传感器检测方法不能满足对对硝基酚的快速、高通量、精确检测的问题。
6.本发明的技术方案如下：
7.本发明的第一方面，提供用于检测对硝基酚的全细胞生物传感器，其中，包括宿主细胞以及位于所述宿主细胞中的ppnp-mrfp质粒或ppnp-amilcp质粒，所述ppnp-mrfp质粒的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述ppnp-amilcp质粒的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述ppnp-mrfp质粒、ppnp-amilcp质粒的物理图谱如图1所示。
8.可选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。
9.可选地，所述大肠杆菌为e.coli bl21。
10.本发明的第二方面，提供一种本发明如上所述的用于检测对硝基酚的全细胞生物传感器的制备方法，其中，包括步骤：
11.利用引物聚合酶链反应，从pet22b-yfp质粒上克隆ppnp基因片段的基因序列，从pmv_pobro质粒上克隆pobro-m报告基因片段的基因序列，从puc19_mrfp质粒上克隆mrfp报告基因片段的基因序列；
12.以得到的pobro-m报告基因片段和mrfp报告基因片段的扩增产物的混合物为模板，利用引物聚合酶链反应，得到pobro-m-mrfp基因；
13.将所述pobro-m-mrfp基因连接到pclone007骨架上，获得pclone007_pobro-m-mrfp质粒；
14.从所述pclone007_pobro-m-mrfp质粒上克隆pobro-m-mrfp基因片段的基因序列；
15.将所述pobro-m-mrfp基因片段的基因序列和所述ppnp基因片段的基因序列通过同源重组酶连接，得到连接产物；
16.将所述连接产物转入到e.coli dh5α感受态细胞中，得到e.coli dh5α/ppnp-mrfp菌种；
17.将所述e.coli dh5α/ppnp-mrfp菌种接种在含有卡那霉素和对硝基酚的液体培养基中，培养后，收集菌体，然后提取ppnp-mrfp质粒，通过质粒热击转化法，将提取的ppnp-mrfp质粒导入到e.coli bl21菌株中，得到所述用于检测对硝基酚的全细胞生物传感器e.colibl21/ppnp-mrfp。
18.可选地，扩增ppnp基因片段采用的引物：
19.正向引物序列为：gagatccggctgctaacaaagc；
20.反向引物序列为：ggatccgcgacccatttgc；
21.扩增pobro-m报告基因片段采用的引物：
22.正向引物序列为：ttataccagattgcgcagttcgttg；
23.反向引物序列为：aaaccattttggatttgaatgttatgatggaacaacaccatcagtatttgg；
24.扩增mrfp报告基因片段采用的引物：
25.正向引物序列为：ccaaatactgatggtgttgttccatcataacattcaaatccaaaatggttt；
26.反向引物序列为：tcatttatataattcgtccatgccac；
27.扩增加同源臂pobro-m-mrfp基因片段采用的引物：
28.正向引物序列：ttataccagattgcgcagttcgttg；
29.反向引物序列：gctttgttagcagccggatctctcatttatataattcgtccatgcc。
30.本发明的第三方面，提供另一种本发明如上所述的用于检测对硝基酚的全细胞生物传感器的制备方法，其中，包括步骤：
31.利用引物聚合酶链反应，从pet22b-yfp质粒上克隆ppnp基因片段的基因序列，从pmv_pobro质粒上克隆pobro-a报告基因片段的基因序列，从puc19_amilcp质粒上克隆amilcp报告基因片段的基因序列；
32.以得到的pobro-a报告基因片段和amilcp报告基因片段的扩增产物的混合物为模板，利用引物聚合酶链反应，得到pobro-a-amilcp基因；
33.将所述pobro-a-amilcp基因连接到pclone007骨架上，获得pclone007_pobro-a-amilcp质粒；
34.从所述pclone007_pobro-a-amilcp质粒上克隆pobro-a-amilcp基因片段的基因序列；
35.将所述pobro-a-amilcp基因片段的基因序列和所述ppnp基因片段的基因序列通过同源重组酶连接，得到连接产物；
36.将所述连接产物转入到e.colidh5α感受态细胞中，得到e.coli dh5α/ppnp-amilcp菌种；
