水稻wx基因的检测引物、检测试剂盒及其应用

1.本发明涉及水稻wx基因的检测引物以及检测试剂盒，本发明进一步涉及所述水稻wx基因检测引物在水稻wx基因的辅助选育、wx基因纯合体和杂合体的快速判断或糯稻品种纯度的鉴定等方面的应用，属于水稻wx基因的分子标记及检测引物和应用领域。


背景技术：

2.水稻是中国重要的粮食作物之一，全国水稻种植面积约占粮食作物面积的30％，产量接近粮食总产量的一半。糯米因其具有良好的食用品质，广泛应用于保健滋补食用、酿酒、制作糕点、冷饮和医药等方面，深受人民群众喜爱。
3.由于糯性属隐性性状，生产中混杂、串粉等因素极易造成糯性丧失或退化，对种性保持来说往往更是致命的。为了保证常规品种专有的特异性、一致性和稳定性，需要对品种进行提纯复壮，以保持品种的优良种性。通常的方法是株系循环法和“三年三圃”法，这两种方法的核心是选择“典型单株”或“典型单穗”，是基于经验的表型选择，存在一定的盲目性。在糯稻选育过程中，分离世代由于糯性多处于杂合状态，直链淀粉含量无法准确反应糯性性状是否纯合，需要株系稳定后，才能进行准确分析，极大增加了选育的工作量。
4.水稻中淀粉的合成受蜡质基因(wx)编码结合在淀粉粒上的淀粉合成酶(granuale bound starch synthase i，gbss i)控制。wx基因的等位变异造成了不同水稻品种中直链淀粉含量的差异。糯稻品种中直链淀粉含量一般低于2％，属于wx基因的隐性突变(wx)。前人研究表明，目前报导的糯稻是由于wx基因第二外显子区存在一处23bp的插入，导致wx基因表达出现移码突变。孙华钦、田志喜等学者曾针对这一位点差异设计功能性分子标记对糯/非糯品种进行区分。但同时孙华钦等指出，由于wx基因功能区域碱基序列具有较高的gc含量，pcr反应时应选择适用于gc rich结构扩增的gc buffer和高保真酶(la taq)，且需设置较高的退火温度，检测成本较高。田志喜等针对wx基因功能区域设计的标记wx m1在pcr反应时选择了58℃的退火温度，电泳检测时出现较多杂带，结果判定难度大。
5.因此，针对针对水稻wx基因功能区域设计特异性强，灵敏度高，检测成本低的检测引物是亟待需要解决的技术问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一是提供水稻wx基因检测引物；
7.本发明的目的之二是提供含有所述水稻wx基因检测引物的检测试剂盒。
8.本发明的目的之三是将所述的水稻wx基因检测引物应用于水稻wx基因的辅助选育、wx基因纯合体和杂合体的快速判断或糯稻品种纯度的鉴定等方面。
9.本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
10.本发明首先提供了水稻wx基因检测引物，选自引物对(1)或引物对(2)中的任何一对，其中，所述引物对(1)由核苷酸序列为seq id no.1所示的引物和核苷酸序列为seq id no.2所示的引物组成；所述引物对(2)由核苷酸序列为seq id no.3所示的引物和核苷酸序
列为seq id no.4所示的引物组成。
11.本发明进一步提供了一种水稻wx基因pcr检测试剂盒，包括：taq酶、dntp、mg
2+
、去离子水和检测引物；其中，所述检测引物是以水稻wx基因功能区域为靶标设计得到的检测引物；作为一种优选的具体实施方案，所述的检测引物选自引物对(1)或引物对(2)中的任何一对，所述引物对(1)由核苷酸序列为seq id no.1所示的引物和核苷酸序列为seq id no.2所示的引物组成；所述引物对(2)由核苷酸序列为seq idno.3所示的引物和核苷酸序列为seq id no.4所示的引物组成。
12.本发明还包括将所述水稻wx基因检测引物应用于水稻wx基因的辅助选育、wx基因纯合体和杂合体的快速判断或糯稻品种纯度的鉴定等方面。
13.本发明提供了一种应用所述水稻wx基因检测引物判定水稻样品中是否存在wx基因或者wx基因的纯合体和杂合体的方法，包括：
14.(1)提取待检测水稻样品的dna；
15.(2)以提取的dna为模板，以引物对(1)或引物对(2)为pcr扩增引物建立pcr扩增体系进行pcr扩增；
