技术特征：
1.一种暗纹东方鲀肠上皮细胞分离培养及应激模型建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、将暗纹东方鲀幼鱼在盐水中养殖7-10d，期间投喂含新霉素和氨苄青霉素饲料，幼鱼取样前禁食；步骤2、幼鱼取样麻醉后无菌解剖摘取中段肠道，置于自配的清洗液中，去除肠系膜，纵向剪开肠道，刮去内容物，用自配的清洗液清洗2-3遍，放入无菌离心管中剪成体积为0.5～0.8mm3肠组织块；步骤3、向肠组织块中加入0.5～1ml胶原酶ⅳ消化液，金属浴消化，每隔5～10min取出吹打一次，加入提前配好28℃预温过的完全培养基终止消化，100目筛网过滤后于1000rpm，低温离心后向沉淀中加适量完全培养基，用移液枪反复轻轻吹打混匀，补足完全培养基后进行培养；步骤4、培养后吸除培养基，添加含皮质醇的完全培养基刺激肠上皮细胞24h建立氧化应激模型。2.根据权利要求1所述的暗纹东方鲀肠上皮细胞分离培养及应激模型建立的方法，其特征在于，步骤1中，所述暗纹东方鲀幼鱼，体长为5
±
0.5cm。3.根据权利要求1所述的暗纹东方鲀肠上皮细胞分离培养及应激模型建立的方法，其特征在于，步骤1中，期间投喂的饲料中含新霉素和氨苄青霉素浓度为10～20u/kg和15～20u/kg，两者比例关系为2～4：3～4。4.根据权利要求1所述的暗纹东方鲀肠上皮细胞分离培养及应激模型建立的方法，其特征在于，步骤1中，所述盐水浓度为8-10ppt，禁食时间为24-28h。5.根据权利要求1所述的暗纹东方鲀肠上皮细胞分离培养及应激模型建立的方法，其特征在于，步骤2中，采用弯头镊子刮去内容物，无菌离心管的容量为1.5ml，所述pbs含1～2％青霉素链霉素，自配清洗液的配方如下：2％青霉素链霉素，自配清洗液的配方如下：上述清洗液经微孔滤膜过滤除菌，即得。6.根据权利要求1所述的暗纹东方鲀肠上皮细胞分离培养及应激模型建立的方法，其特征在于，步骤3中，所述胶原酶ⅳ消化液质量浓度为0.25～0.3％；消化条件为28℃金属浴消化25～30min；完全培养基成分为dmem+胎牛血清+暗纹东方鲀血清，三者比例关系为15～16：2～4：1～2，每100ml培养液中加入400-500μl双抗溶液，双抗溶液包括青霉素100units/
ml、链霉素100μg/ml。7.根据权利要求1所述的暗纹东方鲀肠上皮细胞分离培养及应激模型建立的方法，其特征在于，步骤3中，所述低温离心为4℃离心5-6min。8.根据权利要求1所述的暗纹东方鲀肠上皮细胞分离培养及应激模型建立的方法，其特征在于，步骤3中，所述培养为28-30℃、4-6％co2，进行培养72h。9.根据权利要求1所述的暗纹东方鲀肠上皮细胞分离培养及应激模型建立的方法，其特征在于，步骤4中所述皮质醇浓度为80～120nmol/l，且此时的肠上皮细胞密度为1*107以上、存活率为90％以上。
技术总结
本发明公开了一种暗纹东方鲀肠上皮细胞分离培养及应激模型建立的方法。本发明的技术方案中，首先在暗纹东方鲀养殖过程中投喂经抗生素处理过的饲料；其次选取暗纹东方鲀肠道中肠部位；然后通过优化暗纹东方鲀肠上皮细胞高效分离培养技术和细胞原代培养条件，得到了纯度较高、生长良好的暗纹东方鲀肠上皮细胞；最后利用皮质醇刺激暗纹东方鲀肠上皮细胞以建立氧化应激模型。本发明为暗纹东方鲀应用于发育生物学、免疫学、毒理与环境检测等方面的研究提供有力的研究材料。究提供有力的研究材料。究提供有力的研究材料。
技术研发人员：王涛 马思思 尹绍武 孙亦如 张莹 刘雨曦
受保护的技术使用者：南京师范大学
技术研发日：2022.04.21
技术公布日：2022/7/29