37.将所述e.colidh5α/ppnp-amilcp菌种接种在含有卡那霉素和对硝基酚的液体培养基中，培养后，收集菌体，然后提取ppnp-amilcp质粒，通过质粒热击转化法，将提取的ppnp-amilcp质粒导入到e.colibl21菌株中，得到所述用于检测对硝基酚的全细胞生物传感器e.coli bl21/ppnp-amilcp。
38.可选地，扩增ppnp基因片段采用的引物：
39.正向引物序列为：gagatccggctgctaacaaagc；
40.反向引物序列为：ggatccgcgacccatttgc；
41.扩增pobro-a报告基因片段采用的引物：
42.正向引物序列：ttataccagattgcgcagttcgttg；
43.反向引物序列：atgtatatctccttgctattttctatttt；
44.扩增amilcp报告基因片段采用的引物：
45.正向引物序列：aaaatagaaaatagcaaggagatatacatatgagtgtgatcgctaaacaaatg；
46.反向引物序列：ttattaggcgaccacaggtttg；
47.扩增加同源臂pobro-a-amilcp基因片段采用的引物：
48.正向引物序列：ttataccagattgcgcagttcgttg；
49.反向引物序列：gctttgttagcagccggatctcttattaggcgaccacaggttt。
50.本发明的第四方面，提供一种对硝基酚的检测方法，其中，包括步骤：
51.将本发明如上所述的全细胞生物传感器接种到含有卡那霉素的培养基中进行培养后收集，然后加入到含有乳糖和多粘菌素b的培养基中复苏；
52.将复苏后的全细胞生物传感器加入到孔板上的每个小孔中，每个小孔中装有已知对硝基酚浓度的标样样品，然后加入edta，将孔板放在摇床上孵育后，测定孔板每个小孔荧光强度值或吸光度值，并建立对硝基酚浓度和荧光强度值或吸光度值之间的标准曲线方程；
53.将复苏的全细胞生物传感器细胞加入到孔板上的每个小孔中，每个小孔中装有待测对硝基酚样品，然后加入edta，将孔板放在摇床上孵育后，测定孔板每个小孔荧光强度值或吸光度值，通过所述对硝基酚浓度和荧光强度值或吸光度值之间的标准曲线方程，计算得到所述待测对硝基酚样品的浓度。
54.可选地，所述的全细胞生物传感器接种到含有50mg/l卡那霉素抗生素的lb液体培养基中，培养4～5小时后收集。
55.可选地，所述加入到含有乳糖和多粘菌素b(pmb)的培养基中进行复苏的全细胞生物传感器与含有乳糖和多粘菌素b(pmb)的培养基的比例为(3～4)mg：100μl。
56.有益效果：本发明提供的全细胞生物传感器用于检测土壤中提取态对硝基酚时，对硝基酚与阻遏蛋白pobr的结合消除了pobr与操纵基因位点(pobo)的结合，转录反方向的荧光蛋白或色蛋白基因，产生荧光蛋白或色蛋白，通过检测荧光强度值或吸光度值，且对硝基酚浓度不同检测得到的荧光强度值或吸光度值不同，进而实现土壤中提取态对硝基酚的
快速、高通量检测。
附图说明
57.图1为本发明实施例中ppnp-mrfp质粒、ppnp-amilcp质粒dna序列的物理图谱。
58.图2为本发明实施例中全细胞生物传感器与对硝基酚作用原理示意图。
59.图3中(a)为本发明实施例1中全细胞生物传感器e.colibl21/ppnp-mrfp的浓度诱导曲线，图3中(b)为本发明实施例2中全细胞生物传感器e.colibl21/ppnp-amiicp的浓度诱导曲线。
60.图4为采用本发明实施例1中全细胞生物传感器检测对硝基酚的示意图。
具体实施方式
61.本发明提供用于检测对硝基酚的全细胞生物传感器及检测方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
62.除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。
63.本发明实施例提供用于检测对硝基酚的全细胞生物传感器，包括宿主细胞以及位于所述宿主细胞中的ppnp-mrfp质粒或ppnp-amilcp质粒，所述ppnp-mrfp质粒的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述ppnp-amilcp质粒的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述ppnp-mrfp质粒、ppnp-amilcp质粒的物理图谱如图1所示。
64.本发明提供的全细胞生物传感器用于检测土壤中提取态对硝基酚时，如图2所示，对硝基酚(p-np)与阻遏蛋白pobr结合进而消除了pobr与操纵基因位点(pobo)的结合，转录反方向的荧光蛋白或色蛋白基因，通过检测荧光蛋白的荧光强度值或色蛋白的吸光度值，且不同对硝基酚浓度检测得到的荧光强度值或吸光度值不同，进而实现土壤中提取态对硝基酚的快速、高通量检测。
