一种快速判定芽孢存活情况的方法与流程

1.本发明涉及灭菌效力检测领域，尤其涉及一种快速判定芽孢存活情况的方法。


背景技术：

2.某些产孢细菌在恶劣的环境下（如缺乏营养物质）会产生芽孢。芽孢是一种休眠体，它对于常规的灭菌手段（高温，酒精，强氧化剂，紫外线，化学毒物等）具有较强的抗力。因此，芽孢常常被用作消毒灭菌的生物指示剂：将一定量的芽孢和待灭菌的器械分别包装后一起放入灭菌设备，灭菌后检测芽孢是否被杀灭，如杀灭，则说明灭菌过程合格，反之则不合格。目前常用的检测芽孢存活情况的光化学方法主要有：tb-dpa（terbium-dipicolinic acid）检测法、micro-eva（microscopy-based endospore viability assay）检测法和α葡萄糖苷酶（α-glucosidase）检测法。
3.其中，α葡萄糖苷酶检测法是一种通过探测α葡萄糖苷酶的活性来间接判断芽孢活性的方法，因芽孢的孢衣中富含α葡萄糖苷酶，而α葡萄糖苷酶的活性与芽孢的活性具有较好的相关性。具体地说，在待测样液中添加4-甲基伞型酮-α-d-葡糖苷酸（4-methylumbelliferyl-α-d-glucoside，简称4-mug），4-mug虽然其本身无荧光特性，但其被α葡萄糖苷酶水解后的产物4-甲基伞型酮（4-methylumbelliferone，简称4-mu）具有荧光特性，在合适的激发光下（激发波长约为365nm），4-mu的发射光谱在440nm～465nm处有显著的峰。所以如果在待测样液中加入4-mug，即可通过待测样液的荧光强度可以来判断α葡萄糖苷酶的活性，继而推断芽孢的活性。
4.但是，目前的α葡萄糖苷酶检测法仅用于检测样液中的芽孢，故灵敏度相对较低，应用场景受限，而且无法检测单个具有活性的芽孢。


技术实现要素：

5.为了解决上述现有技术的不足，本发明提供一种快速判定芽孢存活情况的方法，此方法基于α葡萄糖苷酶检测法，可快速判定芽孢的活性，且能够判断单个芽孢的活性。
6.本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：一种快速判定芽孢存活情况的方法，包括如下步骤：s100：对芽孢进行灭菌处理；s200：将灭菌处理后的芽孢配制芽孢悬液；s300：将适量上述配制的芽孢悬液滴在固态培养基上，所述固态培养基内含有4-mug；s400：待所述芽孢悬液充分渗入所述固体培养基内后，在激发光源下，观察所述固态培养基；s500：根据观察到的所述固体培养基上的荧光点数目，判断存活的芽孢数量。
7.进一步地，所述芽孢包括萎缩芽孢杆菌(b. atrophaeus)、枯草芽孢杆菌(b. subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(g. stearothermophilus)和短小芽孢杆菌(b. pumilus)等
中的一种或多种的芽孢。
8.进一步地，对所述芽孢的灭菌处理方法为湿热灭菌法、干热灭菌法、过氧化氢灭菌法、环氧乙烷灭菌法或低温蒸汽甲醛灭菌法等常用灭菌法。
9.进一步地，步骤s100中，所述芽孢在灭菌时载于一载玻片上。
10.进一步地，步骤s200中，将经过灭菌处理的芽孢置入缓冲液或回收液中，经反复洗涤、离心、过滤和去除残渣后，得到所述芽孢悬液。
11.进一步地，所述固态培养基的组分包括：琼脂、胰酪大豆胨（tryptic soy broth）和4-mug。
12.进一步地，步骤s300之前，还包括步骤：配制所述固态培养基。
13.进一步地，配制所述固态培养基的步骤如下：将琼脂和胰酪大豆胨按比例与水混合并高温灭菌，获取液态培养基；将适量液态培养基滴在一载玻片上，冷却凝固后得到所述固态培养基；再在所述固态培养基上按比例滴加4-mug，待4-mug渗入所述固态培养基内。
