MMP2基因多态性作为猪产仔数性状的遗传标记及应用

mmp2基因多态性作为猪产仔数性状的遗传标记及应用
技术领域
1.本发明属于猪遗传标记筛选领域，具体涉及具体涉及mmp2基因多态性作为猪产仔数性状的遗传标记及应用。所述遗传标记从猪mmp2基因内含子13上克隆得到，本发明还包括猪mmp2基因突变位点的检测方法与关联分析。


背景技术：

2.猪产仔数性状是母猪繁殖性状的重要指标之一，产仔数的高低决定着养殖者所能获得的生产效益。因此，在各国的猪育种工作中，提高母猪的产仔数成了一个非常重要的育种目标。母猪的产仔数是一种低遗传力性状，环境因素对其影响较大。使用传统的育种方法取得的遗传进展较慢，但是随着分子遗传标记方法的出现，这一难题得到了一定解决，目前分子遗传标记已经普遍应用到动物的育种工作中，且取得了不错的成绩。
3.基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,mmp2)是基质金属蛋白酶家族中的成员，基质金属蛋白酶(mmps)是一类ca
2+
、zn
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依赖性的并且能够降解细胞外基质(extracellular matrix,ecm)的蛋白水解酶。1962年，首次报道了胶原酶(gross j et al.collagenolytic activity in amphibian tissues:a tissue culture assay.proceedings of the national academy of sciences of the united states of america,1962,48:1014)。发展至今，mmps家族已经鉴定出二十多个成员，分别命名为mmp-1、mmp-2、mmp-3等，按照其底物特异性主要将其分为6类：胶原酶；明胶酶；基质溶解酶；跨膜型基质金属蛋白酶或者膜型基质金属蛋白酶，以及一些未被归类的基质金属蛋白酶。基质金属蛋白酶是降解ecm的蛋白酶水解系统，而ecm周期性的降解和重塑对卵泡的成熟、排卵以及黄体的生成和退化具有重要作用，因此推断mmps与卵泡的发育成熟相关。在大鼠卵巢中，mmp2的mrna定位于发育中的卵泡膜和基质上，在卵巢经过hcg刺激后，mmp2的mrna水平增加(curry et al.cellular localization of gelatinases and tissue inhibitors of metalloproteinases during follicular growth,ovulation,and early luteal formation in the rat.biology of reproduction,2001,65:855-865)；有研究发现，mmp2在人卵巢颗粒细胞中高表达；mmp2和mmp9主要作用是降解iv型胶原，在胚胎植入过程中也发挥着重要的作用。国内外关于mmp2多态性的报道有很多，比如mmp2基因启动子区存在三个snps位点与子宫内膜异位相关(saare et al.polymorphisms in mmp-2and mmp-9promoter regions are associated with endometriosis.fertility&sterility,2010,94:1560-1563)。mmp2基因内含子1上存在一个foki多态位点，在研究中国瘦肉猪新品系div猪群体时发现，该位点的多态性对经产div系猪的产仔数和产活仔数都有影响，其中在经产母猪产仔数上bb基因型》ab基因型》aa基因型(牛步月，猪繁殖性状十个候选基因的分离鉴定、遗传效应分析及功能初探.华中农业大学图书馆,2007.)。上述研究说明，mmp2基因与母猪繁殖性状有关。所以本发明通过关联分析，鉴定snp分子标记与母猪产仔数性状的相关性，从而为进一步研究功能候选基因与猪产仔数的遗传改良奠定基础。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于获得一种与猪产仔数性状关联的遗传标记，根据测序结果，寻找mmp2基因的突变位点，检测mmp2基因的多态性，为猪的标记辅助选择提供一种新的遗传标记，基因分型和选择方法。
5.本发明的技术方案如下所述：
6.本发明获得了一种猪产仔数性状的遗传标记，它是基于大白猪和太湖猪排卵前卵泡组织rna测序的结果，在测序结果里发现mmp2基因上存在多态位点，其中在第13内含子(这个第13内含子是针对mmp2基因的全序列而言，在mmp2基因的全序列的第13内含子上，申请人设计引物扩增第13内含子部分片段测序，获得该基因839bp片段)上的一个a/t等位基因突变，该突变可以导致pcr-bgiii-rflp多态性。
