一株莓实假单胞菌及其应用

1.本发明涉及生物催化转化领域，具体涉及一株莓实假单胞菌及其在乳糖酸制备中的应用。


背景技术：

2.乳糖酸是由乳糖氧化产生的醛糖酸，由半乳糖通过糖苷键与葡萄糖酸分子相连接，可用于化妆品中的保湿剂、食品行业添加剂、医药行业的药物载体等，具有极广泛的应用领域。目前，乳糖酸的生产主要是通过化学方法从乳糖合成。尽管化学法合成乳糖酸取得了一定的进展，但化学法为能源密集型的合成方法，涉及到的金属催化剂价格昂贵且在反应过程中易因过度氧化而失活，部分催化剂不适合用于食品和制药行业，并且会对环境造成污染，可能会产生多种副产物，导致下游分离过程复杂，限制了乳糖酸的商业发展。生物催化合成乳糖酸反应条件温和、选择性高、工艺简单、绿色环保。已经有多种细菌和真菌被确定能够用于乳糖酸生产，但目前乳糖酸的生物法生产过程还存在一定缺陷，尤其是生产强度需进一步提高以降低生物法生产成本。
3.乳清是奶制品生产中产生的副产品，每生产一公斤的奶酪就会产生九公斤的乳清。随着人们对乳类产品需求的增加，乳清的产量也随之增加。因为乳清含有较高的生物需氧量(bod)和化学需氧量(cod)，无论是直接排放还是混合稀释后排放，都会对环境会造成污染。乳清粉作为工业废弃物，价格低廉，可用来生产高价值产品。乳清粉中70％的成分为乳糖，可作为底物用于乳糖酸生产。但以乳清或乳清粉为底物时，会影响菌体对乳糖的氧化能力，导致乳糖酸生产强度降低。
4.目前还没有利用莓实假单胞菌生物高强度催化生产乳糖酸的报道。


技术实现要素：

5.发明目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一株莓实假单胞菌。
6.本发明还要解决的技术问题在于提供上述莓实假单胞菌生物催化合成乳糖酸的方法，以提高乳糖酸的产量、得率和产率。
7.为实现上述目的，本发明提供了一株莓实假单胞菌，其分类命名为莓实假单胞菌nl20w(pseudomonas fragi nl20w)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年03月17日，保藏编号为cctcc no:m 2021245。
8.上述莓实假单胞菌及以莓实假单胞菌为出发菌制备得到的重组莓实假单胞菌在制备乳糖酸中的应用也在本发明的保护范围内。
9.其中，在应用时，以莓实假单胞菌的休止细胞或生长细胞为催化剂生产乳糖酸。
10.具体地，当以休止细胞为催化剂时，制备乳糖酸的步骤如下：以活化培养基培养活化莓实假单胞菌，离心收集菌体细胞，将菌体细胞用生理盐水洗涤菌体若干次并收集，然后将菌体细胞与乳糖或乳清粉溶液混合，在25～40℃、50～800r/min的条件下反应，乳糖浓度或乳清粉溶液中的乳糖浓度为50～300g/l；所述菌体细胞在溶液中的最终od为5～20。
11.所述的乳糖或乳清粉溶液为将乳糖或乳清粉固体溶解在磷酸盐缓冲溶液中，磷酸盐缓冲液浓度为50～200mm、ph为5.5～7.5；所述溶液中还含有碳酸钙7～45g/l，氯化镁或氯化铁或氯化钙0.1～2.0mm。
12.优选地，所述的磷酸盐缓冲液ph优选6.0～6.5，催化温度优选30～35℃，金属离子优选mg
2+
，氯化镁浓度优选0.5～1.0mm。
13.当以莓实假单胞菌的生长细胞为催化时，制备乳糖酸的步骤如下：以活化培养基培养活化莓实假单胞菌，离心收集菌体细胞，将菌体细胞用生理盐水洗涤菌体若干次并收集；将得到的菌体细胞转接至催化培养基中，使得菌体细胞在催化培养基中的od为0.5～1.0，当细胞接入6～8小时后，向催化培养基中添加固体乳糖或乳清粉，使其浓度为100～500g/l；所述催化反应在发酵罐中进行，温度为25～40℃、搅拌速率为300～350r/min，通气量0.8～1.5vvm，通入气体为空气，并添加消泡剂防止泡沫产生；以25％(w/v)的氢氧化钠溶液控制发酵罐的ph为5.5～7.5。所述温度优选为30～35℃，所述ph优选为6.0～6.5。
14.其中，所述的催化培养基组分按照g/l计为：甘油4～10、酵母粉4～6、na2hpo
4 3.0～4.0、kh2po
4 1.2～1.8、nacl 0.2～0.3、nh4cl 0.4～0.6、mgso
4 0.2～0.3，其中含微量元素溶液200～300μl/l。
15.其中，以活化培养基培养活化莓实假单胞菌的条件为：培养温度为25～40℃，培养方式为旋转式摇床培养，转速为50～300r/min，培养时间为8～14h。所述的菌体培养温度优选30～35℃；所述的培养时间优选10～12h。
16.具体地，所述活化培养基每l含有如下组分：甘油2～10g、酵母粉2～6g、na2hpo
4 3.0～4.0g、kh2po