16.(3)利用引物(1)扩增，如果扩增结果只有140bp条带，则待检测的水稻样品为含有wx基因纯合体；如果扩增结果只有117bp条带，则待检测的水稻样品不含有wx基因；如果扩增结果同时含有140bp和117bp两条条带，则待检测的水稻样品为含有wx基因的杂合株；
17.利用引物对(2)扩增，如果扩增结果只有199bp条带，则待检测的水稻样品为含有wx基因纯合体；如果扩增结果只有176bp条带，则待检测的水稻样品不含有wx基因；如果扩增结果同时含有199bp和176bp两条带，则待检测的水稻样品为含有wx基因的杂合株。
18.为了将wx基因转入具有优异的性状水稻材料，本发明还提供了一种应用所述水稻wx基因检测引物进行水稻wx基因辅助选育的方法，包括：
19.用优良水稻品系与含有wx基因的糯稻材料杂交并回交，利用引物对(1)(wx-1)或引物对(2)(wx-2)扩增各杂交(回交)世代单株wx基因位点，并对扩增的pcr产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；(2)利用引物(1)扩增，如果扩增结果含有140bp条带，则可判断样品中存在wx基因，利用引物(2)扩增，如果扩增结果含有199bp条带，则可判断样品中存在wx基因；从而辅助选育含有糯性基因(wx)且农艺性状优良的单株。
20.本发明还提供了一种应用所述水稻wx基因检测引物快速判断自交分离群体单株的wx基因纯合体的方法，包括：
21.(1)提取待检测的自交分离群体单株的dna；(2)以提取的dna为模板，以引物对(1)或引物对(2)为pcr扩增引物建立pcr扩增体系进行pcr扩增；(3)利用引物对(1)扩增，如果扩增结果只有140bp条带，则检测样品单株为携带wx基因纯合单株，如果扩增结果同时含有140bp和117bp两条条带，则检测样品单株为携带wx基因的杂合株；利用引物对(2)wx-2扩增，如果扩增结果只有199bp条带，则检测样品单株为携带wx基因纯合单株，如果扩增结果同时含有199bp和176bp两条带，则检测样品单株为携带wx基因的杂合株。
22.本发明还提供了一种应用所述水稻wx基因检测引物对糯稻品种进行纯度鉴定的方法，包括：
23.(1)提取待检测的糯稻品种的dna；
24.(2)以提取的dna为模板，以引物对(1)或引物对(2)为pcr扩增引物建立pcr扩增体
系进行pcr扩增；
25.(3)利用引物对(1)扩增，如果电泳结果只有140bp条带的为携带纯合wx基因的糯稻单株，同时含有140bp和117bp两条条带的为携带杂合wx基因的糯稻单株，只含有117bp条带的为非糯稻单株混杂；
26.利用引物对(2)扩增，如果电泳结果只有199bp条带的为携带纯合wx基因的糯稻单株，含有199bp和176bp两条条带的单株为携带杂合wx基因的糯稻单株，只含有176bp条带的为非糯稻单株混杂；
27.(4)按以下公式计算水稻样品纯度：
[0028][0029]
式中：
[0030]
p—样品纯度；
[0031]nt
—为供检种子粒数(幼苗数、株数)；
[0032]
nd—为判定为混杂株的种子粒数(幼苗数、株数)。
[0033]
作为本发明一种优选的具体实施方案，所述pcr扩增的反应体系包括：taq酶0.2μl、dntp 2μl，mg
2+
2μl、dna模板14μl、上游引物1μl、下游引物1μl，去离子水5.8μl，5
×
buffer 4μl。
[0034]
作为本发明一种优选的具体实施方案，所述pcr扩增的扩增程序：95℃预变性5min后，94℃1min，67℃30s，72℃40s，循环35次，72℃延伸10min，12℃保存。
[0035]
本发明针对wx基因功能区域，通过sanger双脱氧测序技术，找出糯稻和非糯稻wx基因的序列差异，并开发wx基因专一性功能标记wx-1、wx-2，利用pcr技术对该标记位点进行扩增，通过电泳检测pcr产物的片段数量和大小，判断被检水稻样品是否含有wx基因以及含有的wx基因为杂合或纯合等位型，进而实现对wx基因的辅助选育、wx基因纯合体和杂合体的快速判断以及糯稻品种纯度的鉴定。
[0036]
