一种三氯卡班代谢质粒pDCA-TCC及其应用

一种三氯卡班代谢质粒pdca-tcc及其应用
技术领域
1.本发明属于应用环境微生物领域，涉及一种三氯卡班代谢质粒pdca-tcc及其应用。
技术背景
2.三氯卡班(3,4,4'-trichlorocarbanilide)是一种合成的广谱卤代芳香族抗菌剂，主要抑制革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性菌和真菌具有部分抗菌活性。在过去的60年中，三氯卡班已广泛用于医药和个人护理产品，如化妆品、沐浴露、洗涤剂、除臭剂等产品。全世界每年消耗大量三氯卡班并排放到污水处理厂。尽管美国食品药品监督管理局(fda)于2013年禁止在洗手液和香皂等日用品中使用三氯卡班，但三氯卡班在中国和印度仍然保持着巨大的市场需求。由于其水溶性差和顽固性，在美国、加拿大和中国的污水处理厂的进水中分别检测到84～11,400ng l-1
、4～270ng l-1
和4.7～170.0ng l-1
的三氯卡班。由于处理不充分，大约3％的三氯卡班仍然残留在污水处理厂的出水中，75％的三氯卡班被吸附在脱水污泥中。在中国，三氯卡班经常在各种水生环境中检测到，从每升几纳克到几千纳克不等。研究表明，水中的三氯卡班残留物对部分水生生物有毒，例如藻类、甲壳类动物和鱼类等。此外，三氯卡班可以通过食物链在哺乳动物和人体组织中积累，导致内分泌失调、潜在的致癌和遗传毒性作用。三氯卡班已被列为世界十大新兴环境污染物之一。因此，迫切需要采取措施消除三氯卡班及其有毒中间体潜在的环境问题和健康风险。以广宿主范围的、可自主转移的氯苯胺代谢质粒为基础，通过插入三氯卡班降解的第一步关键酶基因，构建出能够完全矿化三氯卡班的代谢质粒，并将该质粒导入安全无害的模式微生物中，获得降解三氯卡班的重组菌株。向三氯卡班污染的水体中接种该重组菌株，通过质粒介导的遗传生物强化可以有效地去除废水中的三氯卡班残留。三氯卡班代谢质粒介导的遗传生物强化可广泛应用于环境中三氯卡班污染的生物修复，具有广阔的应用前景。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种三氯卡班代谢质粒pdca-tcc。
4.本发明的另一目的是提供降解三氯卡班的重组菌株pseudomonas putida kt2440(pdca-tcc)。
5.本发明的又一目的是提供三氯卡班代谢质粒pdca-tcc的应用。
6.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
7.三氯卡班代谢质粒pdca-tcc，其核苷酸序列为seq id no.1，全长88534bp，pdca-tcc含有93个预测的orf，它们负责质粒复制、维持、接合转移以及重组和分解代谢。编码三氯卡班降解酶的基因主要由三氯卡班水解酶基因tcca2、氯苯胺双加氧酶基因簇dca、氯儿茶酚双加氧酶基因ccdc构成。
8.pdca-tcc中含有的三氯卡班水解酶基因tcca2全长(从起始密码子到终止密码子)为1425bp，位于seq id no.1的第75155bp～第76579bp，g+c含量为68％，编码474个氨基酸，
分子量为50kda。
9.本发明所述的三氯卡班水解酶基因tcca2编码的水解酶tcca2，氨基酸序列为seq id no.2。
10.pdca-tcc中含有的氯苯胺双加氧酶基因簇dca，位于seq id no.1的第5273bp～第8284bp，基因簇全长3012bp，主要由双加氧酶基因dcaa1a2和还原酶基因dcab构成。
11.pdca-tcc中含有的氯苯胺双加氧酶基因dcaa1a2，其α亚基基因dcaa1位于seq id no.1的第6938bp～第8284bp，基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1347bp，g+c含量为65％，编码448个氨基酸，分子量为50.6kda；β亚基基因dcaa2位于seq id no.1的第6297bp～第6941bp，该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为645bp，g+c含量为67％，编码214个氨基酸，分子量为23.9kda。
