杂环吡嗪衍生物与其在制备SHP2抑制剂中的应用

杂环吡嗪衍生物与其在制备shp2抑制剂中的应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，涉及杂环吡嗪衍生物与其在制备shp2抑制剂中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.早期shp2抑制剂的研究主要是针对其原位位点，但研究所得活性化合物极性较大、透膜性不佳、生物利用度较差，大大限制了以该类化合物作为先导化合物进行药物开发的可能性。诺华研究人员于2016年发现并报道了具有全新作用机制的变构抑制剂shp099，开启了靶向shp2抗肿瘤药物研发的新时代，之后通过对shp099进行结构改造，得到了很多高活性临床药物。与此同时，更多研究机构和医药企业的科学家们也陆续发现了shp2结构上更多变构位点，并陆续报道了一些靶向化合物。据发明人研究了解，目前针对shp2的变构抑制剂尚无上市药物，且研发走向不明确，需要提供一系列具有新母核结构的shp2变构抑制剂。


技术实现要素：

4.为解决现有技术的不足，本发明的目的是提供杂环吡嗪衍生物与其在制备shp2抑制剂中的应用，本发明提供的杂环吡嗪衍生物对shp2具有明显的亲和力且能够显著抑制shp2酶活性，且部分实施例比shp099表现出更好的抗肿瘤活性。
5.为实现上述目的，本发明的技术方案为:
6.一方面，一种杂环吡嗪衍生物，化学结构如式i所示：
[0007][0008]
其中，x1选自不存在或s；x2选自不存在、哌嗪环、仲胺基、叔胺基、羰基、亚甲基、-nr2(ch2)
n-，n为0～4的自然数，r2为氢或c
1～6
烃基；当x2为哌嗪环时，哌嗪两个n原子分别与吡嗪环和l相连；l选自不存在、亚甲基、羰基、酰胺基、-(c＝nh)-；x3为n或c；包含x3的环为四元至七元芳环、芳杂环、碳环或碳杂环中的任意一种且环上任意位置均可与l连接，杂原子选自o、n、s，并可位于环的任意位置；r1可在环上任意位置取代，可选自c
1-4
烷基取代或未取代氨基、羟基或c
1-4
烷基取代的烷氧基、卤素、氰基、酯基、羰基、氧代、c
1-4
烷基、c
3-7
元杂环基、酰胺基、脲基、胍基。
[0009]
其中，所述叔胺基为-nr
3-，r3的选取范围与上述r2的范围相同。
[0010]
当x1不存在时，苯环与吡嗪环通过碳-碳单键直接连接。
[0011]
当x2不存在、l存在时，吡嗪环与l通过碳-碳单键或碳-氮单键直接连接。
[0012]
当x2存在、l不存在时，x2与包含x3的环通过碳-碳单键、碳-氮单键或氮-氮单键直接连接。
[0013]
当x2不存在、l不存在时，吡嗪环与包含x3的环通过碳-x3单键直接连接。
[0014]
优选地，化学结构如式ii所示：
[0015][0016]
其中，x1选自不存在或s；l1为仲胺基或c
1-4
烷基取代的叔胺基；n1为0～4的自然数；r4为氨基、羟基、氰基、酯基、卤素、c
1-4
烷基；与r4连接的环为c
4-7
含氮杂环基、c
4-7
元氧杂环基或者氨基取代的c
4-7
元碳环基。
[0017]
优选地，化学结构如式iii所示：
[0018][0019]
其中，x1选自不存在或s；x4为o、n或s；r5选自nr6r7、c
1-7
烷基、c
4-7
杂环基或c
4-18
碳环基，r5中环基独立地任意地被c＝o、氨基、c
1-4
烷基取代的氨基、羟基、c
1-4
烷基取代的烷氧基、氰基、酯基、卤素c
1-4
烷基取代或不取代；r6、r7分别独立选自h、六元或五元芳环基、c
1-7
烷基、c
4-7
杂环基、c
4-7
碳环基，或者环合后为任意的c
4-7
杂环基或c
4-7
碳环基，r6、r7中的环基分别独立地被任意的氰基、酯基、卤素、羰基、氨基、c
1-4
烷基取代的氨基、羟基、c
1-4
烷基取代的烷氧基、c
1-7
烷基取代或不取代。
[0020]
优选地，化学结构如式iv所示：
[0021][0022]
其中，x1选自不存在或s；r8、r9分别独立选自氢、六元或五元芳环基、c
1-7
烷基、c
4-7
杂环基、c
4-7
碳环基，或者环合后为任意的c
4-7
杂环基或c
4-7
碳环基，r8、r9中环基分别独立地被任意的氰基、酯基、卤素、羰基、氨基、c
1-4
烷基取代的氨基、羟基、c
1-4
烷基取代的烷氧基、c
1-7
烷基取代或不取代。
[0023]
优选地，化学结构如式v所示：
[0024][0025]
其中，x1选自不存在或s；r
10
为氨基、c
1-4
烷基取代的氨基、羟基、c
1-4
烷基取代的烷氧基、氰基、酯基、酰胺基；与r
10
连接的环选自四元至七元芳环、芳杂环、碳环或碳杂环中的任意一种，其中杂原子可以在环上任意位置。
[0026]
优选地，包含以下化合物：
[0027]
(sduy001)5-((2,3-二氯苯基)硫代)-n
2-(哌啶-4-基)吡嗪-2,6-二胺；
[0028]
(sduy002)n
2-(4-氨基环己基)-5-((2,3-二氯苯基)硫代)吡嗪-2,6-二胺；
[0029]
(sduy003)5-((2,3-二氯苯基)硫代)-n
2-(哌啶-4-基甲基)吡嗪-2,6-二胺；
[0030]
(sduy004)5-((2,3-二氯苯基)硫代)-n
2-(吡咯烷-3-基甲基)吡嗪-2,6-二胺；
[0031]
(sduy005)5-((2,3-二氯苯基)硫代)-n
2-(哌啶-3-基甲基)吡嗪-2,6-二胺；
[0032]
(sduy006)3-((2,3-二氯苯基)硫代)-6-(哌嗪-1-基)吡嗪-2-胺；
[0033]
(sduy008)n
2-(氮杂环丁烷-3-基甲基)-5-((2,3-二氯苯基)硫代)吡嗪-2,6-二胺；
[0034]
(sduy009)5-((2,3-二氯苯基)硫代)-n
2-甲基-n
2-(哌啶-4-基)吡嗪-2,6-二胺；
[0035]
(sduy010)4-((6-氨基-5-((2,3-二氯苯基)硫代)吡嗪-2-氨基)-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-醇酯；
[0036]
(sduy041)5-((2,3-二氯苯基)硫代)-n
2-甲基-n
2-(哌啶-3-基)吡嗪-2,6-二胺；
[0037]
(sduy042)5-((2,3-二氯苯基)硫代)-n
2-甲基-n
2-(吡咯烷-3-基)吡嗪-2,6-二胺；
[0038]
(sduy043)n
2-(氮杂环丁烷-3-基)-5-((2,3-二氯苯基)硫代)-n
2-甲基吡嗪-2,6-二胺；
[0039]
(sduy044)5-((2,3-二氯苯基)硫代)-n
2-甲基-n