本发明对糯稻/非糯稻品种wx基因第二外显子上的序列差异开发糯性等位型特异性分子标记，并通过反应体系和反应程序的优化，实现对糯稻和非糯稻进行基因型的准确区分，显著降低了检测成本，对于糯稻新品种的培育，核心种质的提纯复壮以及生产用种的纯度鉴定提供了技术支持。
[0037]
本发明涉及关键术语定义和缩略语
[0038]
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
[0039]
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括pna(肽核酸)、在反义技术中所用的dna类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或
所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(batzer等人,nucleic acid res.19:5081(1991)；ohtsuka等人,j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；和cassol等人,(1992)；rossolini等人,mol cell.probes 8:91-98(1994))。
[0040]
基因分子标记：基于某个基因的序列差异开发出的与某个性状紧密相连的一种有效的基因标记。
附图说明
[0041]
图1wx基因第二外显子区碱基序列。
[0042]
图2糯稻基因分子辅助选育流程。
[0043]
图3标记wx-1电泳图谱；m：20bp dna标准分子量。1-8为糯稻品种，分别为：皖垦糯1号、皖垦糯2号、皖垦糯5号、皖垦糯1116、镇糯19、宣粳糯1号、光明糯1号、皖稻68；9-23为非糯品种，分别为：皖垦粳2号、皖垦粳3号、皖垦粳8号、皖垦粳516、皖垦粳11036、皖垦津清、镇稻14、镇稻15、镇稻18、当育粳2号、当育粳10号、长农垦1号、晚粳22、天粳2号和宁粳3号。
[0044]
图4标记wx-2电泳图谱；m：20bp dna标准分子量。1-8为糯稻品种，分别为：皖垦糯1号、皖垦糯2号、皖垦糯5号、皖垦糯1116、镇糯19、宣粳糯1号、光明糯1号、皖稻68；9-23为非糯品种，分别为：皖垦粳2号、皖垦粳3号、皖垦粳8号、皖垦粳516、皖垦粳11036、皖垦津清、镇稻14、镇稻15、镇稻18、当育粳2号、当育粳10号、长农垦1号、晚粳22、天粳2号和宁粳3号。
[0045]
图5标记wx-1、wx-2对wx基因自交后代的辅助选育；m：20bp dna标准分子量；1-21：检测单株；1，wx基因供体(宣粳糯7号)；2，武育粳3号；9、18、21：wx基因纯合体；5、6、12、13、15、20：wx基因杂合体；其余为不含wx基因单株。
[0046]
图6利用标记wx-1、wx-2分别对两个糯稻品种进行纯度检测；
[0047]
▲
：wx基因杂合株
ꢀ★
：不含wx基因杂株。
具体实施方式
[0048]
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0049]
实施例1水稻wx基因功能区域序列比较以及wx基因检测引物设计与验证
[0050]
1.ctab法提取水稻基因组dna
[0051]
材料包括皖垦糯1号、镇糯19等8个糯稻品种和皖垦粳2号、晚粳22等15个非糯稻品种。每个品种剪取供试材料幼嫩叶片约0.1g，移入2.0ml离心管中，向离心管中加入2颗研磨珠，液氮冷冻后用组织研磨仪充分研磨至粉末状，再加入800μl 65℃预热的ctab提取缓冲液(81.7gnacl和20g ctab充分溶于适量水中，然后加入1mol/l tris-hcl 100ml，0.5mol/l edta 40ml，定容至1000ml，4℃贮存。)，65℃孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次；加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，轻缓混匀，室温静置10min；12,000rpm离心10min，吸取上清移至另一支1.5ml离心管中，再加入等体积异丙醇混匀，置于-20℃30min，4℃、12,000rpm离心10min，弃上清，加入500μl 75％乙醇洗涤沉淀；12,000rpm离心10min后弃去乙醇，室温干燥后加入50μl灭菌水，充分溶解。提取的基因组dna通过implen nanophotometer超微量紫外分光光