65.其中，对硝基酚的化学结构式为：
66.在一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
67.在一种实施方式中，所述大肠杆菌为e.coli bl21。
68.本发明实施例还提供一种本发明实施例如上所述的用于检测对硝基酚的全细胞生物传感器的制备方法，其中，包括步骤：
69.s11、利用引物聚合酶链反应，从pet22b-yfp质粒(其核苷酸序列如seq id no：3所示)上克隆ppnp基因片段的基因序列，从pmv_pobro质粒(其核苷酸序列如seq id no：4所示)上克隆pobro-m报告基因片段的基因序列，从puc19_mrfp质粒(其核苷酸序列如seq id no：5所示)上克隆mrfp报告基因片段的基因序列；
70.s12、以得到的pobro-m报告基因片段和mrfp报告基因片段的扩增产物的混合物为
模板，利用引物聚合酶链反应，得到pobro-m-mrfp基因；
71.s13、将所述pobro-m-mrfp基因连接到pclone007骨架上，获得pclone007_pobro-m-mrfp质粒；
72.s14、从所述pclone007_pobro-m-mrfp质粒上克隆pobro-m-mrfp基因片段的基因序列；
73.s15、将所述pobro-m-mrfp基因片段的基因序列和所述ppnp基因片段的基因序列通过同源重组酶连接，得到连接产物；
74.s16、将所述连接产物转入到e.colidh5α感受态细胞中，得到e.colidh5α/ppnp-mrfp菌种；
75.s17、将所述e.colidh5α/ppnp-mrfp菌种接种在含有卡那霉素和对硝基酚的液体培养基中，培养后，收集菌体，然后提取ppnp-mrfp质粒，通过质粒热击转化法，将提取的ppnp-mrfp质粒导入到e.colibl21菌株中，得到所述用于检测对硝基酚的全细胞生物传感器e.colibl21/ppnp-mrfp。
76.步骤s11中，在一种实施方式中，利用引物聚合酶链反应(pcr)，从pet22b-yfp质粒上克隆ppnp基因片段(4677bp)的基因序列，退火温度为53℃；从pmv_pobro质粒上克隆pobro-m报告基因片段(842bp)的基因序列，退火温度为60℃；从puc19_mrfp质粒上克隆mrfp报告基因片段(860bp)的基因序列，退火温度为60℃。
77.具体地，扩增ppnp基因片段采用的引物：
78.正向引物序列为：gagatccggctgctaacaaagc；
79.反向引物序列为：ggatccgcgacccatttgc；
80.扩增pobro-m报告基因片段采用的引物：
81.正向引物序列为：ttataccagattgcgcagttcgttg；
82.反向引物序列为：aaaccattttggatttgaatgttatgatggaacaacaccatcagtatttgg；
83.扩增mrfp报告基因片段采用的引物：
84.正向引物序列为：ccaaatactgatggtgttgttccatcataacattcaaatccaaaatggttt；
85.反向引物序列为：tcatttatataattcgtccatgccac；
86.步骤s12中，在一种实施方式中，以得到的pobro-m报告基因片段和mrfp报告基因片段的扩增产物的混合物为模板，利用引物聚合酶链反应，得到pobro-m-mrfp基因，其中，混合物中pobro-m报告基因片段和mrfp报告基因片段的扩增产物的体积比为1:1。
87.步骤s13中，在一种实施方式中，使用pclone007 blunt simple vector kit试剂盒将所述pobro-m-mrfp基因连接到pclone007骨架上，获得pclone007_pobro-m-mrfp质粒。
88.步骤s14中，在一种实施方式中，从所述pclone007_pobro-m-mrfp质粒上克隆pobro-m-mrfp基因片段(1694bp)的基因序列，退火温度为64℃。同时，在设计引物时，添加同源片段。进一步地，扩增加同源臂pobro-m-mrfp基因片段采用的引物：
89.正向引物序列：ttataccagattgcgcagttcgttg；
90.反向引物序列：gctttgttagcagccggatctctcatttatataattcgtccatgcc。
91.步骤s15中，在一种实施方式中，将所述pobro-m-mrfp基因片段的基因序列和所述ppnp基因片段的基因序列通过同源重组酶连接，将pobro-m-mrfp基因片段和ppnp基因片段添加到pcr管中，用移液器轻轻吹打混匀，低速瞬时离心所有液体至离心管底部，载体用10
amilcp菌种；