2-(哌啶-3-基甲基)吡嗪-2,6-二胺；
[0040]
(sduy045)5-((2,3-二氯苯基)硫代)-n
2-甲基-n
2-(哌啶-4-基甲基)吡嗪-2,6-二胺；
[0041]
(sduy046)n
2-(氮杂卓-4-基)-5-((2,3-二氯苯基)硫代)吡嗪-2,6-二胺；
[0042]
(sduy047)5-((2,3-二氯苯基)硫代)-n
2-(吗啉-2-基甲基)吡嗪-2,6-二胺；
[0043]
(sduy048)5-((2,3-二氯苯基)硫代)-n
2-(吡咯烷-2-基甲基)吡嗪-2,6-二胺；
[0044]
(sduy051)n
2-(氮杂环丁烷-3-基)-5-((2,3-二氯苯基)硫代)吡嗪-2,6-二胺；
[0045]
(sduy011)(4-(6-氨基-5-((2,3-二氯苯基)硫代)吡嗪-2-基)哌嗪-1-基)(四氢呋喃-2-基)甲酮；
[0046]
(sduy012)(4-(6-氨基-5-((2,3-二氯苯基)硫代)吡嗪-2-基)哌嗪-1-基)(四氢呋喃-3-基)甲酮；
[0047]
(sduy013)4-(6-氨基-5-((2,3-二氯苯基)硫代)吡嗪-2-基)-n-(4-甲氧基苯基)哌嗪-1-甲酰胺；
[0048]
(sduy014)4-(6-氨基-5-((2,3-二氯苯基)硫代)吡嗪-2-基)-n-(4-氰基苯基)哌嗪-1-甲酰胺；
[0049]
(sduy016)3-(4-(6-氨基-5-((2,3-二氯苯基)硫代)吡嗪-2-基)哌嗪-1-羰基)环戊酮；
[0050]
(sduy017)(4-(6-氨基-5-((2,3-二氯苯基)硫代)吡嗪-2-基)哌嗪-1-基)((1r,3s)-3-氨基环戊基)甲酮；
[0051]
(sduy018)4-(6-氨基-5-((2,3-二氯苯基)硫代)吡嗪-2-基)哌嗪-1-甲酰胺；
[0052]
(sduy19)4-(6-氨基-5-((2,3-二氯苯基)硫代)吡嗪-2-基)哌嗪-1-甲脒胺盐酸盐；
[0053]
(sduy021)(s)-4-(6-氨基-5-((2,3-二氯苯基)硫代)吡嗪-2-基)-n-(吡咯烷-3-基)哌嗪-1-甲酰胺；
[0054]
(sduy022)6-氨基-5-(2,3-二氯苯基)-n-(哌啶-3-基)吡嗪-2-甲酰胺；
[0055]
(sduy023)(4-氨基-4-甲基哌啶-1-基)(6-氨基-5-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-基)甲酮；
[0056]
(sduy024)6-氨基-5-(2,3-二氯苯基)-n-(吡咯烷-3-基)吡嗪-2-甲酰胺；
[0057]
(sduy025)6-氨基-5-(2,3-二氯苯基)-n-(哌啶-4-基)吡嗪-2-甲酰胺；
[0058]
(sduy026)(6-氨基-5-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-基)(3-氨基吡咯烷-1-基)甲酮；
[0059]
(sduy028)6-((4-氨基-4-甲基哌啶-1-基)甲基)-3-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-胺；
[0060]
(sduy029)6-((3-氨基哌啶-1-基)甲基)-3-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-胺；
[0061]
(sduy030)6-((3-氨基吡咯烷-1-基)甲基)-3-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-胺。
[0062]
另一方面，一种上述杂环吡嗪衍生物的制备方法，以化合物1a和2,3-二氯苯硫酚2a作为起始原料，按照如下反应路线获得a系列目标化合物；
[0063][0064]
第三方面，一种药物组合物，含有上述杂环吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐。
[0065]
本发明所述的其药学上可接受的盐，包括盐酸盐、硫酸盐、磺酸盐、枸橼酸盐等。
[0066]
第四方面，一种药物制剂，包括活性药物或药学上可接受的辅料，所述活性药物为上述杂环吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐，或者上述药物组合物。
[0067]
本发明所述辅料包括但不限于溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
[0068]
第五方面，一种上述杂环吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐、药物组合物或药物制剂在制备shp2抑制剂中的应用。
[0069]
第六方面，一种上述杂环吡嗪衍生物或其药学上可接受的盐、药物组合物或药物
制剂在制备抗肿瘤细胞增殖药物中的应用。
[0070]
优选地，所述肿瘤细胞为人肝癌细胞及乳腺癌细胞。
[0071]
本发明的有益效果为：
[0072]
本发明的实验数据表明，本发明提供的杂环吡嗪衍生物对shp2蛋白均有明显的变构抑制作用。其中，在10μm浓度下，sduy001、sduy003、sduy004、sduy005、sduy006、sduy009、sduy019、sduy044、sduy045、sduy046、sduy047对shp2酶活的抑制率均高于50％；sduy003、sduy004、sduy005、sduy006、sduy009、sduy019、sduy044、sduy045、sduy047对shp2酶活的抑制率高于70％；sduy003、sduy005、sduy006、sduy009、sduy019和sduy045对shp2酶活的抑制率大于80％。
[0073]
本发明提供了一种针对杂环吡嗪化合物亲和力的全新检测方法，基于亲和力kd值可以初步筛选活性较好的化合物。本发明的研究数据表明，所提供的部分杂环吡嗪衍生物与shp2具有很好的亲和力，其中化合物sduy003、sduy005、sduy006、sduy009和sduy019的kd值均小于10μm。
[0074]
本发明提供的杂环吡嗪衍生物对肿瘤细胞，尤其是人huh7、hepg2肝癌细胞及4t1乳腺癌细胞具有抗增殖活性。其中，sduy001和sduy010对人肝癌细胞的抗增殖活性更好，sduy001、sduy005、sduy009对4t1乳腺癌细胞的抗增殖活性更为明显。
附图说明
[0075]
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