7.具体地，本发明提供了一种与猪产仔数性状相关的snp遗传标记，它的核苷酸序列如seq id no:1所述，在该序列的425位碱基处存在一个等位基因碱基突变a(这里碱基a指代大白猪个体1突变后的碱基)，或它的核苷酸序列如seq id no:2所述，在该序列的425位碱基处存在一个等位基因碱基突变t(这里碱基t指代大白猪个体2突变后的碱基)，所述突变引起bgiii酶切位点多态性。
8.一种与猪产仔数性状相关的snp遗传标记，所述猪品种为大白猪，所述snp遗传标记的核苷酸序列如下所示：
9.tggtcccttcccacaacaagcccacctctcatgccagggtctggaatggtcagcctgctctacagaggaggctctgggagtcttccctcaaagcagcagaactgaggaagttcccattgtggcccagtggaaacgaatctaactagtatccatgaagatgcatgttcgatccccagccttgttcagtgggtcaaggatccggcattgccatgagctatggtggaggtcacagatgcagctccgattctgcgttgctgtggctgtgatgtaggctggcagctgcagctccgatttgattcctagcctgggatcttccatatgccacaagtgtggccctaaaatgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaggcagcaaaacggaaacatctattgaaggctctgggtgggtttccagaggagacr((a/t))
10.gatctttttcccaggggaggtggtgaatgagctgaagccattggtcccactgtagagtcggcaaaggcccgggcctccttgctggagaaggaaagccccagaacaatgcaggataagcagctgcttccagcaaaagcaacccctagctcatgccaggatgtgcttagcctttgcttctggaagcttccattaagcccacaaaaatacatgcaatacctcttgtgtgccaggcacttatctaggtgctgcaagacaatggtaaaaacacagtcactctcaagagtttccactgtgtcacactggattaagaatctgactgcagcagcaagggtcgctatggaggtgcaggttcaatccctagcccagcgcagtgagttcagggattcacctttgctgtatcggcagtgtaggttg，
11.上述序列中第425碱基位的r是a或t，该突变引起bgiii酶切位点多态性。
12.本发明提供了一种检测猪mmp2基因分型的标记引物，所述猪品种为大白猪，所述性状为活产仔数和死胎数性状，其特征在于，所述引物的dna序列如seq id no:3和seq id no:4所示；其中：
13.tt基因型的头胎产活仔数显著高于ta基因型；aa基因型的经产死胎数显著高于ta基因型；aa基因型的总胎次死胎数极显著高于ta基因型；aa基因型的总胎次产活仔数显著高于ta基因型，ta基因型是减少死胎数有益基因型。
14.本发明提供了一种筛选与猪产仔数性状相关的snp遗传标记的方法，其特征在于，所述猪品种为大白猪，所述筛选方法包括如下步骤：
15.从大白猪血液或毛发中提取基因组dna，登录ensembl数据库下载mmp2基因序列，
8为序列表seq id no：3和seq id no：4所示引物在大白猪种中的扩增片段，片段大小为839bp，在图3显示的是大白猪个体1扩增片段中的425bp处存在一个突变位点a(以r代表)；在大白猪个体2中扩增片段中的425bp处存在另一个突变位点t(以r代表)，导致pcr-bgiii-rflp多态性。
25.图4：是猪mmp2基因片段bgiii-rflp检测结果的琼脂糖凝胶电泳图谱。附图标记说明：琼脂糖凝胶浓度为2.0％；图4中的泳道说明：m泳道为dna marker dl2,000；泳道1、7、8为ta基因型，片段大小分别为839bp，425bp，414bp；泳道2、3、4、5为aa基因型，片段大小分别为425bp，414bp；泳道6、9为tt基因型，片段大小为839bp。
26.根据本发明的方法可以用于开发成诊断方法或试剂盒，从而在育种计划中利用这些方法来选择携带有利等位基因的猪，从而可以达到较好的选择效果。
具体实施方式
27.对序列表序列的说明
28.序列表seq id no：1：是扩增的国外血缘猪品种“大白猪”个体1的核苷酸序列。在该序列的第425位碱基处存在一个等位基因突变，即，由碱基a突变为碱基t。