107.s27、将所述e.coli dh5α/ppnp-amilcp菌种接种在含有卡那霉素和对硝基酚的液体培养基中，培养后，收集菌体，然后提取ppnp-amilcp质粒，通过质粒热击转化法，将提取的ppnp-amilcp质粒导入到e.coli bl21菌株中，得到所述用于检测对硝基酚的全细胞生物传感器e.coli bl21/ppnp-amilcp。
108.步骤s21中，在一种实施方式中，利用引物聚合酶链反应，从pet22b-yfp质粒上克隆ppnp基因片段(4677bp)的基因序列，退火温度为53℃；从pmv_pobro质粒上克隆pobro-a报告基因片段(949bp)的基因序列，退火温度为55℃；从puc19_amilcp质粒上克隆amilcp报告基因片段(698bp)的基因序列，退火温度为55℃。
109.具体地，扩增ppnp基因片段采用的引物：
110.正向引物序列为：gagatccggctgctaacaaagc；
111.反向引物序列为：ggatccgcgacccatttgc；
112.扩增pobro-a报告基因片段采用的引物：
113.正向引物序列：ttataccagattgcgcagttcgttg；
114.反向引物序列：atgtatatctccttgctattttctatttt；
115.扩增amilcp报告基因片段采用的引物：
116.正向引物序列：aaaatagaaaatagcaaggagatatacatatgagtgtgatcgctaaacaaatg；
117.反向引物序列：ttattaggcgaccacaggtttg。
118.步骤s22中，在一种实施方式中，以得到的pobro-a报告基因片段和amilcp报告基因片段的扩增产物的混合物为模板，利用引物聚合酶链反应，得到pobro-a-amilcp基因，其中，混合物中pobro-a报告基因片段和amilcp报告基因片段的扩增产物的体积比为1:1。
119.步骤s23中，在一种实施方式中，使用pclone007 blunt simple vector kit试剂盒将pobro-a-amilcp基因连接到pclone007骨架上，获得pclone007_pobro-a-amilcp质粒。
120.步骤s24中，在一种实施方式中，从pclone007_pobro-a-amilcp质粒上克隆pobro-a-amilcp基因片段(1640bp)的基因序列，退火温度为60℃，同时，在设计引物的时，添加同源片段。进一步地，扩增加同源臂pobro-a-amilcp基因片段采用的引物：
121.正向引物序列：ttataccagattgcgcagttcgttg；
122.反向引物序列：gctttgttagcagccggatctcttattaggcgaccacaggttt。
123.步骤s25中，在一种实施方式中，将所述pobro-m-amilcp基因片段的基因序列和所述ppnp基因片段的基因序列通过同源重组酶连接，将pobro-m-amilcp基因片段和ppnp基因片段添加到pcr管中，用移液器轻轻吹打混匀，低速瞬时离心所有液体至离心管底部，载体用10～100ng，载体与插入片段的摩尔比1:1～1:10，各片段之固摩尔比为1:1，其中pmols＝(质量ng
×
1000)/(片段长度bp
×
650daltons)，混合液在50℃反应15min。
124.步骤s26中，将所述连接产物转入到e.colidh5α感受态细胞中，得到e.colidh5α/ppnp-amilcp菌种的步骤具体包括：
125.取100μl冰浴上融化的e.colidh5α感受态细胞，加入连接产物，轻轻混匀，冰上静置25min，42℃水浴热激30～45s，迅速转移至冰浴中，静置2min，加入500μl不含抗生素的无菌lb培养基，混匀后37℃，200rpm复苏1h，吸取不同体积的复苏液均匀涂布到含卡那霉素抗生素的lb培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养；
126.在培养基上挑点，使用无菌的10μl移液枪头在含50mg/l卡那霉素抗生素的lb培养基、含50mg/l卡那霉素和10mg/l对硝基酚的lb固体培养基上分别画线，筛选可以在两个培养基上生长，并在含50mg/l卡那霉素和10mg/l对硝基酚的lb固体培养基上长出颜色斑点的菌株，使用引物pcr鉴定重组后的质粒，退火温度为60℃，验证质粒的核心片段为2761bp。
127.鉴定所用引物：
128.正向引物序列：gcaaatgggtcgcggatcc；
129.反向引物序列：gctttgttagcagccggatctc；