[0076]
图1为本发明试验例1的shp2变构抑制剂酶活测定的原理图。
[0077]
图2为本发明实施例提供的杂环吡嗪衍生物对shp2蛋白酶活的抑制曲线；
[0078]
图3为本发明实施例提供的杂环吡嗪衍生物对huh7及hepg2肿瘤细胞的抗增殖活性图。
[0079]
图4为本发明实施例提供的杂环吡嗪衍生物对4t1肿瘤细胞的抗增殖活性图。
具体实施方式
[0080]
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0081]
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0082]
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
[0083]
以下实施例中合成了a、b、c、d四个系列化合物，其中，a系列化合物有sduy001-sduy006、sduy008-sduy010、sduy041-sduy048、sduy051；b系列化合物的化合物有sduy011-sduy014、sduy016-sduy019、sduy021；c系列化合物的化合物有sduy022-sduy026；d系列化
合物的化合物有sduy028-sduy030。
[0084]
a系列化合物的制备路线：起始原料1a和2,3-二氯苯硫酚2a经乌尔曼反应得关键中间体3a，然后与不同的一级或者二级脂肪胺(a1-a18)在高温条件下发生取代反应；其中，此步可以直接得到终产物sduy010，其余中间体需经三氟乙酸脱保护基得目标产物。
[0085][0086]
下面以目标产品sduy001的制备为例，介绍该系列化合物的制备方法。
[0087]
实施例1
[0088]
5-((2,3-二氯苯基)硫代)-n
2-(哌啶-4-基)吡嗪-2,6-二胺的合成(sduy001)
[0089]
中间体6-氯-3-((2,3-二氯苯基)硫代)吡嗪-2-胺(3a)的制备：
[0090]
将化合物1a(4.00g,19.2mmol)、2,3-二氯苯硫酚(5.20g，29.0mmol)、碘化亚铜(731mg，3.84mmol)、1,10-菲啰啉(1.38g，7.60mmol)和磷酸钾(8.15g，38.4mmol)加入到100ml 1,4-二氧六环中，氮气保护后于85℃油浴中反应。tlc监测反应结束后，反应液抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，滤液浓缩后残留物经硅胶柱层析(乙酸乙酯：石油醚：二氯甲烷＝1：2.5：1)得产品粗品，进一步经二氯甲烷打浆得产品(3a)3.0g，产率51.0％。
[0091]
sduy001的制备：
[0092]
将化合物6-氯-3-((2,3-二氯苯基)硫代)吡嗪-2-胺(3a，450mg，1.47mmol)、4-氨基哌啶-1-羧酸叔丁酯(a1，882mg，4.40mmol)和n,n-二异丙基乙胺(3ml)溶于9ml n-甲基吡咯烷酮中，于闷罐中150℃中反应。tlc监测反应结束后，反应液恢复至室温，浓缩至3ml，缓慢倒入到15ml水中。抽滤，滤饼用水洗涤多次，干燥后得产品粗品。将此产品溶于6ml二氯甲烷中，然后加入2ml三氟乙酸，于室温下反应。tlc监测反应结束后，反应液浓缩，加入50ml二氯甲烷，饱和碳酸氢钠中和至ph＝7-8,分液萃取，有机相干燥浓缩，残留物经硅胶柱层析(甲醇：二氯甲烷＝1：4，另加4％氨水)得目标产品(sduy001)133mg，两步反应产率24.5％。
[0093]1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ7.40(dd,j＝8.0,1.4hz,1h),7.33-7.28(m,2h),7.22(t,j＝8.0hz,1h),6.57(dd,j＝8.1,1.4hz,1h),6.06(s,2h),3.96-3.90(m,1h),3.36-3.32(m,2h),3.04-2.96(m,2h),2.11-2.04(m,2h),1.68-1.60(m,2h).
[0094]
实施例2
[0095]
与实施例1相同，不同在于：将4-氨基哌啶-1-羧酸叔丁酯(a1)替换为叔丁基(4-氨基环己基)氨基甲酸酯(a2)，获得目标产品sduy002。
[0096]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.37(dd,j＝8.0,1.4hz,1h),7.25(s,1h),7.20(t,j＝8.0hz,1h),7.11(d,j＝7.7hz,1h),6.55(dd,j＝8.1,1.4hz,1h),6.06(s,2h),3.77-3.56(m,1h),3.09-2.92(m,1h),2.19-1.81(m,4h),1.53-1.14(m,4h).
[0097]
实施例3
[0098]
与实施例1相同，不同在于：将4-氨基哌啶-1-羧酸叔丁酯(a1)替换为4-(氨甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(a3)，获得目标产品sduy003。
[0099]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.38(dd,j＝8.0,1.4hz,1h),7.30(s,1h),7.21(q,j＝
6.5,4.9hz,2h),6.57(dd,j＝8.1,1.4hz,1h),6.05(s,2h),3.65-3.58(m,1h),3.12(t,j＝6.0hz,2h),3.01-2.90(m,2h),2.50-2.37(m,2h),1.80-1.72(m,1h),1.69-1.61(m,2h),1.11-0.99(m,2h).
[0100]
实施例4
[0101]
与实施例1相同，不同在于：将4-氨基哌啶-1-羧酸叔丁酯(a1)替换为3-(氨甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(a4)，获得目标产品sduy004。
[0102]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.47-7.33(m,2h),7.30(s,1h),7.20(t,j＝8.0hz,1h),6.55(dd,j＝8.1,1.4hz,1h),6.11(s,2h),3.34-3.22(m,4h),3.20-3.10(m,1h),3.00-2.83(m,1h),2.60-2.50(m,2h),2.13-1.96(m,1h),1.76-1.54(m,1h).