14.进一步地，步骤s400中，在激发光源下，观察所述固态培养基的步骤如下：s401：在所述固态培养基的观察区域外围上，设置一隔垫物；s402：在所述隔垫物上盖上一块聚二甲基硅氧烷（pdms）盖板；s403：采用所述激发光源对所述固态培养基上的观察区域进行照射，对所述观察区域内的固体培养基进行观察。
15.进一步地，所述激发光源的波长为340-380nm。
16.本发明具有如下有益效果：该方法基于α葡萄糖苷酶检测法来快速判定芽孢存活情况，通过先将4-mug滴加到所述固态培养基上，然后将所述芽孢悬液滴于所述固态培养基上，利用尚存活性的α-葡萄糖苷酶（如有的话）以及所述固态培养基中的营养物质诱导存活的芽孢萌发生长，并使之通过新陈代谢合成足量的α-葡萄糖苷酶，并同时利用所述固态培养基限制4-mug被α-葡萄糖苷酶水解后的产物4-mu向外扩散，使水解产物4-mu聚集在存活的各个芽孢外围，以在激发光源下形成与存活的各个芽孢对应的各个光点，不仅可快速所述芽孢的活性，还能够判断单个芽孢的活性。
附图说明
17.图1为本发明提供的快速判定芽孢存活情况的方法的步骤框图；图2为本发明提供的快速判定芽孢存活情况的方法的原理示意图。
具体实施方式
18.下面结合附图和实施例对本发明进行详细的说明，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
19.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装
置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
20.此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”、“第三”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
21.在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”、“设置”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，还可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
22.如图1所示，一种快速判定芽孢存活情况的方法，包括如下步骤：s100：对芽孢进行灭菌处理。
23.在该步骤s100中，所述芽孢包括萎缩芽孢杆菌(b. atrophaeus)、枯草芽孢杆菌(b. subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(g. stearothermophilus)和短小芽孢杆菌(b. pumilus)等中的一种或多种的芽孢；对所述芽孢的灭菌处理方法可以但不限于为湿热灭菌法、干热灭菌法、过氧化氢灭菌法、环氧乙烷灭菌法或低温蒸汽甲醛灭菌法等常用灭菌法。
24.所述芽孢的具体菌种应视具体的灭菌处理方法而定，比如，若所述灭菌处理方法采用环氧乙烷灭菌法，则所述芽孢包括萎缩芽孢杆菌atcc 9372、nctc 10073、ncimb 8058、dsm 2277、nrrl b-4418或cip 77 .18中的一种或多种的芽孢；若所述灭菌处理方法采用湿热灭菌法，则所述芽孢包括嗜热脂肪芽孢杆菌atcc 7953(nctc 10007、dsm 22和cip 52 .81)或atcc 12980(同nrrl b-4419)中的一种或多种的芽孢；若所述灭菌处理方法采用干热灭菌法，则所述芽孢包括萎缩芽孢杆菌cip 77 .18、ncimb 8058、dsm 675、nrrl b-4418 和atcc 9372或者枯草芽孢杆菌dsm 13019中的一种或多种的芽孢；若所述灭菌处理方法为低温蒸汽甲醛灭菌法，则所述芽孢包括嗜热脂肪芽孢杆菌ncib 8224、dsm 6790、atcc 10149或atcc 12980中的一种或多种芽孢；若所述灭菌处理方法为过氧化氢灭菌法，则所述芽孢包括嗜热脂肪芽孢杆菌atcc 7953或ssi k31中的一种或多种芽孢。