130.步骤s27中，将所述e.colidh5α/ppnp-amilcp菌种接种在含有卡那霉素和对硝基酚的液体培养基中，培养后，收集菌体，然后提取ppnp-amilcp质粒，通过质粒热击转化法，将提取的ppnp-amilcp质粒导入e.colibl21菌株中，得到所述用于检测对硝基酚的全细胞生物传感器e.colibl21/ppnp-amilcp的步骤具体包括：
131.将所述e.coli dh5α/ppnp-amilcp菌种接种在含有50mg/l卡那霉素和10mg/l对硝基酚的lb液体培养基中，培养24h后，以10000
×
g的相对离心力离心收集菌体，然后使用质粒提取盒提取ppnp-amilcp质粒，通过质粒热击转化法，将提取的ppnp-amilcp质粒导入e.colibl21菌株中，得到所述用于检测对硝基酚的全细胞生物传感器e.colibl21/ppnp-amilcp。
132.本发明实施例还提供一种对硝基酚的检测方法，其中，包括步骤：
133.s31、将全细胞生物传感器e.coli dh5α/ppnp-mrfp或e.colidh5α/ppnp-amilcp接种到含有卡那霉素的培养基中进行培养后收集，然后加入到含有乳糖和多粘菌素b(pmb)的培养基中复苏；
134.s32、将复苏后的全细胞生物传感器加入到孔板上的每个小孔中，每个小孔中装有已知对硝基酚浓度的标样样品，然后加入edta，将孔板放在摇床上孵育后，测定孔板每个小孔荧光强度值或吸光度值，并建立对硝基酚浓度和荧光强度值或吸光度值之间的标准曲线方程；
135.s33、将复苏的全细胞生物传感器细胞加入到孔板上的每个小孔中，每个小孔中装有待测对硝基酚样品，然后加入edta，将孔板放在摇床上孵育后，测定孔板每个小孔荧光强度值或吸光度值，通过所述对硝基酚浓度和荧光强度值或吸光度值之间的标准曲线方程，计算得到所述待测对硝基酚样品的浓度。
136.本实施例中，在构建了上述全细胞生物传感器的基础上，使用edta和多粘菌素b重构对对硝基酚敏感的全细胞生物传感器，用于检测土壤中提取态对硝基酚时，对硝基酚与阻遏蛋白pobr的结合消除了pobr与操纵基因位点(pobo)的结合，转录反方向的荧光蛋白或色蛋白基因，产生荧光蛋白或色蛋白，且不同浓度的对硝基酚会诱导全细胞生物传感器产生不同量的荧光蛋白或色蛋白，通过检测荧光强度值(荧光蛋白)或吸光度值(色蛋白)，确定荧光强度值或吸光度值与对硝基酚浓度之间的关系，实现土壤中提取态对硝基酚的快速、高通量检测。
137.步骤s31中，将全细胞生物传感器e.colidh5α/ppnp-mrfp或e.colidh5α/ppnp-amilcp接种到含有50mg/l卡那霉素抗生素的lb液体培养基中，培养4～5小时后收集。
138.步骤s32中，所述加入到含有乳糖和多粘菌素b(pmb)的培养基中进行复苏的全细胞生物传感器(e.colidh5α/ppnp-mrfp或e.coli dh5α/ppnp-amilcp)与含有乳糖和多粘菌
素b(pmb)的培养基的比例为(3～4)mg：100μl。
139.下面通过具体的实施例对本发明作进一步地说明。
140.以下实施例中采用的菌种和质粒信息如表1所示。
141.表1菌种和质粒的信息
[0142][0143]
实施例1
[0144]
全细胞生物传感器e.coli bl21/ppnp-mrfp的制备：
[0145]
(1)利用引物聚合酶链反应(pcr)，从pet22b-yfp质粒上克隆到pet22b质粒骨架结构的ppnp基因片段(4677bp)的基因序列，退火温度为53℃；
[0146]
扩增ppnp基因片段采用的引物：
[0147]
正向引物序列(ppnpf)：gagatccggctgctaacaaagc；
[0148]
反向引物序列(ppnpr)：ggatccgcgacccatttgc；
[0149]
(2)利用引物聚合酶链反应(pcr)，从pmv_pobro质粒上克隆pobro-m报告基因片段(842bp)的基因序列，退火温度为60℃；
[0150]
扩增pobro-m报告基因片段采用的引物：
[0151]
正向引物序列(pobr-mf)：ttataccagattgcgcagttcgttg；
[0152]
反向引物序列(pobr-mr)：aaaccattttggatttgaatgttatgatggaacaaca
[0153]
ccatcagtatttgg；
[0154]
(3)利用引物聚合酶链反应(pcr)，从puc19_mrfp质粒上克隆mrfp报告基因片段(860bp)的基因序列，退火温度为60℃；
[0155]
扩增mrfp报告基因片段采用的引物：
[0156]
正向引物序列(mrfpf)：ccaaatactgatggtgttgttccatcataacattcaaatccaaaatggttt；
[0157]
反向引物序列(mrfpr)：tcatttatataattcgtccatgccac。
[0158]