[0103]
实施例5
[0104]
与实施例1相同，不同在于：将4-氨基哌啶-1-羧酸叔丁酯(a1)替换为3-(氨甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(a5)，获得目标产品sduy005。
[0105]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.56-7.28(m,3h),7.22(t,j＝8.0hz,1h),6.57(dd,j＝8.0,1.4hz,1h),6.12(s,2h),3.30-3.24(m,2h),3.23-3.07(m,2h),2.91-2.73(m,1h),2.63(t,j＝12.0hz,1h),2.05-1.93(m,1h),1.92-1.73(m,2h),1.70-1.52(m,1h),1.28-1.18(m,1h).
[0106]
实施例6
[0107]
与实施例1相同，不同在于：将4-氨基哌啶-1-羧酸叔丁酯(a1)替换为哌嗪-1-甲酸叔丁酯(a6)，获得目标产品sduy006。
[0108]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.63(s,1h),7.38(dd,j＝8.0,1.4hz,1h),7.20(t,j＝8.0hz,1h),6.57(dd,j＝8.1,1.4hz,1h),6.19(s,2h),6.04(s,2h),3.61-3.49(m,4h),3.47-3.32(m,4h).
[0109]
实施例7
[0110]
与实施例1相同，不同在于：将4-氨基哌啶-1-羧酸叔丁酯(a1)替换为3-(氨甲基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(a7)，获得目标产品sduy008。
[0111]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.46-7.34(m,2h),7.30(s,1h),7.22(t,j＝8.0hz,1h),6.57(dd,j＝8.1,1.4hz,1h),6.14(s,2h),3.99(dd,j＝10.7,8.6hz,2h),3.78(dd,j＝10.7,7.1hz,2h),3.47(t,j＝6.2hz,2h),3.07-2.96(m,1h).
[0112]
实施例8
[0113]
与实施例1相同，不同在于：将4-氨基哌啶-1-羧酸叔丁酯(a1)替换为4-(甲基氨基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(a8)，获得目标产品sduy009。
[0114]1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ7.58(s,1h),7.39(dd,j＝8.0,1.4hz,1h),7.20(t,j＝8.0hz,1h),6.56(dd,j＝8.1,1.4hz,1h),6.13(s,2h),4.49(t,j＝12.6hz,1h),3.43-3.35(m,2h),3.04-2.95(m,2h),2.89(s,3h),2.00-1.90(m,2h),1.84-1.74(m,2h).
[0115]
实施例9
[0116]
与实施例1相同，不同在于：将4-氨基哌啶-1-羧酸叔丁酯(a1)替换为4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-醇酯(a9)，不需要脱boc基直接可获得目标产品sduy010。
[0117]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.39(dd,j＝8.0,1.4hz,1h),7.29-7.18(m,2h),7.01(d,j＝7.7hz,1h),6.58(dd,j＝8.1,1.4hz,1h),5.98(s,2h),4.26-4.11(m,1h),1.85-1.72
(m,2h),1.20(s,7h),1.09-0.95(m,7h).
[0118]
实施例10
[0119]
与实施例1相同，不同在于：将4-氨基哌啶-1-羧酸叔丁酯(a1)替换为3-(甲基氨基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(a10)，获得目标产品sduy041。
[0120]1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ7.50(s,1h),7.40(dd,j＝8.0,1.4hz,1h),7.22(t,j＝8.0hz,1h),6.57(dd,j＝8.1,1.4hz,1h),6.12(s,2h),4.34-4.24(m,1h),2.92(s,3h),2.88-2.78(m,2h),2.62(t,j＝11.2hz,1h),2.41-2.34(m,1h),1.77-1.64(m,3h),1.53-1.44(m,1h).
[0121]
实施例11
[0122]
与实施例1相同，不同在于：将4-氨基哌啶-1-羧酸叔丁酯(a1)替换为3-(甲基氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(a11)，获得目标产品sduy042。
[0123]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.50(s,1h),7.45-7.32(m,1h),7.22(t,j＝8.0hz,1h),6.58(d,j＝7.9hz,1h),6.14(s,2h),5.08-4.97(m,1h),3.47-3.35(m,2h),3.20-3.02(m,2h),2.93(s,3h),2.02-1.79(m,2h).
[0124]
实施例12
[0125]
与实施例1相同，不同在于：将4-氨基哌啶-1-羧酸叔丁酯(a1)替换为3-(甲基氨基)氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯(a12)，获得目标产品sduy043。
[0126]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.46(d,j＝7.9hz,1h),7.26(t,j＝8.0hz,1h),6.96(d,j＝8.0hz,1h),6.60(s,1h),4.19-3.78(m,4h),2.90(s,3h),2.76(dd,j＝13.6,2.8hz,1h).
[0127]
实施例13
[0128]
与实施例1相同，不同在于：将4-氨基哌啶-1-羧酸叔丁酯(a1)替换为3-((甲基氨基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(a13)，获得目标产品sduy044。
[0129]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.47(s,1h),7.38(dd,j＝8.0,1.4hz,1h),7.22(t,j＝8.0hz,1h),6.57(dd,j＝8.1,1.4hz,1h),6.07(s,2h),3.43(dd,j＝14.1,8.0hz,1h),3.36-3.32(m,1h),3.03(s,3h),2.86-2.75(m,2h),2.46-2.39(m,1h),2.29-2.22(m,1h),1.87-1.78(m,1h),1.72-1.64(m,1h),1.61-1.51(m,1h),1.38-1.28(m,1h),1.17-1.03(m,1h).
[0130]
实施例14
[0131]
与实施例1相同，不同在于：将4-氨基哌啶-1-羧酸叔丁酯(a1)替换为4-((甲基氨基)甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(a14)，获得目标产品sduy045。
[0132]1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ7.50(s,1h),7.40(dd,j＝8.0,1.4hz,1h),7.22(t,j＝8.0hz,1h),6.57(dd,j＝8.1,1.4hz,1h),6.12(s,2h),4.29(s,1h),2.92(s,3h),2.88-2.78(m,2h),2.62(t,j＝11.2hz,1h),2.41-2.34(m,1h),1.77-1.64(m,3h),1.53-1.44(m,1h).