25.根据《医疗保健产品灭菌 生物指示物》中规定：采用湿热灭菌法或低温蒸汽甲醛灭菌法时，活菌量不少于1.0
×
105个，采用环氧乙烷灭菌法、过氧化氢灭菌法或干热灭菌法时，活菌量不少于1.0
×
106个。
26.优选地，所述芽孢在灭菌时载于一载玻片上。
27.s200：采用灭菌处理后的芽孢配制芽孢悬液。
28.在该步骤s200中，将经过灭菌处理的芽孢置入缓冲液或回收液中，经反复洗涤、离心和去除残渣后，得到所述芽孢悬液。
29.其中，所述缓冲液是浓度为0.03m，ph为7.2的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的具体成分和配置方法属于本领域的公知常识，故不做详细记载。所述回收液包括0.1%的吐温80和上述缓冲液。
30.s300：将适量上述配制的芽孢悬浊液滴在固态培养基上，所述固态培养基内含有4-mug。
31.在该步骤s300中，滴在所述固态培养基上的芽孢悬液的量可视具体检测需求而定，本案仅需在所述芽孢悬液中提取一滴或两滴，滴在所述固态培养基上即可。
32.所述固态培养基包含琼脂、胰酪大豆胨（tryptic soy broth，tbs）和4-mug，其中琼脂按照30g/l进行配比，胰酪大豆胨按照15g/l进行配比，4-mug在所述固态培养基中的浓度为50-500mg/l。
33.在该步骤s300之前，还包括步骤：配制所述固态培养基。
34.其中，配制所述固态培养基的步骤如下：将琼脂和胰酪大豆胨按比例与水混合并高温灭菌，获取液态培养基；将适量液态培养基滴在一载玻片上，冷却凝固后得到所述固态培养基；再在所述固态培养基上按比例滴加4-mug，待4-mug渗入所述固态培养基内。
35.其中，滴在所述载玻片上的液态培养基的量可视具体检测需求而定，本案仅需在所述液态培养基中提取一滴或两滴，滴在所述载玻片上即可。
36.s400：待所述芽孢悬液充分渗入所述固体培养基后，在激发光源下，观察所述固态培养基。
37.在该步骤s400中，在观察系统下对所述固态培养基上的芽孢悬液进行观察。所述芽孢悬液中存活的芽孢吸收所述固态培养基中的各营养组分后，会萌发生长，并通过新陈代谢合成足量的α-葡萄糖苷酶，接着所述固态培养基中的4-mug被灭菌后残余的α-葡萄糖苷酶（如有的话）以及存活的芽孢新合成的α-葡萄糖苷酶水解，生成荧光指示物质4-mu；4-mu在340-380nm的激发光源产生荧光。
38.最优的，所述激发光源的波长为365nm左右。
39.其中，步骤s400中，在激发光源下，观察所述固态培养基上的芽孢悬液的步骤如下：s401：在所述固态培养基的观察区域外围上，设置一隔垫物。
40.在该步骤s401中，所述隔垫物应当环绕所述观察区域，所述观察区域的范围可以包含所述固态培养基上滴加所述芽孢悬液的整体区域，也可以包含所述固态培养基上滴加所述芽孢悬液的局部区域，视具体观察需求而定。
41.本案中，所述隔垫物为橡胶圈。
42.s403：采用所述激发光源对所述固态培养基上的观察区域进行照射，对所述观察区域内的固体培养基进行观察。
43.s500：根据观察到的所述固体培养基上的荧光点数目，判断存活的芽孢数量。
44.在该步骤s500中，如图2所示，由于4-mug位于所述固态培养基内，4-mug被α-葡萄糖苷酶水解后形成的4-mu也会被所述固态培养基限制，无法向外扩散，进而聚集在存活的各个芽孢的外围上，当在激发光源下观察时，检测人员会观察到一个个的光点，一个光点即代表存活的一个芽孢，根据光点数目判定所述固态培养基上存活的芽孢的数量，进而按所述芽孢悬液的滴加比例推算出整个灭菌处理过程中存活的芽孢总数，最终评估灭菌处理的灭菌过程是否合格。