(4)以pobro-m报告基因片段和mrfp报告基因片段的扩增产物的混合物(1:1，v/v)为模板，以pobr-mf/mrfpr引物，利用引物聚合酶链反应，得到pobro-m-mrfp基因；
[0159]
采用的引物：
[0160]
正向引物序列(pobr-mf)：ttataccagattgcgcagttcgttg；
[0161]
反向引物序列为(mrfpr)：tcatttatataattcgtccatgccac；
[0162]
(5)使用pclone007 blunt simple vector kit试剂盒将pobro-m-mrfp基因连接到pclone007骨架上，获得pclone007_pobro-m-mrfp质粒；
[0163]
(6)从pclone007_pobro-m-mrfp质粒上克隆pobro-m-mrfp基因片段(1694bp)的基因序列，退火温度为64℃，设计引物时，添加同源片段；
[0164]
扩增加同源臂pobro-m-mrfp基因片段采用的引物：
[0165]
正向引物序列(pobr-mrfp-f)：ttataccagattgcgcagttcgttg
[0166]
反向引物序列(pobr-mrfp-r)：
[0167]
gctttgttagcagccggatctctcatttatataattcgtccatgcc；
[0168]
(7)将pobro-m-mrfp基因片段的基因序列和ppnp基因片段的基因序列通过同源重组酶连接，将pobro-m-mrfp基因片段和ppnp基因片段加入到pcr管中，用移液器轻轻吹打混匀，低速瞬时离心所有液体至离心管底部，载体用100ng，载体与插入片段的摩尔比1:1，各片段之固摩尔比为1:1，其中，pmols＝(质量ng
×
1000)/(片段长度bp
×
650daltons)，混合液在50℃反应15min，得到连接产物；
[0169]
(8)取100μl冰浴上融化的e.coli dh5α感受态细胞置于离心管中，加入上述连接产物，轻轻混匀，冰上静置25min，42℃水浴热激45s，迅速转移至冰浴中，静置2min，向离心管中加入500μl不含抗生素的无茵lb培养基，混匀后37℃，200rpm复苏1h，吸取不同体积的复苏液均匀涂布到含50mg/l卡那霉素抗生素的lb培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养；
[0170]
(9)在培养基上挑点，使用无菌的10μl移液枪头在含50mg/l卡那霉素抗生素的lb培养基、含50mg/l卡那霉素和10mg/l对硝基酚的lb固体培养基上分别画线，筛选可以在两个培养基上生长，并在含50mg/l卡那霉素和10mg/l对硝基酚的lb固体培养基上长出颜色斑点的菌株，使用引物pcr鉴定重组后的质粒，退火温度为60℃，验证质粒的核心片段为2815bp；
[0171]
鉴定采用的引物：
[0172]
正向引物序列(tf)：gcaaatgggtcgcggatcc；
[0173]
反向引物序列(tr)：gctttgttagcagccggatctc；
[0174]
并测序验证所得含重组质粒菌种e.coli dh5α/ppnp-mrfp，ppnp-mrfp质粒图谱如图1所示。
[0175]
(10)使用无菌的接种环将菌种接种在含50mg/l卡那霉素和10mg/l对硝基酚的lb液体培养基中，培养24h后，以10000
×
g的相对离心力离心收集菌体，使用质粒提取试剂盒提取ppnp-mrfp质粒，通过普通质粒热击转化试验，将提取获得的ppnp-mrfp质粒导入e.coli bl21菌株中，获得全细胞生物传感器e.coli bl21/ppnp-mrfp。
[0176]
实施例2
[0177]
全细胞生物传感器e.coli bl21/ppnp-amilcp的制备：
[0178]
(1)利用引物聚合酶链反应，从pet22b-yfp质粒上克隆ppnp基因片段(4677bp)的基因序列，退火温度为53℃；
[0179]
扩增ppnp基因片段采用的引物：
[0180]
正向引物序列(ppnpf)：gagatccggctgctaacaaagc；
[0181]
反向引物序列(ppnpr)：ggatccgcgacccatttgc；
[0182]
(2)利用引物聚合酶链反应，从pmv_pobro质粒上克隆pobro-a报告基因片段(949bp)的基因序列，退火温度为55℃；
[0183]
扩增pobro-a报告基因片段采用的引物：
[0184]
正向引物序列(pobr-af)：ttataccagattgcgcagttcgttg；
[0185]
反向引物序列(pobr-ar)：atgtatatctccttgctattttctatttt；
[0186]