[0133]
实施例15
[0134]
与实施例1相同，不同在于：将4-氨基哌啶-1-羧酸叔丁酯(a1)替换为4-氨基氮杂庚烷-1-甲酸叔丁酯(a15)，获得目标产品sduy046。
[0135]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.38(dd,j＝7.9,1.5hz,1h),7.28(s,1h),7.22(t,j＝8.0hz,1h),7.10(d,j＝7.9hz,1h),6.58(dd,j＝8.0,1.5hz,1h),5.99(s,2h),4.06-3.91(m,1h),2.90-2.65(m,4h),2.02-1.80(m,2h),1.73-1.49(m,4h).
[0136]
实施例16
3.71(m,2h),3.73-3.44(m,8h),2.14-1.95(m,2h),1.93-1.77(m,2h).
[0152]
实施例20
[0153]
与实施例19相同，不同在于:将羧酸化合物四氢呋喃-2-羧酸(1b)替换为四氢呋喃-3-羧酸(2b)，获得目标产品sduy012。
[0154]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.64(s,1h),7.41(dd,j＝8.0,1.4hz,1h),7.23(t,j＝8.0hz,1h),6.59(dd,j＝8.1,1.4hz,1h),6.26(s,2h),3.90(t,j＝8.1hz,1h),3.76-3.68(m,3h),3.66-3.57(m,7h),3.46-3.39(m,2h),2.11-1.99(m,2h).
[0155]
实施例21
[0156]
与实施例19相同，不同在于:将羧酸化合物四氢呋喃-2-羧酸(1b)替换为3-氧代环戊烷甲酸(3b)，获得目标产品sduy016。
[0157]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.65(s,1h),7.41(dd,j＝8.0,1.4hz,1h),7.23(t,j＝8.0hz,1h),6.61(dd,j＝8.1,1.4hz,1h),6.23(s,2h),3.77-3.45(m,9h),2.44-2.25(m,2h),2.28-2.08(m,3h),2.02-1.86(m,1h).
[0158]
实施例22
[0159]
与实施例19相同，不同在于：将羧酸化合物四氢呋喃-2-羧酸(1b)替换为(1r,3s)-3-((叔丁氧羰基)氨基)环戊烷甲酸(4b)后获得中间体5b,进而脱保护获得产品sduy017。
[0160]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.63(s,1h),7.40(d,j＝8.0hz,1h),7.22(t,j＝8.0hz,1h),6.59(d,j＝8.0hz,1h),6.22(s,2h),3.71-3.54(m,8h),3.11-3.05(m,1h),2.04-1.94(m,1h),1.90-1.70(m,3h),1.53-1.43(m,1h),1.41-1.32(m,1h).
[0161]
部分b系列化合物的制备路线：中间体sduy006与不同的异氰酸酯反应可制备得sduy013、sduy014和sduy018，与1h-吡唑-1-甲脒盐酸盐在碱性条件下反应可制得化合物sduy019。
[0162][0163]
实施例23
[0164]
sduy013的制备：
[0165]
将中间体sduy006(80mg，0.225mmol)、三乙胺(68mg，0.670mmol)溶于1.5ml四氢呋喃中，于室温下缓慢滴加对甲氧基苯基异氰酸酯(33mg，0.221mmol)的四氢呋喃溶液0.5ml，滴毕于室温下搅拌30min。反应结束后反应液浓缩，残留物经硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝20：1)得产品粗品，进一步经甲醇打浆得产品(sduy013)65mg，产率57.5％。
[0166]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.43(s,1h),7.68(s,1h),7.44-7.33(m,3h),7.23(t,j
＝8.0hz,1h),6.89-6.81(m,2h),6.61(dd,j＝8.0,1.4hz,1h),6.22(s,2h),3.70-3.61(m,4h),3.61-3.50(m,4h).
[0167]
实施例24
[0168]
sduy014的制备：
[0169]
与实施例23相同，不同在于：将对甲氧基苯基异氰酸酯替换为对氰基苯基苯基异氰酸酯，获得sduy014。
[0170]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.08(s,1h),7.69(d,j＝7.7hz,5h),7.41(dd,j＝8.0,1.4hz,1h),7.23(t,j＝8.0hz,1h),6.61(dd,j＝8.1,1.4hz,1h),6.23(s,2h),3.75-3.55(m,8h).
[0171]
实施例25
[0172]
sduy018的制备：
[0173]
与实施例23相同，不同在于：将对甲氧基苯基异氰酸酯替换为三甲基硅基异氰酸酯，获得sduy018。
[0174]1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ7.63(s,1h),7.38(dd,j＝8.0,1.4hz,1h),7.20(t,j＝8.0hz,1h),6.58(dd,j＝8.1,1.4hz,1h),6.18(s,2h),6.03(s,2h),3.57-3.52(m,4h),3.41-3.36(m,4h).
[0175]
实施例26
[0176]
sduy019的制备：
[0177]
将中间体sduy006(100mg，0.281mmol)、1h-吡唑-1-甲脒盐酸盐(41mg，0.280mmol)和n,n-二异丙基乙胺(181mg，1.40mmol)溶于4ml乙腈和1ml n,n-二甲基甲酰胺中，混合物于室温下搅拌3h。反应结束后反应液浓缩，残留物经反相c18中压制备柱层析(5％-50％甲醇/水)得产品(sduy019)68mg，产率60.7％。
[0178]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.66(s,1h),7.50(s,4h),7.41(dd,j＝7.9,1.4hz,1h),7.22(t,j＝8.0hz,1h),6.59(dd,j＝8.1,1.4hz,1h),6.26(s,2h),3.78-3.64(m,4h),3.63-3.53(m,4h).
[0179]
实施例27
[0180]
sduy021的制备：
[0181]
原料6b与n,n'-羰基二咪唑(cdi)在碱性条件下反应制得脲中间体7b，然后与sduy006反应得8b，脱boc后得终产物sduy021。
[0182][0183]
步骤1：将起始原料(s)-3-氨基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯6b(56mg，0.30mmol)、n,n'-羰基二咪唑(49mg，0.30mmol)和n,n-二异丙基乙胺(116mg，0.90mmol)溶于4ml乙腈中，氮气保护后混合物于室温下搅拌3h。反应结束后反应液直接用于下一步反应。
[0184]
步骤2：于上述反应液中直接加入中间体sduy006(107mg，0.30mmol)，混合物于室
温下反应16h。反应液浓缩，残留物经硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝20：1)得产品(8b)110mg，产率64.5％。
[0185]
步骤3：脱boc的操作及后处理同上述介绍，110mg中间体8b用于该步反应，得终产物(sduy021)55mg，产率60.7％。
[0186]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.67(s,1h),7.42(dd,j＝8.0,1.5hz,1h),7.24(t,j＝8.0hz,1h),6.68-6.47(m,2h),6.26(s,2h),4.15-4.01(m,1h),3.65-3.52(m,4h),3.49-3.39(m,4h),3.13-2.90(m,2h),2.88-2.78(m,1h),2.73-2.62(m,1h),2.04-1.88(m,1h),1.71-1.58(m,1h).