45.该方法基于α葡萄糖苷酶检测法来快速判定芽孢存活情况，通过先将4-mug滴加到所述固态培养基上，然后将所述芽孢悬液滴于所述固态培养基上，利用尚存活性的α-葡萄糖苷酶（如有的话）以及所述固态培养基中的营养物质诱导存活的芽孢萌发生长，并使之通
过新陈代谢合成足量的α-葡萄糖苷酶，并同时利用所述固态培养基限制4-mug被α-葡萄糖苷酶水解后的产物4-mu向外扩散，使水解产物4-mu聚集在存活的各个芽孢外围，以在激发光源下形成与存活的各个芽孢对应的各个光点，不仅可快速所述芽孢的活性，还能够判断单个芽孢的活性。
46.实施例一（用3m 1292压力蒸汽灭菌生物指示剂）本实施例选定3m 1292压力蒸汽灭菌生物指示剂（指示剂）6支。每支指示剂的菌片上含有约106个嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢。将6支指示剂分为3组，每组2支。将生物指示剂放入压力蒸汽灭菌抗力检测仪（抗力仪）中作灭菌处理，灭菌温度为121℃，灭菌时间分别是0min，8 min和24 min共3组。121℃处理0min即不作任何处理，为实验对照组；121℃处理8 min模拟灭菌不彻底的情况；121℃处理24 min，芽孢理论上应该被全部杀灭，以此模拟灭菌成功的情况。所述指示剂的暴露位置位于灭菌设备的冷点。经灭菌处理之后，将样本转移至超净工作台。用灭菌过的镊子取出3组经过灭菌处理的生物指示剂内含的菌条，置入无菌离心管中，并加入适量无菌回收液（0.1%吐温80，0.03m磷酸缓冲液，ph为7.2），充分震荡，打烂菌条。之后将离心管置于冰浴中，待冷却。
47.之后将离心管内的样品离心（离心力2000
×
g，温度4℃，离心时间20min），将所得上清液用10
µ
m微孔滤膜过膜（芽孢直径1-2
µ
m，故为了使芽孢通过滤膜，而菌条碎渣被阻挡，需要用2
µ
m以上的滤膜），得到滤液。
48.在上述离心过滤后所得的滤渣（主要成分为打烂的菌条纤维）中加入适量无菌回收液，震荡摇匀后再次重复上述离心过滤过程，进一步回收含有热损伤芽孢的滤液，如此重复2-3次，将各次离心过滤所得滤液汇集为所述芽孢悬液。
49.在载玻片上滴加一滴经高温灭菌过的液态培养基（琼脂30g/l，胰酪大豆胨15g/l），待其凝固后，在固态培养基上滴加一滴浓度为210mg/l 的4-mug，稍后片刻待其充分渗入所述固态培养基内。
50.在所述固态培养基内上滴加一滴所述芽孢悬液（含有热损伤的芽孢）。
51.在观察系统下观察荧光光点的数量和大小。所述观测系统由四部分组成：1）一部立体显微镜（品牌型号可以是：nikon smz800）；2）一部安装在上述立体显微镜上的时间门控相机（品牌型号可以是：photonics research systems，salford，英国）；3）相对于样品呈45
°
角的氙闪光灯（品牌型号可以是：perkinelmer，waltham，ma），以及4）一个温控显微镜载玻片架（品牌型号可以是：thermal）。
52.观察系统设置的参数如下：氙闪光灯激发波长365nm，激发狭缝宽10nm。立体显微镜所观测的发射波长544nm，发射狭缝为10nm。观测光点数量及强度，结果见表1。
53.表1
编号处理条件观察结果结论a-1121℃、0min大片重叠的荧光，无法辨别“点”的存在未灭菌a-2121℃、8min一定量的零散的荧光点灭菌不彻底a-3121℃、24min无荧光点彻底灭绝
实施例二（用3m 1295过氧化氢灭菌生物指示剂）本实施例选定3m 1295过氧化氢灭菌生物指示剂（指示剂）6支。每支指示剂的菌片上含有约106个萎缩芽孢杆菌的芽孢。将6支指示剂分为3组，每组2支。将生物指示剂放入过
