一种适用于咽拭子、唾液、血清、血浆中病原体核酸提取的裂解结合液、试剂盒及提取方法与流程

1.本发明涉及医疗领域，特别是一种适用于咽拭子、唾液、血清、血浆中病原体核酸提取的裂解结合液、试剂盒及提取方法。


背景技术：

2.随着分子生物学技术的发展与革新，基于核酸信息的分子诊断技术日益成为人类日常生活中诊断疾病的重要手段，因而，对分子诊断必须步骤——核酸提取的要求也不断提高。
3.传统的核酸提取技术因其步骤繁琐、耗时长、难以自动化操作、且其中含有苯酚等有毒物质直接侵害操作人员的健康等弊端而逐渐被离心柱法、磁珠法等以固相吸附物载体为基础的新方法所取代。
4.离心柱法因其核酸提取效率低、成本高，且需要高速离心机，也难于实现自动化，亦不能广泛适用于大规模的临床检测。磁珠法是以磁性复合微球为载体特异性吸附核酸，洗涤液洗去非特异性吸附的蛋白质等杂质，最后用洗脱液并在磁场条件下从磁珠上洗脱并富集核酸，因其结果重复性好、稳定性高、操作简单、适用于自动化操作等优点而成为一种非常有前景的提取方法。但因为其提取效率不佳，纯度较低，提取时间长且含有高浓度胍盐等问题，磁珠法核酸提取的应用受到一定的限制。因此，为了解决上述问题，本发明提出一种新的核酸快速提取裂解液。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决上述问题，设计了一种适用于咽拭子、唾液、血清、血浆中病原体核酸提取的裂解结合液、试剂盒及提取方法。
6.实现上述目的本发明的技术方案为，一种适用于咽拭子、唾液、血清、血浆中病原体核酸提取的裂解结合液、试剂盒及提取方法，本发明旨在基于磁珠法核酸提取的基础上，提供一种能够快速地对生物样本中病原体核酸进行提取，且不含盐酸胍、硫氰酸胍等胍盐剧毒物质的裂解结合液。具体由以下试剂组成：10-100mm缓冲液、20-500mm乙二胺四乙酸、0.5-5m无机盐、0.5-5m尿素、0.1%-1%表面活性剂、10%-40%醇。
7.优选地，所述裂解结合液的无机盐离子选自nacl、nai、kcl、naac或柠檬酸钠的一种或多种。
8.优选地，所述裂解结合液的缓冲液选自tris-hcl、hepes或naac-hac的一种。
9.优选地，所述裂解结合液的表面活性剂选自tritonx-100、tween20、tween80、sds、np-40中的一种或多种。
10.优选地，所述裂解结合液的醇选自乙醇、异丙醇、异戊醇或十一醇的一种。
11.进一步地，所述裂解结合液还包括含量为10-50mg/ml、粒径300-800nm的羧基磁性纳米微球。
12.进一步地，所述裂解结合液的ph值范围在6-6.5之间。
13.进一步地，所述裂解结合液由灭菌的depc-h2o配置。
14.本试剂盒对生物样本中病原体核酸提取步骤如下：step1：将上述裂解结合液、待测样本、蛋白酶k和磁珠依次加入离心管中，涡旋振荡混匀1min后，置于磁力架上吸附磁珠，弃去上清液。
15.step2：将洗涤液ⅰ加入上述离心管中，涡旋振荡混匀后立即置于磁力架上吸附磁珠，弃去上清液。
16.step3：将洗涤液ⅱ加入上述离心管中，涡旋振荡混匀后立即置于磁力架上吸附磁珠，弃去上清液。
17.step4：将洗脱液加入上述离心管中，涡旋振荡混匀后置于金属浴中加热洗脱核酸。
18.step5：将上述离心管置于磁力架吸附磁珠，转移上清液至新的离心管中以待备用。