4 1.2～1.8g、nacl 0.2～0.3g、nh4cl 0.4～0.6g、mgso
4 0.2～0.3g，同时含微量元素溶液200～300μl/l。
17.其中，上述微量元素溶液的配方按mg/l计为：hbo
3 2500～3500，zncl
2 400～600，mncl2·
4h2o 250～350，cocl
2 1800～2200，cucl2·
2h2o 80～120，nicl2·
6h2o 180～220，namoo4·
2h2o 250～350。
18.有益效果：与现有技术相比，本发明的优势在于：
19.(1)本发明提供的菌株不需要成本昂贵的培养基，以甘油为碳源的培养效果优于以昂贵的lb培养基的培养效果。
20.(2)以本发明提供的菌株，在本发明给出的条件下，可将300g/l乳糖或500g/l乳清粉中所含的乳糖全部转化为乳糖酸，其生产能力优于现有生物法乳糖酸生产水平。
21.(3)本发明所述的生物催化方法，不需要昂贵的辅因子，无副产物，过程简单可控，具有很好的实用性，易于工业化。
附图说明
22.图1为菌株照片；
23.图2为实施例3中，以休止细胞为催化剂，催化乳糖制备乳糖酸生产过程曲线。
具体实施方式
24.下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
25.下述实施例中，所述的乳糖酸得率按如下公式计算：
26.乳糖酸得率(％)＝反应所得乳糖酸浓度(mm)*100/初始乳糖浓度(mm)
27.乳糖酸生产速率(g/l/h)＝乳糖酸浓度(g/l)/反应时间(h)
28.实施例1莓实假单胞菌的筛选和保存。
29.从紫金山多处不同生境中采集土样，1g混合土样与9ml无菌生理盐水混合均匀后，取500微升接种至50ml lb培养基中，在30℃、200r/min条件下培养12小时。将培养液以10-8
、10-9
、10-10
三个稀释度涂布在固体筛选培养基上，培养基为含有50g/l乳糖和25g/l轻质碳酸钙的固体lb培养基，30℃培养直至出现微生物菌落。依据菌落周围透明圈的大小，挑取数量足够多的透明圈大的单菌落，所述菌株照片如图1所示，接种至50ml液体筛选培养基中，培养基为含有50g/l乳糖和25g/l碳酸钙的液体lb培养基，培养时间为12小时，中间每隔2小时取样测定乳糖酸产量。挑选其中乳糖酸产量和产率都最优的菌株保存备用。
30.通过将其16s rdna序列与ncbi数据库中其他菌株的序列比对可知，该菌株最接近莓实假单胞菌(pseudomonas fragi)，与数据库中多株莓实假单胞菌16s rdna序列的相似度大于99％，系统发育树也表明该菌株与其他莓实假单胞菌处于同一进化分支。该菌株分类命名为莓实假单胞菌(pseudomonas fragi)nl20w，该菌已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年03月17日，保藏编号为cctcc no:m 2021245。其16s rdna序列如下：
31.gaactgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggtagagagaagcttgcttctcttgagagcggcggacgggtgagtaatacctaggaatctgcctgatagtgggggataacgttcggaaacggacgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagcaggggaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggctacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcattaacctaatacgttggtgtcttgacgttaccgacagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggtttgttaagttgaatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatccaaaactggcaagctagagtatggtagagggtagtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgactacctggactgatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcaactagccgttgggagtcttgaactcttagtggcgcagctaacgcattaagttgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggccttgacatccaatgaactttccagagatggattggtgccttcgggaacattgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacgtaatggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggcctgggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaagggttgccaagccgcgaggtggagctaatcccataaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgtgaatcagaatgtcacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaccagaagtagctagtctaaccttcgggaggacggttaccacggtgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtaggggaacctgcggctggatcacctcctta。
32.实施例2以休止细胞为催化剂，催化乳糖制备乳糖酸。
33.以甘油为碳源配置活化培养基，在30℃条件下，置于摇床上以200r/min的转速培
养莓实假单胞菌12h。离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体细胞3次并收集。收集的菌体细胞与含有乳糖的磷酸盐缓冲液(200mm，ph 6.0)混合，混合物中乳糖浓度为243g/l，细胞od为20，此外，向混合物中添加碳酸钙35g/l、氯化镁0.5mm，于30℃、200r/min条件下反应，间隔取样检测乳糖和乳糖酸的含量，在第40h，乳糖全部氧化为乳糖酸，乳糖酸得率为100％，乳糖酸生产速率为6.38g/l/h。
34.上述活化培养基配方为(g/l)：甘油5、酵母粉5、na2hpo
4 3.4、kh2po
4 1.5、nacl 0.25、nh4cl 0.5、mgso
4 0.24，微量元素溶液250μl/l。其中，微量元素溶液配方是(mg/l)：hbo
3 3000，zncl
2 500，mncl2·
4h2o 300，cocl
2 2000，cucl2·
2h2o 100，nicl2·
6h2o 200，namoo4·
2h2o 300。
35.实施例3以休止细胞为催化剂，催化乳糖制备乳糖酸。
36.以甘油为碳源配置活化培养基，在30℃条件下，置于摇床上以250r/min的转速培养莓实假单胞菌10h。离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体细胞3次并收集。收集的菌体细胞与含有乳糖的磷酸盐缓冲液(200mm，ph 6.0)混合，混合物中乳糖浓度为298g/l，细胞od为20，此外，向混合物中添加碳酸钙43g/l、氯化镁0.5mm，于30℃、200r/min条件下反应，间隔取样检测乳糖和乳糖酸的含量，在第50h，乳糖全部氧化为乳糖酸，乳糖酸得率为100％，乳糖酸生产速率为6.25g/l/h。
37.上述活化培养基配方与实施例2相同。
38.实施例4以休止细胞为催化剂，催化乳糖制备乳糖酸。
39.以甘油为碳源配置活化培养基，在30℃条件下，置于摇床上以200r/min的转速培养莓实假单胞菌12h。离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体细胞3次并收集。收集的菌体细胞与含有乳糖的磷酸盐缓冲液(200mm，ph 7.0)混合，混合物中乳糖浓度为50g/l，细胞od为5，此外，向混合物中添加碳酸钙7.3g/l、氯化镁1mm，于30℃、200r/min条件下反应，间隔取样检测乳糖和乳糖酸的含量，在第12h时，乳糖酸得率为70.5％，在第36h时，乳糖酸得率为87.9％。
40.上述活化培养基配方与实施例2相同。
41.实施例5以休止细胞为催化剂，催化乳糖制备乳糖酸。
42.实施方案与实施例4相同，但是将催化体系中的氯化镁替换为相同浓度的氯化钙。在第12h时，乳糖酸得率为43.6％，在第36h时，乳糖酸得率为80.5％。
43.实施例6：以休止细胞为催化剂，催化乳糖制备乳糖酸。
44.实施方案与实施例4相同，但是将催化体系中的氯化镁替换为相同浓度的氯化铁。在第12h时，乳糖酸得率为46.2％，在第36h时，乳糖酸得率为82.9％。