氧化氢灭菌抗力检测仪（抗力仪）中作灭菌处理，灭菌温度为50℃，过氧化氢浓度为1.74 mg/l，灭菌时间分别是0 sec，20 sec和60 sec共3组。50℃处理0 sec即不作任何处理，为实验对照组；50 ℃处理20 sec模拟灭菌不彻底的情况；50℃处理60 sec，芽孢理论上应该被全部杀灭，以此模拟灭菌成功的情况。所述指示剂的暴露位置位于灭菌设备的冷点。经灭菌处理之后，将样本转移至超净工作台。用灭菌过的镊子取出3组经过灭菌处理的生物指示剂内含的菌条，置入无菌离心管中，并加入适量无菌回收液（0.1%吐温80，0.03m磷酸缓冲液，ph为7.2），充分震荡，打烂菌条。之后将离心管置于冰浴中，待冷却。
54.之后将离心管内样品离心（离心力2000
×
g，温度4℃，离心时间20min），将所得上清液用10
µ
m微孔滤膜过膜（芽孢直径1-2
µ
m，故为了使芽孢通过滤膜，而菌条碎渣被阻挡，需要用2
µ
m以上的滤膜），得到滤液。
55.在上述离心过滤后所得的滤渣（主要成分为打烂的菌条纤维）中加入适量无菌回收液，震荡摇匀后再次重复上述离心过滤过程，进一步回收含有热损伤芽孢的滤液，如此重复2-3次，将各次离心过滤所得滤液汇集为所述芽孢悬液。
56.在载玻片上滴加一滴经高温灭菌过的液态培养基（琼脂30g/l，胰酪大豆胨15g/l），待其凝固后，在固态培养基上滴加一滴浓度为210mg/l 的4-mug，稍后片刻待其充分渗入所述固态培养基内。
57.在所述固态培养基内上滴加一滴所述芽孢悬液（含有热损伤的芽孢）。
58.在观察系统下观察荧光光点的数量和大小。所述观测系统有四部分组成：1）一部立体显微镜（品牌型号可以是：nikon smz800）；2）一部安装在上述立体显微镜上的时间门控相机（品牌型号可以是：photonics research systems，salford，英国）；3）相对于样品呈45
°
角的氙闪光灯（品牌型号可以是：perkinelmer，waltham，ma），以及4）一个温控显微镜载玻片架（品牌型号可以是：thermal）。
59.观察系统设置的参数如下：氙闪光灯激发波长365nm，激发狭缝宽10nm。立体显微镜所观测的发射波长544nm，发射狭缝为10nm。观测光点数量及强度，结果见表2。
60.表2
编号处理条件观察结果结论b-150℃、1.74mg/l、0sec大片重叠的荧光，无法辨别“点”的存在未灭菌b-250℃、1.74mg/l、20sec一定量的零散的荧光点灭菌不彻底b-350℃、1.74mg/l、60sec无荧光点彻底灭绝
实施例三（用自制的枯草芽孢杆菌的芽孢经压力蒸汽灭菌）本实施例选定新华产mesa
®
strip芽孢条6条，分为3组，每组2条。将菌条放入压力蒸汽灭菌抗力检测仪（抗力仪）中作灭菌处理，灭菌温度为121℃，灭菌时间分别是0 min，8 min和24 min共3组。121℃处理0 min即不作任何处理，为实验对照组；121℃处理8 min模拟灭菌不彻底的情况；121℃处理24 min，芽孢理论上应该被全部杀灭，以此模拟灭菌成功的情况。所述指示剂的暴露位置位于灭菌设备的冷点。经灭菌处理之后，将样本转移至超净工作台。用灭菌过的镊子取出3组经过灭菌处理的生物指示剂内含的菌条，置入无菌离心管中，并加入适量无菌回收液（0.1%吐温80，0.03m磷酸缓冲液，ph为7.2），充分震荡，打烂菌条。之后将离心管置于冰浴中，待冷却。
61.在载玻片上滴加一滴经高温灭菌过的液态培养基（琼脂30g/l，胰酪大豆胨15g/
l），待其凝固后，在固态培养基上滴加一滴浓度为210mg/l 的4-mug，稍后片刻待其充分渗入所述固态培养基内。