(3)利用引物聚合酶链反应，从puc19_amilcp质粒上克隆amilcp报告基因片段(698bp)的基因序列，退火温度为55℃；
[0187]
扩增amilcp报告基因片段采用的引物：
[0188]
正向引物序列(amilcpf)：aaaatagaaaatagcaaggagatatacatat
[0189]
gagtgtgatcgctaaacaaatg；
[0190]
反向引物序列(amilcpr)：ttattaggcgaccacaggtttg；
[0191]
(4)以pobro-a报告基因片段和amilcp报告基因片段的扩增产物的混合物(1:1，v/v)为模板，以pobr-af/amilcpr引物，利用引物聚合酶链反应，得到pobro-a-amilcp基因；
[0192]
采用的引物：
[0193]
正向引物序列(pobr-af)：ttataccagattgcgcagttcgttg
[0194]
反向引物序列(amilcpr)：aaaatagaaaatagcaaggagatatacatat
[0195]
gagtgtgatcgctaaacaaatg；
[0196]
(5)使用pclone007 blunt simple vector kit试剂盒将pobro-a-amilcp基因连接到pclone007骨架上，获得pclone007_pobro-a-amilcp质粒；
[0197]
(6)从pclone007_pobro-a-amilcp质粒上克隆pobro-a-amilcp(1640bp)基因片段的基因序列，退火温度为60℃，设计引物时，添加同源片段。
[0198]
扩增加同源臂pobro-a-amilcp基因片段采用的引物：
[0199]
正向引物序列(pobr-amilcp-f)：ttataccagattgcgcagttcgttg；
[0200]
反向引物序列(pobr-amilcp-r)：gctttgttagcagccggatctcttattaggcgaccacaggttt；
[0201]
(7)将pobro-a-amilcp基因片段的基因序列和ppnp基因片段的基因序列通过同源重组酶连接，将pobro-a-amilcp基因片段和ppnp基因片段添加到pcr管中，用移液器轻轻吹打混匀，低速瞬时离心所有液体至离心管底部，载体用100ng，载体与插入片段的摩尔比1:1，各片段之固摩尔比为1:1，其中pmols＝(质量ng
×
1000)/(片段长度bp
×
650daltons)，混合液在50℃反应15min，得到连接产物；
[0202]
(8)取100μl冰浴上融化的e.coli dh5α感受态细胞，加入上述连接产物，轻轻混匀，冰上静置25min，42℃水浴热激45s，迅速转移至冰浴中，静置2min，向离心管中加入500μl不含抗生素的无茵lb培养基，混匀后37℃，200rpm复苏1h，吸取不同体积的复苏液均匀涂布到含50mg/l卡那霉素抗生素的lb培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养；
[0203]
(9)在培养基上挑点，使用无菌的10μl移液枪头在含50mg/l卡那霉素抗生素的lb培养基、含50mg/l卡那霉素和10mg/l对硝基酚的lb固体培养基上分别画线，筛选可以在两个培养基上生长，并在含50mg/l卡那霉素和10mg/l对硝基酚的lb固体培养基上长出颜色斑点的菌株，使用引物pcr鉴定重组后的质粒，退火温度为60℃，验证质粒的核心片段为2761bp。
[0204]
鉴定采用的引物：
[0205]
正向引物序列(tf)：gcaaatgggtcgcggatcc；
[0206]
反向引物序列(tr)：gctttgttagcagccggatctc；
[0207]
并测序验证所得含重组质粒菌种e.coli dh5α/ppnp-amilcp，ppnp-amilcp质粒图谱如图1所示。
[0208]
(10)使用无菌的接种环将菌种接种在含50mg/l卡那霉素和10mg/l对硝基酚的lb液体培养基中，培养24h后，以10000
×
g的相对离心力离心收集菌体，使用质粒提取试剂盒提取ppnp-amilcp质粒，通过普通质粒热击转化试验，将提取获得的ppnp-amilcp质粒导入e.coli bl21菌株中，获得全细胞生物传感器e.coli bl21/ppnp-amilcp。
[0209]
测试：
[0210]
(1)如图4所示，将实施例1中的全细胞生物传感器e.coli bl21/ppnp-mrfp接种于含50mg/l卡那霉素抗生素的lb液体培养基，在37℃下培养4小时，150r/min剧烈振荡，od
600 nm
为0.450～0.500，以4000
×
g的相对离心力离心10min收集，然后加入到10％乳糖和0.50μg/mlpmb的1/4lb培养基中复苏，每100μl培养基中含4mg全细胞生物传感器；
