一种顺反子元件库的构建及其在棒杆菌中的应用

本申请属于生物，具体涉及构建一种适用于棒杆菌的表达调控元件及应用。

背景技术：

1、棒杆菌是一类革兰氏阳性菌，菌体呈棒状，好氧或兼性厌氧，可以进行氧化性或发酵性代谢。谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)是一种重要的棒杆菌，其无内毒素、抗逆性强、具有兼性厌氧的特征，可用于高密度培养生产氨基酸，具有完善的蛋白分泌系统，目前已作为合成生物学的宿主细胞来生产高附加值化合物以及重组药用蛋白，广泛用于工业生产高级醇、氨基酸、有机酸、有机胺及酯类等工业产品，还被应用于食品工业，动物饲料的生产。

2、除作为氨基酸的生产菌之外，谷氨酸棒杆菌还是一种内外源蛋白的表达宿主，作为宿主菌，谷氨酸棒杆菌具有一些相对于大肠杆菌的优势，如无内毒素，较为安全，只有一层细胞膜，分泌的蛋白可以直接分泌胞外，不易形成包涵体，自身分泌到胞外的蛋白较少，易于产物的纯化，较少检测到胞外蛋白酶，有利于蛋白的稳定。因此，谷氨酸棒杆菌是一种很有潜力的蛋白表达宿主。

3、蛋白的表达受到转录水平的影响以外，还受翻译起始效率的影响，而翻译起始效率取决于核糖体与mrna的结合效率及结合强弱。因此，提高翻译起始效率对于目的基因的表达强度非常的重要。

4、启动子是一段dna序列，位于结构基因5’端(转录起始位点)上游，能识别并活化rna聚合酶并使之与模板dna结合进行转录的起始。启动子就像“开关”，决定基因的活动，它的结构直接关系到转录的效率，影响到基因的表达水平。rbs序列是一段位于启动子之后，起始密码子之前的一段较短的基因片段(非翻译区)，提供了核糖体与mrna的结合位点，可以通过碱基配对识别16srrna，介导mrna的翻译起始和肽链的合成。

技术实现思路

1、为了提高翻译起始效率和基因表达的强度，本申请提供了一种适用于谷氨酸棒杆菌的表达调控元件，其能增强核糖体与mrna的结合效率及结合力，提高翻译起始效率，从而解决现有谷氨酸棒杆菌作为蛋白表达宿主时，蛋白表达量低的问题。

2、第一方面，本申请提供了一种含顺反子的目的基因表达盒，表达盒的结构为：启动子-核糖体结合位点rbs-顺反子-核糖体结合位点rbs-编码目的蛋白的核苷酸序列-终止子。启动子的核苷酸序列如seq id no1所示，顺反子的核苷酸序列如seq id no2-38所示，rbs的序列为cgccacggggagacccatataaaaggaggttactaa。

3、第二方面，本申请提供了一种包含表达盒的表达载体及其在棒杆菌中表达蛋白中的应用，可选地，棒杆菌为谷氨酸棒杆菌。

4、第三方面，本申请提供了一种高表达强度的顺反子突变体与rbs组合的构建方法，步骤如下：

5、先构建顺反子元件载体，筛选得到高表达强度的顺反子元件；

6、再构建所述高表达强度顺反子元件的突变文库，筛选得到高表达强度的顺反子突变体；将所述顺反子突变体与不同强度的rbs序列组合，构建顺反子-rbs库，筛选得到高表达强度的rbs-顺反子突变体组合。

7、进一步地，一种高表达强度的顺反子突变体-rbs组合的构建方法，包括以下步骤，从谷氨酸棒杆菌中挑选表达量高和低的蛋白序列作为顺反子元件分别插入到启动子和指示基因(绿色荧光蛋白)之间构建质粒；将所述质粒分别转化至所述谷氨酸棒杆菌中，通过指示基因的表达强度筛选出阳性转化子；将所述阳性转化子同一条件接种于培养基中培养，筛选得到表达强度高的顺反子元件；将所述表达强度高的顺反子元件进行分区域随机突变，建立顺反子元件突变文库，筛选出表达强度高的突变株；用不同强度的rbs序列替换所述突变株的顺反子中的rbs序列，构建顺反子-rbs库，筛选出表达强度高的顺反子-rbs组合突变体。其中rbs与目的基因有1bp碱基a的错位融合。