度计测定各样品浓度，检测od
260
/od
280
比值，合格后用无菌水将浓度统一稀释成50ng/μl并储于-20℃低温下备用。
[0052]
2.wx基因功能区域序列测定
[0053]
2.1 wx基因功能区域dna测序引物序列
[0054]
表1 wx基因测序引物信息
[0055][0056]
2.2 pcr扩增
[0057]
利用测序引物对水稻基因组dna进行扩增，扩增体系中各组分配制见表2。
[0058]
表2 pcr反应体系
[0059][0060]
注：反应体积可选择在10-50μl之间，模板dna原浓度在20-200ng/μl之间均可。
[0061]
pcr反应程序为：95℃预变性5min后，94℃1min，55/58℃30s，72℃40s，循环35次，72℃延伸10min，12℃保存。pcr扩增产物采用1.5％琼脂糖电泳进行检测。
[0062]
3.wx基因功能区域序列比较
[0063]
利用dnastar软件中seqman完成测序结果中多个片段的组装，使用clustal omega
软件进行多序列比对，找出wx基因专一性的差异位点。
[0064]
4.wx基因检测引物设计与验证
[0065]
4.1wx基因检测引物设计
[0066]
根据wx基因功能区域的特有差异，利用primer premier 5软件设计pcr检测引物wx-1和wx-2，在ncbi-blast上对选择的引物序列进行比对，检验其特异性。
[0067]
表3 糯性基因wx功能标记信息
[0068][0069][0070]
4.2wx基因检测验证
[0071]
利用wx-1和wx-2引物分别对糯稻和非糯稻品种进行扩增，pcr反应体系参照表2。
[0072]
反应程序为：95℃预变性5min后，94℃1min，67℃30s，72℃40s，循环35次，72℃延伸10min，12℃保存。产物经10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，不仅可以准确判断wx基因的存在与否，还可以判断wx基因的纯合体和杂合体。
[0073]
利用引物wx-1扩增，结果只有140bp条带的为含有wx基因纯合体，只有117bp条带的不含有wx基因，含有140bp和117bp两条条带的单株为含有wx基因的杂合株。
[0074]
利用引物wx-2扩增，结果只有199bp条带的为含有wx基因纯合体，只有176bp条带的不含有wx基因，含有199bp和176bp两条带的单株为含有wx基因的杂合株。
[0075]
4.wx基因辅助选育
[0076]
为了将wx基因转入具有优异的性状水稻材料，用优良水稻品系与含有wx基因的糯稻材料杂交并回交，利用引物wx-1或wx-2扩增各杂交(回交)世代单株wx基因位点，并对扩增的pcr产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，判断wx基因的存在与否，从而辅助选育含有糯性基因(wx)且农艺性状优良的单株。
[0077]
5.wx基因纯合体的快速判断
[0078]
根据标记wx-1和wx-2对自交分离群体单株的扩增产物酶切条带的差异，判别受检单株是否含有wx基因，以及wx基因是否为纯合类型。
[0079]
利用引物wx-1扩增，结果只有140bp条带的为携带wx基因纯合单株，含有140bp和117bp两条条带的单株为携带wx基因的杂合株。利用引物wx-2扩增，结果只有199bp条带的为携带wx基因纯合单株，含有199bp和176bp两条带的单株为携带wx基因的杂合株。
[0080]
因此，当对自交分离群体进行鉴定时：凡利用标记wx-1扩增，电泳结果显示只有140bp条带的单株；利用标记wx-2扩增，电泳结果显示只有199bp条带的单株，均为携有纯合wx基因的单株。
[0081]
试验例1采用wx基因检测引物进行wx基因辅助选育应用试验
[0082]
1、ctab法提取8份糯稻材料、15份非糯稻材料基因组dna：