[0211]
将100μl重新复苏的全细胞生物传感器加入到96孔板(corning，america)上的每个小孔中，每个小孔分装100μl检测样品(含对硝基酚标样的土壤提取物，对硝基酚的浓度分别为0、10、25、50、75、100、250、500、750、1000、2500、5000、7500、10000μg/l)，并加入25μl 125mmol/ledta，混合均匀，盖上盖子后，将96孔板放在30℃摇床(300转/分钟)上孵育4.5小时。使用spectramaxm5酶标仪测定试验96孔板每个小孔红色荧光强度值，并建立对硝基酚浓度和荧光强度值之间的标准曲线的方程y＝82.2x，r2＝0.980(x表示对硝基酚浓度的对数值，y表示测得的荧光强度值，r2为线性拟合时的相关系数)，结果如图3中(a)所示，证明全细胞生物传感器的报告基因的响应值和检测底物浓度的对数之间存在线性相关关系。
[0212]
(2)将实施例2中的全细胞生物传感器e.coli bl21/ppnp-amilcp接种于含50mg/l卡那霉素抗生素的lb液体培养基，在37℃下培养4小时，150r/min剧烈振荡，od
600 nm
为0.450-0.500，以4000
×
g的相对离心力离心10min收集，然后加入到10％乳糖和0.50μg/mlpmb的1/4lb培养基中复苏；
[0213]
将100μl重新复苏的全细胞生物传感器加入到96孔板(corning，america)上的每个小孔中，每个小孔分装100μl检测样品(含对硝基酚标样的土壤提取物，对硝基酚的浓度分别为0、10、25、50、75、100、250、500、750、1000、2500、5000、7500、10000μg/l)，并加入25μl 12mmol/ledta，混合均匀，盖上盖子后，将96孔板放在30℃摇床(300转/分钟)上孵育4.5小时，使用spectramaxm5酶标仪测定试验96孔板每个小孔吸光度值，并建立对硝基酚浓度和吸光度值之间的标准曲线方程y＝0.310x，r2＝0.978(x表示对硝基酚浓度的对数值，y表示测得的吸光度值，r2为线性拟合时的相关系数)，结果如图3中(b)所示，证明全细胞生物传感器的报告基因的响应值和检测底物浓度的对数之间存在线性相关关系，可将获得的标准曲线用于分析污染土壤中对硝基酚含量。
[0214]
上述全细胞生物传感器的检测限(dl)根据以下公式计算：
[0215]
dl＝3sd/s，其中sd是空白对照的标准偏差，s是标准曲线的斜率。
[0216]
上述采用全细胞生物传感器方法检测土壤中可提取态对硝基酚的检出限和线性范围，如表2所示。
[0217]
表2全细胞生物传感器测定土壤中可提取态对硝基酚的检测参数
[0218][0219]
注：mrfp表示全细胞生物传感器e.coli bl21/ppnp-mrfp的报告基因，iicp表示全细胞生物传感器e.coli bl21/ppnp-amilcp的报告基因，hplc表示高效液相色谱。
[0220]
(2)采用上述方法，随机取对硝基酚污染的s
1-10
土壤浸出液和两种采集于南京的对硝基酚污染土壤(sa和sb)浸出液进行测试，分别利用全细胞生物传感器e.coli bl21/ppnp-mrfp和e.coli bl21/ppnp-amilcp检测，结果如表3所示。
[0221]
表3全细胞生物传感器测定土壤样品中对硝基酚的浓度
[0222][0223]
注：bc和hplc分别表示使用全细胞生物传感器和高效液相色谱测定的对硝基苯酚浓度，dc表示用全细胞生物传感器检测的对硝基苯酚浓度和高效液相色谱测定的对硝基苯酚浓度之间的标准偏差。
[0224]
结果表明，利用全细胞生物传感器测定土壤中对硝基酚的含量结果稳定且具有重现性，该芳芳可靠可行，具有实际应用价值。
[0225]
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0226]
(1)本发明能够有效的检测土壤中对硝基酚的含量；
[0227]
(2)本发明可以在检测土壤中对硝基酚的同时并不引入任何有机化学试剂；
[0228]
(3)本发明为土壤中生物有效态对硝基酚的研究提供了有力手段。
[0229]
综上所述，本发明提供了用于检测对硝基酚的全细胞生物传感器及检测方法，全细胞生物传感器用于检测土壤中提取态对硝基酚时，对硝基酚与阻遏蛋白pobr的结合消除了pobr与操纵基因位点(pobo)的结合，转录反方向的基因荧光蛋白或色蛋白，产生荧光蛋白或色蛋白，通过检测荧光强度值或吸光度值，实现土壤中提取态对硝基酚的快速、高通量检测。
[0230]
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。