29.序列表seq id no：2：是扩增的国外血缘猪品种“大白猪”个体2的核苷酸序列。在该序列的第425位碱基处存在一个等位基因突变，即，由碱基t突变为碱基a。
30.序列表seq id no：3：是实施大白猪mmp2基因内含子13上a/t变异的bgiii-rflp(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的正向引物。
31.序列表seq id no：4：是实施大白猪mmp2基因内含子13上a/t变异的bgiii-rflp(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的反向引物。
32.实施例1：猪mmp2基因片段的获得及多态性检测方法的建立
33.登录ensembl数据库中下载猪mmp2基因序列(登录号为enssscg00000002829)，在序列中找出所筛选的snp位点，利用primer premier 5软件设计引物。正向引物序列如序列表seq id no：3所示，即，mmp2-bgiii-f：tggtcccttcccacaaca，反向引物序列如序列表seq id no：4所示，即，mmp2-bgiii-r：caacctacactgccgataca，扩增得到一个839bp的目的片段(序列如seq id no:1和seq id no:2所述，电泳结果如图3所示)。pcr反应体系为25μl，其中模板dna1μl，正、反向游引物各0.5μl，pcr mix 12.5μl，最后再加10.5μl去离子水至总体积25μl。pcr反应程序：94℃预变性5min；然后94℃变性40s、60℃退火30s、72℃延伸60s，共36个循环；最后72℃延伸10min。
34.上述扩增片段大小为839bp，而snp位点是位于该片段的425bp处的一个等位基因突变，即，a/t突变(如图1中的r，其核苷酸序列如序列表seq id no：1或seq id no：2所述)，该突变引起了bgiii酶切位点(a
↓
gatct)多态性。
35.本实施例是基于大白猪个体1和大白猪个体2的扩增得到如下所述的核苷酸序列：
36.(1)大白猪个体1
37.tggtcccttcccacaacaagcccacctctcatgccagggtctggaatggtcagcctgctctacagaggaggctctgggagtcttccctcaaagcagcagaactgaggaagttcccattgtggcccagtggaaacgaatctaactagtatccatgaagatgcatgttcgatccccagccttgttcagtgggtcaaggatccggcattgccatgagctatggtggaggtcacagatgcagctccgattctgcgttgctgtggctgtgatgtaggctggcagctgcagctccgatttga
ttcctagcctgggatcttccatatgccacaagtgtggccctaaaatgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaggcagcaaaacggaaacatctattgaaggctctgggtgggtttccagaggagacrgatctttttcccaggggaggtggtgaatgagctgaagccattggtcccactgtagagtcggcaaaggcccgggcctccttgctggagaaggaaagccccagaacaatgcaggataagcagctgcttccagcaaaagcaacccctagctcatgccaggatgtgcttagcctttgcttctggaagcttccattaagcccacaaaaatacatgcaatacctcttgtgtgccaggcacttatctaggtgctgcaagacaatggtaaaaacacagtcactctcaagagtttccactgtgtcacactggattaagaatctgactgcagcagcaagggtcgctatggaggtgcaggttcaatccctagcccagcgcagtgagttcagggattcacctttgctgtatcggcagtgtaggttg(序列425位的r即突变位点为等位基因突变，即由碱基t突变为碱基a)；
38.以及
39.(2)大白猪个体2