[0187]
c系列化合物的制备路线：起始原料1c与2,3-二氯苯硼酸经suzuki反应制得2c，进一步保护氨基后再脱掉一个boc得中间体4c，4c经插羰反应得5c，进一步水解得到关键中间体6c，6c与不同的脂肪胺经缩合反应后脱boc制得不同的终产物sduy022-sduy026。
[0188][0189]
实施例28
[0190]
sduy023的制备：
[0191]
步骤1：将化合物3-溴-6-氯吡嗪-2-胺(1a，4.92g,23.60mmol)、2,3-二氯苯硼酸(4.5g，23.58mmol)、1,1'-二(二苯膦基)二茂铁二氯化钯(ii)(691mg，0.94mmol)和磷酸钾(15.0g，70.65mmol)加入到100ml 1,4-二氧六环和20ml水中，氮气保护后于70℃油浴中反应。tlc监测反应结束后，向反应液中加入100ml水，分液萃取，水相用乙酸乙酯萃取两次(100ml
×
2)，收集有机相，干燥、浓缩得产品粗品(2c)，直接用于下一步反应。
[0192]
步骤2：将中间体2c(粗品)、4-二甲氨基吡啶(576mg，4.71mmol)溶于200ml二氯甲烷中，于室温下缓慢滴加二碳酸二叔丁酯(12.9g，59.1mmol)，滴毕于25℃下搅拌4h。反应结束后，反应液水洗三次(200ml
×
3)，收集有机相，干燥、浓缩后残留物经硅胶柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1：10)得产品(3c)8.9g，两步反应产率79.5％。
[0193]
步骤3：将中间体3c(5.0g，10.5mmol)溶于20ml甲醇和20ml四氢呋喃中，室温下加入氢氧化钠(842mg，21.1mmol)的水溶液(4ml)，于25℃下搅拌3h。反应结束后反应液浓缩至4ml，加入100ml乙酸乙酯和100ml水后分液萃取，有机相干燥、浓缩，残留物经硅胶柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1：10)得产品(4c)3.1g，反应产率79.5％。
[0194]
步骤4：将化合物(6-氯-3-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-基)氨基甲酸叔丁酯(4c，3.1g,8.28mmol)、1,1'-二(二苯膦基)二茂铁二氯化钯(ii)(606mg，0.83mmol)和三乙胺(2.5g，24.7mmol)加入到50ml甲醇中，一氧化碳换气三次后于75℃油浴中反应20h。反应结束后反应液浓缩，残留物经硅胶柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1：3)得产品(5c)1.2g，反应产率36.4％。
[0195]
步骤5：将中间体6-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-甲酸甲酯(5c，760mg，1.91mmol)溶于5ml甲醇、5ml四氢呋喃和2ml水中，于25℃下搅拌16h。反应结束后反应液浓缩至2ml，再加入20ml水，1n稀盐酸中和至ph＝5-6，抽滤，滤饼用水洗涤，干燥后得产品粗品，进一步经反相c18中压制备柱层析(5％-85％甲醇/水)得产品(6c)600mg，反应产率81.9％。
[0196]
步骤6：将化合物6-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-羧酸(6c，150mg，0.39mmol)、(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(c2，167mg，0.78mmol)和n,n-二异丙基乙胺(151mg，1.17mmol)溶于5ml二氯甲烷中，于室温下加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(297mg，0.78mmol)后室温搅拌16h。反应结束后反应液浓缩，残留物经硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝30：1)得产品粗品255mg，直接用于下一步反应。将此粗品溶于6ml二氯甲烷中，加入2ml三氟乙酸后于25℃下反应2h。反应液浓缩，加入1ml甲醇后，用饱和氢氧化钠的甲醇溶液中和反应液至ph＝8-9，体系浓缩，残留物经反相c18中压制备柱层析(5％-80％甲醇/水)得产品(sduy023)85mg，两步反应产率57.4％。
[0197]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.86(s,1h),7.72(dd,j＝8.0,1.6hz,1h),7.46(t,j＝7.8hz,1h),7.39(dd,j＝7.6,1.6hz,1h),6.36(s,2h),3.95-3.80(m,1h),3.46-3.37(m,2h),3.16-3.07(m,1h),1.49-1.28(m,6h),1.07(s,3h).
[0198]
实施例29
[0199]
与实施例28相同，不同在于：步骤6中的(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(c2)替换为3-氨基哌啶-1-甲酸叔丁酯(c1)，获得sduy022。
[0200]1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.34(s,1h),8.11(d,j＝8.5hz,1h),7.72(dd,j＝8.1,1.5hz,1h),7.46(t,j＝7.8hz,1h),7.37(dd,j＝7.6,1.6hz,1h),6.45(s,2h),3.91-3.83(m,1h),2.90(dd,j＝11.7,3.5hz,1h),2.72-2.66(m,1h),2.60-2.49(m,2h),1.79-1.73(m,1h),1.66-1.49(m,2h),1.46-1.38(m,1h).
[0201]
实施例30
[0202]
与实施例26相同，不同在于：步骤6中的(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(c2)替换为3-氨基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(c3)，获得sduy024。
[0203]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.34(s,1h),8.21(d,j＝7.9hz,1h),7.75(dd,j＝8.0,1.6hz,1h),7.49(t,j＝7.8hz,1h),7.39(dd,j＝7.7,1.6hz,1h),6.46(s,2h),4.47-4.23(m,1h),3.06-2.86(m,2h),2.86-2.74(m,1h),2.74-2.63(m,1h),2.14-2.01(m,1h),1.69-1.52(m,1h).