12.pdca-tcc中含有的氯苯胺还原酶基因dcab，位于seq id no.1的第5273bp～第6280bp，该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1008bp，g+c含量为69％，编码335个氨基酸，分子量为35.6kda。
13.pdca-tcc中含有的氯儿茶酚双加氧酶基因ccdc，位于seq id no.1的第82531bp～第83256bp，该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为726bp，g+c含量为60％，编码241个氨基酸，分子量为27.2kda。
14.一种含有本发明所述的三氯卡班代谢质粒pdca-tcc的三氯卡班降解菌。
15.作为本发明的一种优选，所述的宿主菌为pseudomonas putida kt2440。
16.有益效果
17.本发明提供一种编码高效、快速降解三氯卡班的代谢质粒pdca-tcc。野生型质粒pdca存在于含有多重抗生素抗性的原始宿主achromobacter sp.anb-1中，该菌株不仅难以进行遗传改造，且具有较大的生态环境风险。选择公认的实验室安全、无害的模式菌株pseudomonas putida kt2440作为质粒pdca的新宿主，不仅易于对质粒进行遗传改造，且新宿主菌对环境安全友好。野生型质粒pdca编码一整套氯苯胺降解的酶系，但不能作用于三氯卡班；在质粒上引入三氯卡班水解酶基因tcca2后，可将三氯卡班转化为氯苯胺，然后继续被氯苯胺降解酶系完全降解。三氯卡班水解酶基因tcca2插入野生型质粒pdca附属区的非编码区(75123～75364)，不破坏质粒骨架基因的结构，不影响质粒复制、接合和转移等正常生理功能。携带代谢质粒pdca-tcc的菌株pseudomonas putida kt2440具有较广的降解底物谱，不仅能高效降解三氯卡班，还能降解一系列氯苯胺衍生物，包括除草剂苯胺灵、氯苯胺灵，植物调节剂氯吡脲，杀虫剂除虫脲等有毒有害化合物。重组菌kt2440(pdca-tcc)可用于城市生活废水中三氯卡班残留的污染修复，可在3天内完全降解50μm的三氯卡班。本发明提供的代谢质粒pdca-tcc还可用于环境中苯胺灵、氯苯胺灵、氯吡脲和除虫脲等污染的生物强化修复。使用携带该代谢质粒的菌剂进行污染环境的生物强化具有生产使用成本低、使用方便、修复效果好等优点，具有良好的应用潜力和价值，对于保护生态环境、维护人类健康具有重要的意义。
附图说明
18.图1质粒pdca-tcc的基因图谱
19.图2菌株kt2440(pdca-tcc)在含有0.6mm三氯卡班的lb平板上产生水解圈
20.图3菌株kt2440(pdca-tcc)对三氯卡班的降解曲线
21.附图4菌株kt2440(pdca-tcc)降解底物谱
22.图5菌株kt2440(pdca-tcc)对三氯卡班污染水体的生物强化修复
具体实施方式
23.实施例1.三氯卡班代谢质粒的构建
24.1.1质粒pdca提取
25.质粒pdca的原始宿主achromobacter sp.anb-1(张龙.除草剂利谷隆及其代谢产物降解菌株的分离、降解酶基因及菌群协同代谢研究[d].南京：南京农业大学，2017)在lb培养基中大量培养后，采用碱裂解法提取较高纯度的质粒pdca的dna，溶于tris-edta(ph 8.0)缓冲液中，具体方法参考f
·
奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。分别通过琼脂糖凝胶电泳和nanodrop 2000(thermo fisher scientific，shanghai，china)来检测dna样品的质量和浓度。
[0026]
1.2构建重组菌株pseudomonas putida kt2440(pdca)
[0027]
由于质粒pdca的原始宿主achromobacter sp.anb-1含有多重抗生素抗性，且难以对其携带的质粒pdca进行遗传改造。因此，必须将pdca转移至新的易于遗传操作的宿主中进行基因工程改造。以菌株achromobacter sp.anb-1为供体菌，选择实验室常用的、安全无害的模式菌株pseudomonas putida kt2440为受体菌，通过二亲接合，将质粒pdca转移至菌株pseudomonas putida kt2440中，获得重组菌株pseudomonas putida kt2440(pdca)。