45.实施例7：以生长细胞为催化剂，催化乳清粉制备乳糖酸。
46.以甘油为碳源配置活化培养基，在30℃条件下，置于摇床上以200r/min的转速培养莓实假单胞菌12h。离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体细胞3次并收集。收集的菌体细胞转接至催化培养基中，使得菌体细胞在催化培养基中的od为1。当细胞接入8小时后，向催化培养基中添加固体乳清粉，其浓度为285g/l，此时乳糖浓度为210g/l。催化反应在3l发酵罐中进行，温度为30℃、搅拌速率为350r/min，通气量1vvm，通入气体为空气，并添加消泡剂防止泡沫产生。以25％(w/v)的氢氧化钠溶液控制发酵罐的ph为6.0。间隔取样检测乳糖和乳糖酸的含量。在添加乳清粉后的第70h，乳糖全部氧化为乳糖酸，乳糖酸得率为100％。
47.上述活化培养基配方与实施例2相同。
48.上述催化培养基配方为(g/l)：甘油5、酵母粉5、na2hpo
4 3.4、kh2po
4 1.5、nacl 0.25、nh4cl 0.5、mgso
4 0.24，微量元素溶液250μl/l。其中，微量元素溶液配方是(mg/l)：hbo
3 3000，zncl
2 500，mncl2·
4h2o 300，cocl
2 2000，cucl2·
2h2o 100，nicl2·
6h2o 200，namoo4·
2h2o 300。
49.实施例8：以生长细胞为催化剂，催化乳清粉制备乳糖酸。
50.以甘油为碳源配置活化培养基，在30℃条件下，置于摇床上以200r/min的转速培养莓实假单胞菌12h。离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体细胞3次并收集。收集的菌体细胞转接至催化培养基中，使得菌体细胞在催化培养基中的od为1。当细胞接入6小时后，向催化培养基中添加固体乳清粉，其浓度为380g/l，此时乳糖浓度为280g/l。催化反应在3l发酵罐中进行，催化条件与实施例7相同。间隔取样检测乳糖和乳糖酸的含量。在添加乳清粉后的第96h，乳糖全部氧化为乳糖酸，乳糖酸得率为100％。
51.上述活化培养基和催化培养基配方与实施例7相同。
52.对比例1：以休止细胞为催化剂，催化乳糖制备乳糖酸。
53.实施方案与实施例4相同，但是催化体系中不添加金属氯化物。在第12h时，乳糖酸得率为38.0％，在第36h时，乳糖酸得率为74.2％。该对比例中的乳糖酸得率明显低于实施例4、5、6。
54.上述活化培养基配方与实施例2相同。
55.对比例2：以休止细胞为催化剂，催化乳糖制备乳糖酸。
56.以lb培养基为活化培养基培养莓实假单胞菌，其余实施方案与对比例1相同。在第36h时，乳糖酸得率为69.4％。该对比例中的乳糖酸得率明显低于对比例1。
57.上述lb培养基配方为(g/l)：酵母粉5、胰蛋白胨10、氯化钠10。
58.对比例3：以休止细胞为催化剂，催化乳糖制备乳糖酸。
59.以葡萄糖为碳源配置活化培养基培养莓实假单胞菌，其余实施方案与对比例1相同。在第36h时，乳糖酸得率为62.4％。该对比例中的乳糖酸得率明显低于对比例1。
60.上述活化培养基配方为(g/l)：葡萄糖5、酵母粉5、na2hpo
4 3.4、kh2po
4 1.5、nacl 0.25、nh4cl 0.5、mgso
4 0.24，微量元素溶液250μl/l。其中，微量元素溶液配方是(mg/l)：hbo
3 3000，zncl
2 500，mncl2·
4h2o 300，cocl
2 2000，cucl2·
2h2o 100，nicl2·
6h2o 200，namoo4·
2h2o 300。
61.对比例4：以生长细胞为催化剂，催化乳清粉制备乳糖酸。
62.以甘油为碳源配置活化培养基，在30℃条件下，置于摇床上以200r/min的转速培养莓实假单胞菌12h。离心收集菌体细胞，用生理盐水洗涤菌体细胞3次并收集。收集的菌体细胞转接至催化培养基中，使得菌体细胞在催化培养基中的od为1。当细胞接入时，同时向催化培养基中添加固体乳清粉，其浓度为265g/l，此时乳糖浓度为193g/l。催化反应在3l发酵罐中进行，催化条件与实施例7相同。间隔取样检测乳糖和乳糖酸的含量。在添加乳清粉后的第87h，乳糖酸得率为77％。
63.上述活化培养基和催化培养基配方与实施例7相同。
64.本发明提供了一种利用莓实假单胞菌用于制备乳糖酸的应用，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的
普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。