[0204]
实施例31
[0205]
与实施例26相同，不同在于：步骤6中的(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(c2)替换为4-氨基哌啶-1-羧酸叔丁酯(c4)，获得sduy025。
[0206]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.34(s,1h),8.05(d,j＝8.4hz,1h),7.75(d,j＝8.0hz,1h),7.49(t,j＝7.8hz,1h),7.39(d,j＝7.6hz,1h),6.47(s,2h),3.93-3.76(m,1h),3.03-2.90(m,2h),2.65-2.52(m,2h),1.86-1.71(m,2h),1.50-1.33(m,2h).
[0207]
实施例32
[0208]
与实施例26相同，不同在于：步骤6中的(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(c2)替换为3-氨基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(c5)，获得sduy026。
[0209]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.05(d,j＝3.7hz,1h),7.74(dd,j＝8.0,1.6hz,1h),7.48(t,j＝7.8hz,1h),7.40(dd,j＝7.6,1.6hz,1h),6.37(s,2h),3.83-3.48(m,4h),3.25-3.16(m,1h),2.00-1.94(m,1h),1.70-1.58(m,1h).
[0210]
d系列化合物的制备路线如下：中间体6-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-甲酸甲酯(5c)经还原后得化合物(3-(2,3-二氯苯基)-6-(羟甲基)吡嗪-2-基)氨基甲酸叔丁酯(1d)，进一步与甲磺酸酐反应后得到关键中间体(6-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-基)甲基磺酸酯(2d)，中间体2d与不同的脂肪胺(d1-d3)取代然后脱boc即可得到终产物sduy028-sduy030。
[0211][0212]
中间体1d的制备：
[0213]
步骤1:将中间体6-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-甲酸甲酯(5c，1.2g，3.0mmol)溶于10ml甲醇和10ml四氢呋喃中，于室温下缓慢加入硼氢化钠(342mg，9.0mmol)，于25℃下搅拌1h。反应结束后，加入冰水淬灭反应，浓缩后加入100ml乙酸乙酯和100ml水，分液萃取，有机相再用水洗涤两次(100ml
×
2)，收集有机相、干燥、浓缩后加入乙酸乙酯和石油醚混合溶剂(1ml/5ml)，打浆抽滤，滤饼用此混合溶液洗涤，干燥后得产品(1d)800mg，反应产率71.7％。
[0214]
实施例33
[0215]
sduy028的制备：
[0216]
步骤1：将化合物(3-(2,3-二氯苯基)-6-(羟甲基)吡嗪-2-基)氨基甲酸叔丁酯(1d，200mg，0.54mmol)和三乙胺(164mg，1.62mmol)溶于4ml四氢呋喃中，于0℃下缓慢滴加甲磺酸酐(113mg，0.65mmol)的四氢呋喃溶液(1ml)，滴毕于25℃下反应3h。反应结束后，加入1ml饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，然后加入20ml乙酸乙酯和20ml水，分液萃取，有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤(20ml
×
1)，有机相干燥浓缩得产品粗品(2d)，直接用于下一步反应。
[0217]
步骤2：将上步所得(6-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(2,3-二氯苯基)吡嗪-2-基)甲基磺酸酯(2d粗品)、(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(d1，127mg，0.59mmol)和碳酸铯(352mg，1.08mmol)溶于5ml乙腈中，于25℃下反应30min。反应结束后，反应液抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，滤液浓缩，残留物经反相c18中压制备柱层析(5％-80％甲醇/水)得产品160mg，两步反应产率52.3％。
[0218]
步骤3：脱boc的操作及后处理同上述类似，160mg上述所得中间体用于该步反应，得终产物(sduy028)45mg，产率43.7％。
[0219]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.85(s,1h),7.72(dd,j＝8.1,1.6hz,1h),7.47(t,j＝7.8hz,1h),7.37(dd,j＝7.7,1.6hz,1h),6.09(s,2h),3.47(s,2h),2.52-2.37(m,4h),1.58-1.30(m,6h),1.05(s,3h).
[0220]
实施例34
[0221]
与实施例31相同，不同在于：步骤2中的(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(d1)
替换为3-氨基哌啶-1-甲酸叔丁酯(d2)，获得sduy029。
[0222]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.84(s,1h),7.70(dd,j＝8.0,1.6hz,1h),7.45(t,j＝7.8hz,1h),7.36(dd,j＝7.6,1.6hz,1h),6.08(s,2h),3.51-3.41(m,2h),2.83-2.75(m,1h),2.74-2.62(m,2h),2.04-1.93(m,1h),1.80-1.70(m,2h),1.65-1.60(m,1h),1.51-1.43(m,1h),1.03-0.90(m,1h).
[0223]
实施例35
[0224]
与实施例31相同，不同在于：步骤2中的(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(d1)替换为3-氨基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(d3)，获得sduy030。
[0225]1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ7.85(s,1h),7.70(dd,j＝8.0,1.6hz,1h),7.45(t,j＝7.8hz,1h),7.36(dd,j＝7.6,1.6hz,1h),6.03(s,2h),3.60-3.52(m,2h),3.39-3.35(m,1h),2.77-2.72(m,1h),2.68-2.62(m,1h),2.56-2.52(m,1h),2.27-2.22(m,1h),2.07-2.01(m,1h),1.43-1.37(m,1h).