19.利用本发明的技术方案制作的一种适用于咽拭子、唾液、血清、血浆中病原体核酸提取的裂解结合液、试剂盒及提取方法，（1）提取效率高：本发明裂解结合液对样本进行边裂解、边吸附，减少了操作步骤，提高了样本核酸提取效率。（2）毒性小：本发明裂解结合液不含有盐酸胍、硫氰酸胍等胍盐，通过高浓度无机盐对样本中病原体进行裂解、低ph环境促进核酸与磁珠的结合。（3）产物纯度高：通过调整裂解结合液、洗涤液中的盐浓度和ph值，降低了杂质的非特异性结合。（4）可自动化操作：本发明匹配多种自动化核酸提取仪，提取32个样本的时间仅为8min，能广泛且快速适用于大规模的临床样本提取。
附图说明
20.图1为实例1中以人唾液/血清/血浆+dna/rna病毒（adv1/h1n1）为样本提取图；图2为实例1中以人唾液/血清/血浆+dna/rna病毒（adv1/h1n1）为样本提取图；图3为实例3中以人唾液/血清/血浆+dna/rna病毒（adv1/h1n1）为样本，以人工提取和机器提取后的pcr扩增示意图；图4为实例3中以人唾液/血清/血浆+dna/rna病毒（adv1/h1n1）为样本，以人工提取和机器提取后的pcr扩增示意图；图5为实例4的结构示意图；图6为实例4中的局部俯视结构示意图；图中：1、试剂盒；2、密封盖；3、锥柱形啮合头；4、上啮合环；5、下啮合环；6、上环槽；7、下环槽；8、六楞面；9、流液孔。
具体实施方式
21.实施例1：本方案以人唾液/血清/血浆+dna/rna病毒（adv1/h1n1）为样本，进行临床样本模拟，以证本发明的裂解结合液、试剂盒及提取方法可以对人唾液、血清、血浆中dna和rna病原体核酸进行高质量提取，从而达到为临床样本病原体检测奠定快速、高质量的基石。
22.本试验所需仪器设备：生物安全柜、金属浴、掌上离心机、磁力架、pcr仪。
23.实验组：依次将180μl唾液/血清/血浆、20μl2000copies/ml的adv1/h1n1病毒、20μl蛋白酶k、500μl所述裂解结合液、20μl磁珠于1.5ml离心管内，上下颠倒混匀后置于室温下裂解1min；置于磁力架上吸磁，弃去管内液体；加入1ml洗涤液ⅰ，上下颠倒混匀后置于磁力架，弃去管内液体；加入1ml洗涤液2，上下颠倒混匀后置于磁力架，弃去管内液体；加入50μl洗脱液，涡旋混匀后置于80℃金属浴洗脱2min。
24.本试验所需仪器设备：生物安全柜、金属浴、掌上离心机、磁力架、pcr仪。
25.实例1结果：结果如表1所示表1.实例1结果样本ct值a260/280ꢀ样本ct值a260/280唾液+adv122.411.88唾液+h1n120.942.02血清+adv122.431.87血清+h1n120.631.98血浆+adv122.141.87血浆+h1n121.951.98结果说明：本发明的裂解结合液、试剂盒及提取方法可以对人唾液、血清、血浆中dna和rna病原体核酸进行高质量提取。
26.实施例2：本方案以人唾液/血清/血浆+dna/rna病毒（adv1/h1n1）为样本，以两款市售同类型产品进行比较，从而使本发明的优势得以具象展示本试验所需仪器设备：生物安全柜、金属浴、掌上离心机、磁力架、pcr仪。
27.实验组：依次将180μl唾液/血清/血浆、20μl2000copies/ml的adv1/h1n1病毒、20μl蛋白酶k、500μl所述裂解结合液、20μl磁珠于1.5ml离心管内，上下颠倒混匀后置于室温下裂解1min；置于磁力架上吸磁，弃去管内液体；加入1ml洗涤液ⅰ，上下颠倒混匀后置于磁力架，弃去管内液体；加入1ml洗涤液ⅱ，上下颠倒混匀后置于磁力架，弃去管内液体；加入50μl洗脱液，涡旋混匀后置于80℃金属浴洗脱2min。