62.在所述固态培养基内上滴加一滴所述芽孢悬液（含有热损伤的芽孢）。
63.在观察系统下观察荧光光点的数量和大小。所述观测系统有四部分组成：1）一部立体显微镜（品牌型号可以是：nikon smz800）；2）一部安装在上述立体显微镜上的时间门控相机（品牌型号可以是：photonics research systems，salford，英国）；3）相对于样品呈45
°
角的氙闪光灯（品牌型号可以是：perkinelmer，waltham，ma），以及4）一个温控显微镜载玻片架（品牌型号可以是：thermal）。
64.观察系统设置的参数如下：氙闪光灯激发波长365nm，激发狭缝宽10nm。立体显微镜所观测的发射波长544 nm，发射狭缝为10 nm。观测光点数量及强度，结果见表3。
65.表3
编号处理条件观察结果结论c-1121℃、0min大片重叠的荧光，无法辨别“点”的存在未灭菌c-2121℃、8min一定量的零散的荧光点灭菌不彻底c-3121℃、24min无荧光点彻底灭绝
实施例四（用自制的萎缩芽孢杆菌的芽孢经过氧化氢灭菌）本实施例选定新华产mesa
®
strip芽孢条6条，分为3组，每组2条。将菌条放入过氧化氢灭菌抗力检测仪（抗力仪）中作灭菌处理，灭菌温度为50℃，过氧化氢浓度为1.74 mg/l，灭菌时间分别是0 sec，20 sec和60 sec共3组。50℃处理0 sec即不作任何处理，为实验对照组；50 ℃处理20 sec模拟灭菌不彻底的情况；50℃处理60 sec，芽孢理论上应该被全部杀灭，以此模拟灭菌成功的情况。所述指示剂的暴露位置位于灭菌设备的冷点。经灭菌处理之后，将样本转移至超净工作台。用灭菌过的镊子取出3组经过灭菌处理的生物指示剂内含的菌条，置入无菌离心管中，并加入适量无菌回收液（0.1%吐温80，0.03m磷酸缓冲液，ph为7.2），充分震荡，打烂菌条。之后将离心管置于冰浴中，待冷却。
66.在载玻片上滴加一滴经高温灭菌过的液态培养基（琼脂30g/l，胰酪大豆胨15g/l），待其凝固后，在固态培养基上滴加一滴浓度为210mg/l 的4-mug，稍后片刻待其充分渗入所述固态培养基内。
67.在所述固态培养基内上滴加一滴所述芽孢悬液（含有热损伤的芽孢）。
68.在观察系统下观察荧光光点的数量和大小。所述观测系统有四部分组成：1）一部立体显微镜（品牌型号可以是：nikon smz800）；2）一部安装在上述立体显微镜上的时间门控相机（品牌型号可以是：photonics research systems，salford，英国）；3）相对于样品呈45
°
角的氙闪光灯（品牌型号可以是：perkinelmer，waltham，ma），以及4）一个温控显微镜载玻片架（品牌型号可以是：thermal）。
69.观察系统设置的参数如下：氙闪光灯激发波长365nm，激发狭缝宽10nm。立体显微镜所观测的发射波长544 nm，发射狭缝为10 nm。观测光点数量及强度，结果见表4。
70.表4
编号处理条件观察结果结论d-150℃、1.74mg/l、0sec大片重叠的荧光，无法辨别“点”的存在未灭菌d-250℃、1.74mg/l、20sec一定量的零散的荧光点灭菌不彻底
d-350℃、1.74mg/l、60sec无荧光点彻底灭绝
最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明实施例的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明实施例进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解依然可以对本发明实施例的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明实施例技术方案的范围。