[0028]
1.3三氯卡班酰胺水解酶基因tcca2的克隆
[0029]
菌株lr2014-1(寄存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为：cctcc m 2015236)大量培养后，采用ctab法提取高纯度、大片段的基因组总dna，溶于tris-edta(ph 8.0)中，置于-20℃保藏用于后续的实验，具体方法参考f
·
奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。
[0030]
1.4酰胺酶基因tcca2以及上下游同源臂的pcr扩增
[0031]
使用如下引物：
[0032]
kn-1：gataagcttgtgatcggcggcgtctat(hind iii)
[0033]
kn-2：cccgttcctctcggtttatgaacaggcactgactaacgtg
[0034]
kn-3：cacgttagtcagtgcctgttcataaaccgagaggaacggg
[0035]
kn-4：tattttcaaccacgacaggaggggttggtcgaggctcacag
[0036]
kn-5：ctgtgagcctcgaccaacccctcctgtcgtggttgaaaata
[0037]
kn-6：caatctagagtcatagatagccgcgttca(xba i)
[0038]
其中，以提取的质粒pdca的dna为模板，使用引物kn-1/kn-2和kn-5/kn-6分别扩增上游同源臂和下游同源臂。以提取的菌株lr2014-1的基因组dna为模板，使用引物kn-3和kn-4扩增三氯卡班水解酶基因tcca2。
[0039]
扩增体系：
[0040][0041]
pcr扩增程序：
[0042]
a.98℃变性2min
[0043]
b.98℃变性15s，60℃退火15s，68℃延伸120s，进行30个循环
[0044]
c.68℃延伸10min，
[0045]
d.10℃5min,冷却到室温。
[0046]
1.5构建三氯卡班代谢质粒pdca-tcc
[0047]
使用引物kn-1和kn-6，以1.4中扩增的上游同源臂、下游同源臂和tcca2基因片段为模板，通过重叠延伸pcr将这三个片段连接起来，并通过酶切、酶连后克隆至自杀性质粒pk18mobsacb，获得重组自杀质粒pk18-tcca2。通过电转化将自杀质粒pk18-tcca2转移至菌株pseudomonas putida kt2440(pdca)中进行同源重组。经过双交换，最后在含有10％的蔗糖板上挑选阳性克隆子，菌落pcr验证阳性克隆子kt2440(pdca-tcc)(图1)。将挑到的阳性克隆子点接到含有0.6mm三氯卡班的lb平板上。在30℃培养3天后阳性克隆子周围观察到水解圈的产生，但不携带代谢质粒pdca-tcc的菌株kt2440周围没有水解圈产生(图2)，表明携带pdca-tcc的阳性克隆子可以水解三氯卡班。
[0048]
2、三氯卡班代谢质粒pdca-tcc的功能
[0049]
2.1种子液制备
[0050]
将菌株kt2440(pdca-tcc)接入含0.1mm三氯卡班的100ml lb培养基中，30℃、150rpm摇床培养，24小时后6000rpm离心收集菌体，使用无机盐培养基(mineral salt medium,msm)洗涤菌体两次，最后用10ml msm重悬，作为种子液备用。
[0051]
2.2菌株kt2440(pdca-tcc)对三氯卡班的降解
[0052]
水相中的三氯卡班用等体积的二氯甲烷萃取。在n2流下吹干有机相，并将残余物溶解在甲醇中用于hplc分析。检测条件：高效液相色谱仪为dionex ultimate 3000sd hplc系统，配备有c18反相色谱柱(4.6
×
250mm，5-μm粒径；dionex)。流动相由60％甲醇和40％水组成，在30℃下流速为1.0ml min-1
，进样量为20μl。三氯卡班的检测波长为275nm，4-氯苯胺和3,4-二氯苯胺的检测波长为250nm。
[0053]
将菌株kt2440(pdca-tcc)和kt2440(pdca)分别按5％的接种量接至含有50μm三氯卡班的100ml msm中，30℃、150rpm摇床培养，每隔6小时取样5ml，取至48小时。检测样品中三氯卡班的残留量，计算降解率，绘制菌株对三氯卡班的时间-降解曲线。如图3所示，菌株kt2440(pdca-tcc)能在36h内完全降解50μm的三氯卡班，且在降解过程中，产生的中间代谢产物4-氯苯胺和3,4-二氯苯胺在48h内被完全降解，而对照组kt2440(pdca)不能降解三氯
卡班。
[0054]
2.3温度对菌株kt2440(pdca-tcc)降解三氯卡班的影响
[0055]
在添加三氯卡班终浓度为50μm的msm培养基中，按5％接种量接入菌株kt2440(pdca-tcc)种子液，分别于4、16、30、37和42℃条件下，150rpm摇床培养，48小时后取样检测三氯卡班残留量，计算降解率，确定温度对菌株kt2440(pdca-tcc)降解三氯卡班的影响。结果表明kt2440(pdca-tcc)在30℃时对三氯卡班相对降解率最高,在30-37℃范围内，均能很好的降解三氯卡班，相对降解率均在90％以上；当温度低于16℃时，菌株kt2440(pdca-tcc)对三氯卡班的相对降解率下降至60％以下。
[0056]
2.4接种量对菌株kt2440(pdca-tcc)降解三氯卡班的影响
[0057]
按2％、5％、10％、15％与20％的接种量分别接入含50μm三氯卡班的msm培养基中，30℃、150rpm摇床培养，培养24小时后测定三氯卡班的含量。测定结果表明，10％、15％与20％接种量的培养基中,三氯卡班已完全被降解；2％和5％接种量的培养基中，三氯卡班的降解率分别为84％和93％。由此可见，接种量的多少对三氯卡班的降解效率有直接的关系，接种量越大，三氯卡班的降解效率越高。
[0058]
2.5菌株kt2440(pdca-tcc)的降解底物谱
[0059]
按5％的初始接种量分别在含有苯胺灵、氯苯胺灵、氯吡脲和除虫脲的msm培养液中接入菌株kt2440(pdca-tcc)，30℃、150rpm摇床培养；培养48小时后，在培养液中加入等体积的二氯甲烷，200rpm摇床振荡萃取1小时，静置30分钟，待水相和有机相分层，吸取有机相3ml并加入少量无水硫酸钠对有机相脱水；准确吸取1ml有机相于石英比色皿中，使用紫外分光光度计检测代谢产物。结果如图4所示，菌株kt2440(pdca-tcc)对苯胺灵、氯苯胺灵、氯吡脲和除虫脲都具有水解活性。
[0060]
3、pdca-tcc在污水中三氯卡班生物强化修复中的应用
[0061]
使用携带三氯卡班代谢质粒pdca-tcc的菌株kt2440(pdca-tcc)对从南京城东污水处理厂(wwtp)收集的废水进行生物强化处理。以携带野生型质粒pdca的菌株kt2440(pdca)作为对照。收集的废水在室温下自然沉降。去除上清液后，将污泥以10％(w/w)接种到含有90ml废水的250ml三角瓶中，并添加50μm三氯卡班。收获培养的菌株kt2440(pdca-tcc)和kt2440(pdca)的细胞，洗涤两次后接种到废水中，最终细胞密度约为2
×
107ml-1
。未接种两种菌株的处理用作非生物对照。所有处理一式三份进行。每种处理的培养物在25℃的振荡器上孵育。为了简单模拟废水处理过程中的曝气和沉降过程，将振动器设置为以160rpm的速度振动12小时，静置12小时，依次循环5天。每24小时取2ml混合液样品，12,000rpm离心5分钟收集上清液，加入2ml二氯甲烷，剧烈震荡5分钟，静置10分钟，待水相和有机相分层，吸取有机相并加入少量无水硫酸钠对有机相脱水，准确吸取800μl有机相于1.5ml离心管中，用氮吹仪吹干，加入400μl甲醇，在超声波清洗器中超声10分钟，用0.22μm的有机相滤器过滤杂质后至hplc检测。结果如图5所示，在接种菌株kt2440(pdca-tcc)生物强化组中，添加50μm三氯卡班在3天内被完全降解，中间代谢产物3,4-二氯苯胺和4-氯苯胺通过hplc检测到积累。5天后，累积的3,4-dca和4-ca降解到检测不到的水平。而接种菌株kt2440(pdca)以及未接种的对照组中的三氯卡班浓度也略有下降，但没有观察到中间体的积累，表明三氯卡班未被降解，三氯卡班的少量减少可能是被污水中的沉积物吸附。本研究结果表明，接种携带三氯卡班代谢质粒pdca-tcc的宿主菌株pseudomonas putida kt2440
可以有效地去除废水中的三氯卡班残留。