28.对照组1：依次将180μl唾液/血清/血浆、20μl2000copies/ml的adv1/h1n1病毒、500μl所述裂解结合液、20μl磁珠于1.5ml离心管内，上下颠倒混匀后置于室温下裂解5min；置于磁力架上吸磁，弃去管内液体；加入1ml洗涤液ⅰ，上下颠倒混匀后置于磁力架，弃去管内液体；加入1ml洗涤液ⅱ，上下颠倒混匀后置于磁力架，弃去管内液体；加入60μl洗脱液，涡旋混匀后置于56℃金属浴洗脱10min。
29.对照组2：依次将180μl唾液/血清/血浆、20μl2000copies/ml的adv1/h1n1病毒、700μl所述裂解结合液、20μl磁珠于1.5ml离心管内，上下颠倒混匀后置于室温下裂解10min；置于磁力架上吸磁，弃去管内液体；加入1ml洗涤液ⅰ，上下颠倒混匀2min后置于磁力架，弃去管内液体；加入1ml洗涤液ⅱ，上下颠倒混匀2min后置于磁力架，弃去管内液体；加入70μl洗脱液，涡旋混匀后置于80℃金属浴洗脱5min。
30.实例2结果：结果如表2所示表2.实例2结果
结果说明：以人唾液/血清/血浆+dna/rna病毒（adv1/h1n1）为样本进行核酸提取，随后进行pcr验证、比较，发现本发明试剂盒的ct值均比市售的两款同类型试剂盒好，说明了本发明具有较高的提取效率。
31.实施例3：本方案以人唾液/血清/血浆+dna/rna病毒（adv1/h1n1）为样本，以本发明所述的裂解结合液，以人工手提和机器提取这两种提取方式做比较，来验证本发明试剂盒可以适用于机器提取，以达到为广泛适用于大规模的临床检测奠定良好的基础。
32.本试验所需仪器设备：生物安全柜、金属浴、掌上离心机、磁力架、pcr仪、核酸自动提取仪。
33.实验组-人工提取：依次将180μl唾液/血清/血浆、20μl2000copies/ml的adv1/h1n1病毒、20μl蛋白酶k、500μl所述裂解结合液、20μl磁珠于1.5ml离心管内，上下颠倒混匀后置于室温下裂解1min；置于磁力架上吸磁，弃去管内液体；加入1ml洗涤液ⅰ，上下颠倒混匀后置于磁力架，弃去管内液体；加入1ml洗涤液ⅱ，上下颠倒混匀后置于磁力架，弃去管内液体；加入50μl洗脱液，涡旋混匀后置于80℃金属浴洗脱2min。
34.实验组-机器提取：机器提取程序如表3所示，表3.机器提取程序实例3结果：结果如表4所示
表4.实例3结果结果说明：通过以人唾液/血清/血浆+dna/rna病毒（adv1/h1n1）为样本，以人工手提和机器提取这两种提取方式做比较，手提和机提具有较高的一致性，说明本发明试剂盒适用于机器提取，可广泛应用于临床样本病原体检测前的核酸提取。
35.实施例4一种用于盛放如权利要求1的裂解结合液的试剂盒，包含：试剂盒1、密封盖2以及密封结构；密封结构包含：锥柱形啮合头3、上啮合环4、下啮合环5、上环槽6以及下环槽7；锥柱形啮合头3的端面具有向外突出的六楞面8，密封盖2上也具有相应的向内凹陷六楞面8，上啮合环4与下啮合环5分别位于试剂盒1、密封盖2上，上环槽6以及下环槽7分别位于试剂盒1、密封盖2上，上啮合环4、下啮合环5、上环槽6以及下环槽7之间可相互装配。
36.需要说明的是，本技术方案为了增加试剂盒1的密封性，设置了锥柱形啮合头3，该锥柱形啮合头3与密封盖2之间通过螺纹啮合，重点在于，在锥柱形啮合头3上具有六楞面8的凸出部位，该凸出部位由于采用均向中心点倾斜的六楞面8，所以在倾倒液体的时候，液体更加便于流出，同时配合密封盖2上的向内凹陷的六楞面8，从而实现完全密封，且便于倾倒液体；锥柱形啮合头3的端面向外突出的六楞面8的中心部位具有流液孔9。
37.其次，采用上啮合环4、下啮合环5、并配合上环槽6以及下环槽7实现更加吻合的密封。
38.上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。