[0083]
1)23个品种各取100粒左右种子，28℃-32℃光照培养箱中发苗约1周；
[0084]
2)剪取单株幼苗置于2.0ml离心管中，加入2颗研磨珠，液氮冷冻后用组织研磨仪研磨至粉末状，每份材料处理5个单株；
[0085]
3)向离心管中加入800μl 65℃预热的ctab提取缓冲液(81.7g nacl和20g ctab充分溶于适量水中，然后加入1mol/l tris-hcl 100ml，0.5mol/l edta 40ml，定容至1000ml，4℃贮存。)；
[0086]
4)65℃水浴1h，每隔15min颠倒混匀若干次；
[0087]
5)加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，轻缓混匀，室温静置10min；
[0088]
6)12,000rpm离心10min，吸取上清移至另一支1.5ml离心管中，
[0089]
7)加入等体积异丙醇，混匀后置于-20℃冷冻30min。
[0090]
8)4℃、12,000rpm离心10min，弃上清。
[0091]
9)加入500μl 75％乙醇洗涤沉淀；12,000rpm离心10min后弃去乙醇；
[0092]
10)重复步骤9
[0093]
11)室温干燥后加入50μl灭菌水，充分溶解后备用。
[0094]
2、wx基因功能区域差异序列扩增及检测
[0095]
1)wx基因功能区域的扩增引物
[0096]
针对wx基因功能区域的扩增引物如下：
[0097]
wx-1f:5’cgtcgtcgctgctccgc 3’[0098]
wx-1r:5’accgctgctgcttgggc 3’[0099]
wx-2f:5’cgtcccagctcgccacct 3’[0100]
wx-2r:5’caccgaccgctgctgctt 3’[0101]
2)pcr扩增与电泳检测
[0102]
在0.2ml薄壁管中依次加入，反应体系如下：
[0103]
表4 pcr反应体系
[0104][0105]
扩增程序：95℃预变性5min后，94℃1min，67℃30s，72℃40s，循环35次，72℃延伸10min，12℃保存。
[0106]
3、利用标记wx-1、wx-2对wx基因辅助选育
[0107]
1)含wx基因材料的选育流程(图2)。
[0108]
2)水稻基因组dna提取
[0109]
所用水稻材料：宣粳糯7号和武育粳3号杂交选育的bc2f4单株。剪取成株期水稻幼嫩叶片约0.1g，ctab法提取基因组dna；
[0110]
3)水稻基因组dna的pcr扩增电泳检测
[0111]
利用引物wx-1和wx-2对宣粳糯7号、武育粳3号及bc2f4群体单株基因组dna进行扩增，pcr产物用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。
[0112]
4)含wx基因后代选择
[0113]
wx基因纯合单株，标记wx-1扩增只含有140bp的条带，标记wx-2扩增只含有199bp的条带；wx基因杂合单株，wx-1扩增含有140bp和117bp两条带，wx-2扩增含有199bp和176bp两条带。在回交后代中，选择wx基因杂合型单株，在自交后代中，选择wx基因纯合型单株(图5)。
[0114]
试验例2采用wx基因检测引物对糯稻和非糯水稻杂交种纯度鉴定试验
[0115]
根据标记wx-1、wx-2在糯稻与非糯稻品种间扩增产物电泳条带差异，可对糯稻品种进行纯度鉴定。
[0116]
利用引物wx-1扩增，电泳结果只有140bp条带的为携带纯合wx基因的糯稻单株，含有140bp和117bp两条条带的为携带杂合wx基因的糯稻单株，只含有117bp条带的为非糯稻单株混杂。利用引物wx-2扩增，电泳结果只有199bp条带的为携带纯合wx基因的糯稻单株，含有199bp和176bp两条条带的单株为携带杂合wx基因的糯稻单株，只含有176bp条带的为非糯稻单株混杂(图6)。
[0117]
水稻样品纯度检验结果按以下公式计算：
[0118][0119]
式中：
[0120]
p—样品纯度；
[0121]nt
—为供检种子粒数(幼苗数、株数)；
[0122]
nd—为判定为混杂株的种子粒数(幼苗数、株数)。