8、第四方面，本申请还提供了利用构建的表达盒生产l-脯氨酸的方法，包括以下步骤：先pcr扩增谷氨酸棒杆菌的脯氨酸序列连接到表达质粒中，转入感受态细胞内，筛选得到阳性转化子；再扩增表达强度高的顺反子-rbs组合的dna片段；将dna片段连接到表达质粒中，位于脯氨酸基因序列之前；转化细菌筛选得到阳性转化子。将阳性转化子接种于培养基中培养，得到种子液；将种子液接种到培养基中发酵培养。

9、第五方面，本申请还提供了利用构建的表达盒生产γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：先pcr扩增大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶gadm基因连接到表达质粒中，转入感受态细胞内，筛选得到阳性转化子；再扩增表达强度高的顺反子-rbs组合的dna片段；将所述dna片段连接到含有gadm基因的表达质粒中，位于γ-氨基丁酸基因序列之前；转化细菌筛选得到阳性转化子。将所述阳性转化子接种于培养基中培养，得到种子液；将种子液接种到培养基中发酵培养。最后，提供一种包括所构建的表达盒的细菌。

技术特征：

1.一种增强目的蛋白表达水平的双顺反子表达盒，所述表达盒的结构为：启动子-核糖体结合位点rbs-顺反子-核糖体结合位点rbs-编码目的蛋白的核苷酸序列-终止子；

2.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述rbs的序列为cgccacggggagacccatataaaaggaggttactaa。

3.一种包含如权利要求1或2所述表达盒的表达载体。

4.如权利要求2所述的表达载体在表达蛋白中的应用，其特征在于，宿主菌为棒杆菌，优选为谷氨酸棒杆菌。

5.一种高表达强度的顺反子突变体与rbs组合的构建方法，其特征在于，先构建顺反子元件载体，筛选得到高表达强度的顺反子元件；

6.一种高表达强度的顺反子突变体-rbs组合的构建方法，其特征在于，从谷氨酸棒杆菌中挑选表达量高和低的蛋白序列作为顺反子元件分别插入到启动子和目的基因之间构建质粒；将所述质粒分别转化至所述谷氨酸棒杆菌中，通过指示基因的表达强度筛选出阳性转化子；将所述阳性转化子同一条件接种于培养基中培养，筛选得到表达强度高的顺反子元件；将所述表达强度高的顺反子元件进行分区域随机突变，建立顺反子元件突变文库，筛选出表达强度高的突变株；用不同强度的rbs序列替换所述突变株的顺反子中的rbs序列，构建顺反子-rbs库，筛选出表达强度高的顺反子-rbs组合突变体。

7.如权利要求5或6所述的构建方法，其特征在于，所述指示基因是绿色荧光蛋白基因及所述rbs与指示基因有1bp碱基a的错位融合。

8.一种利用权利要求1或2所述表达盒生产l-脯氨酸的方法，其特征在于，包括：先pcr扩增谷氨酸棒杆菌的脯氨酸序列连接到表达质粒中，转入感受态细胞内，筛选得到阳性转化子；再扩增表达强度高的顺反子-rbs组合的dna片段；将所述dna片段连接到含有脯氨酸基因的表达质粒中，转化细菌筛选得到阳性转化子；将所述阳性转化子接种于培养基中培养，得到种子液；将所述种子液接种到发酵培养基中发酵培养。

9.一种利用权利要求1所述表达盒生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括，其特征在于，先pcr扩增大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶gadm基因连接到表达质粒中，转入感受态细胞内，筛选得到阳性转化子；再扩增包含表达强度高的顺反子-rbs组合的dna片段；将所述dna片段连接到含有gadm基因的表达质粒中，转化细菌筛选得到阳性转化子；将所述阳性转化子接种于培养基中培养，得到种子液；将所述种子液接种到发酵培养基中发酵培养。

10.一种包含1或2所述表达盒的细菌。

技术总结
本申请属于生物技术领域，具体涉及一种适用于棒杆菌表达调控元件的构建及应用。首先提供了一种增强目的蛋白表达水平的双顺反子表达盒，所述表达盒的结构为：启动子‑核糖体结合位点RBS‑顺反子‑核糖体结合位点RBS‑编码目的蛋白的核苷酸序列‑终止子；所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示以及所述顺反子的核苷酸序列如SEQ ID NO2‑14所示。本申请还提供了高表达强度的顺反子突变体与RBS组合的构建方法以及使用表达盒构建生产L‑脯氨酸和γ‑氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌。获得的菌株L‑脯氨酸和γ‑氨基丁酸产量分别达到26.62g/L和7.21g/L。

技术研发人员：张芸,温廷益,李丹丹,唐源,王雪亮,邓爱华,刘树文
受保护的技术使用者：中国科学院微生物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16