[0226]
试验例1：shp2变构抑制剂酶活测定
[0227]
选取胰岛素受体底物1(2p-irsl)作为shp2激活剂，以6,8-二氟-4-甲基-7-羟基香豆素磷酸酯(difmup)作为底物，活化的shp2可以使其去磷酸化生成带荧光的物质difmu，在358/455nm下可检测荧光强度。小分子化合物抑制shp2蛋白酶的活性，从而抑制difmup的去磷酸化，荧光产物difmu生成减少。因此，本发明以反应体系中荧光强度的变化评估化合物对shp2的抑制作用，实验原理如图1所示。步骤如下：
[0228]
(1)小分子抑制剂溶液配置：用dmso配置化合物50mm母液，于-20℃保存待用，单浓度活性筛选选用10μm，每次实验现配现用。
[0229]
(2)用dmso分别配置difmup母液(2mm)和2p-irs1母液(1mm)，于-20℃和-80℃保存备用，每次实验现配现用。
[0230]
(3)shp2蛋白母液浓度为3.4mg/ml，于-80℃保存备用，每次实验现配现用。
[0231]
(4)实验buffer准备：60mm hepes，75mm nacl，75mm kcl，1mm edta，5mm dtt，0.05％p20，ph＝7.2。
[0232]
(5)实验方法：以加入shp2蛋白、2p-irs1和difmup的体系为阳性对照(定义为100％)，只加荧光底物的体系为阴性对照(定义为0％)。鉴于部分化合物本身在358/455nm下产生荧光，为避免化合物自身荧光对实验结果的影响，此处以只加抑制剂及荧光底物的体系作为空白对照。单浓度活性筛选至少独立重复2次，曲线测试至少独立重复3次，每次至少3组重复。具体实验方法如下所示：
[0233] 检测体系阴性对照阳性对照空白对照shp2-wt30μl-30μl-2p-irs110μl 10μl-inhibitors10μl
‑‑
10μldifmup50μl50μl50μl50μlassay buffer050μl10μl40μl
[0234]
(6)实验过程：
①
取适量3.4mg/ml shp2蛋白母液和1mm 2p-irs1母液，加入实验buffer分别稀释至7.8ng/ml和1.2μm，得样品i；
②
向96孔酶标板每孔中加入40μl样品i(阴性对照和空白对照均加40μl实验buffer)，然后加入10μl特定浓度的待测化合物(阳性对照
和阴性对照加10μl实验buffer)，25℃震荡孵育40min；
③
取适量2mm difmup母液，加入实验buffer稀释至0.02mm，得样品ii；
④
向各孔中加入50μl该样品ii，25℃震荡孵育30min；
⑤
测定在激发光355nm、发射光460nm条件下反应体系的荧光强度，按照如下公式计算抑制率，使用graphpad prism 6.0拟合量效曲线计算ic
50
。实施例1～35制备的化合物在10μm浓度下对shp2酶活的抑制率如表1所示：
[0235][0236]
表1.实施例1～35制备的化合物在10μm浓度下对shp2酶活的抑制率
[0237][0238]
表1所示，本发明制备的部分化合物在10μm浓度下对shp2蛋白酶活表现出抑制作用。其中，sduy001、sduy003、sduy004、sduy005、sduy006、sduy009、sduy019、sduy044、sduy045、sduy046、sduy047对shp2酶活的抑制率可达50％以上；sduy003、sduy004、sduy005、sduy006、sduy009、sduy019、sduy044、sduy045、sduy047对shp2酶活的抑制率可达
70％以上，sduy003、sduy005、sduy006、sduy009、sduy019、sduy045对shp2酶活的抑制率可达80％以上。
[0239]
选取10μm浓度下抑制率大于50％的化合物测定其对shp2酶活抑制的ic
50
，如表2所示。其中，sduy003、sduy004、sduy005、sduy006、sduy009、sduy044、sduy045和sduy019对shp2酶活抑制的ic
50
小于10μm；sduy005、sduy006、sduy009和sduy019对shp2酶活抑制的ic
50
小于5μm。
[0240]
表2.部分化合物对shp2酶活抑制作用的ic
50
[0241][0242]
部分实施例制备的化合物对shp2酶活的抑制曲线如图2所示，所示化合物均对shp2表现出浓度依赖性的酶活抑制作用。
[0243]
试验例2：变构抑制剂与shp2相互作用的亲和力测定
[0244]
实验方法：通过creoptix
tm
wave系统，将his-shp2融合蛋白固定于4pcp-nta wave芯片上。样品选用30μm浓度，进样时间25s，实验buffer选用含0.05％吐温-20和5％dmso的1
×
pbs磷酸盐缓冲液，每个化合物至少独立重复实验三次，数据分析采用双扣减和1：1结合模式。结果如表2所示。
[0245]
表2.部分实施例化合物与shp2的亲和力
[0246][0247]
表2表明，本发明制备的实施例化合物与shp2表现出一定的亲和力，这表明实施化合物可以与shp2直接结合；其中，化合物sduy009与sduy019的亲和力最好，kd分别为200nm与740nm。
[0248]
试验例3：变构抑制剂体外抗肿瘤活性
[0249]
取处于对数生长期的细胞，接种于96孔培养板，密度为5000个/孔。种板时最外圈加入pbs，用于保持湿润。设空白对照(没有细胞、不加药物)、加药对照(有细胞、不加药物)及不同浓度的给药组，每组设置六个复孔。接种细胞后的96孔板在37℃和5％co2培养箱培养24h，待细胞贴壁，加入不同浓度的药物(每孔100μl)。药物作用24h后，弃去培养基，避光
加入cck-8染液，培养箱中孵育1h，使用酶标仪测定其在450nm处的吸光度，按照如下公式计算细胞生长抑制率，使用graphpad prism 6.0拟合量效曲线计算ic
50
。。
[0250][0251]
以shp099作为阳性药作对比，shp099的结构式如下：
[0252][0253]
shp099是一种具有高选择性且强效稳定shp2自抑制构象的变构抑制剂。与该变构抑制剂相比，更能体现出本发明化合物具有更好的抗肿瘤活性。
[0254]
抗肿瘤活性实验结果：
[0255]
①
对人肝癌细胞的抗肿瘤活性结果分析：和阳对药shp099相比，化合物sduy001和化合物sduy010在20μm浓度下对人huh7肝癌细胞表现出显著强于shp099的抑瘤活性，其抑制率达到98％(图3a)，且表现出明显的浓度依赖抑制活性(图3b)。同时，化合物sduy044和化合物sdu045在10μm浓度下对人huh7肝癌细胞的抗肿瘤活性也要明显高于shp099(图3b)。此外，化合物sduy001和化合物sduy010对人hepg2的抗增殖活性在10μm及20μm浓度下要明显优于shp099；在10μm浓度下，sduy001对人hepg2的抑制率达到92％，而sduy010对人hepg2的抑制率达到100％，相比于shp099的无抑制作用，其抑瘤效果十分明显。
[0256]
②
对人乳腺癌细胞的抗肿瘤活性结果分析：sduy001、sduy005、sduy009等对人4t1乳腺癌细胞等多种肿瘤细胞系具有明显的抗增殖活性，且具有显著的浓度依赖性。如图4所示，化合物sduy009对4t1乳腺癌细胞的抗增殖活性ic
50
为7.9μm，相比shp099(ic
50
＝35μm)活性提高4倍多。
[0257]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。