40.tggtcccttcccacaacaagcccacctctcatgccagggtctggaatggtcagcctgctctacagaggaggctctgggagtcttccctcaaagcagcagaactgaggaagttcccattgtggcccagtggaaacgaatctaactagtatccatgaagatgcatgttcgatccccagccttgttcagtgggtcaaggatccggcattgccatgagctatggtggaggtcacagatgcagctccgattctgcgttgctgtggctgtgatgtaggctggcagctgcagctccgatttgattcctagcctgggatcttccatatgccacaagtgtggccctaaaatgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaggcagcaaaacggaaacatctattgaaggctctgggtgggtttccagaggagacrgatctttttcccaggggaggtggtgaatgagctgaagccattggtcccactgtagagtcggcaaaggcccgggcctccttgctggagaaggaaagccccagaacaatgcaggataagcagctgcttccagcaaaagcaacccctagctcatgccaggatgtgcttagcctttgcttctggaagcttccattaagcccacaaaaatacatgcaatacctcttgtgtgccaggcacttatctaggtgctgcaagacaatggtaaaaacacagtcactctcaagagtttccactgtgtcacactggattaagaatctgactgcagcagcaagggtcgctatggaggtgcaggttcaatccctagcccagcgcagtgagttcagggattcacctttgctgtatcggcagtgtaggttg(序列第425位的r为等位基因突变，即由碱基a突变为碱基t)；
41.pcr扩增后，对获得的目的片段进行bgiii-rflp酶切分型。具体步骤为：取6μl pcr产物加入0.4μl限制性内切酶和1μl 10
×
buffer，再加入2.6μl的去离子水构成10μl的酶切体系，37℃酶切12h，酶切产物用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，记录酶切结果(如图4所示)，扩增片段大小为839bp。当425bp位点的碱基为a时，会有一个bgiii酶切位点产生，酶切得到两条片段，长度分别为425bp和414bp(a等位基因)；当此位点为t碱基时，不存在bgiii酶切位点，酶切得到长度为839bp的一个片段(t等位基因)。
42.实施例2：本发明筛选的遗传标记在不同猪群中的多态性分布
43.猪基因组dna的提取(样本如表1所示)方法参照熊远著，《猪生化及分子遗传实验导论》，中国农业出版社，1999，报道的方法进行。
44.在大白猪群体中检测猪mmp2基因pcr-bgiii-rflp多态性，检测结果如表1所示。
45.表1猪mmp2基因pcr-taqi-rflp在不同猪种中的分布结果
46.47.注：表1所述群体材料均为中国公开养殖的猪品种。
48.结果表明：在大白猪中存在3种基因型。其中：在大白猪群体中，a等位基因频率为0.81，所以a基因是优势等位基因(见表1)。
49.实施例3：利用本发明筛选的遗传标记对猪产仔数性状进行关联分析
50.为了确定猪mmp2基因pcr-bgiii-rflp多态性与猪产仔数是否相关，采用sas统计软件(sas institute inc,version 9.4)glm程序进行单标记方差分析，同时采用reg程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验，采用模型为：
51.y
ij
＝μ+gi+fj+e
ij
52.y
ij
为性状表型值，μ为平均值，gi为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用1，0和-1分别代表tt、ta和aa基因型，显性效应用1，-1和1分别代表tt、ta和aa基因型)；fj为猪场综合效应；e
ij
为残差效应。
53.在大白猪中进行不同基因型与产仔数性状的关联分析，统计分析结果见表2。
54.表2猪mmp2基因pcr-bgiii-rflp基因型与大白猪产仔数性状的统计分析表
[0055][0056][0057]
注：表2中数值为最小二乘均值标准误；小写字母表示差异显著，大写字母表示差异极显著；加性效应正值表示a等位基因增加性状表型值。
[0058]
*表示p＜0.05。
[0059]
由表2中可以看出，在大白猪中，tt基因型的头胎产活仔数显著高于ta基因型(p《
0.05)；aa基因型的经产死胎数显著高于ta基因型(p《0.05)；aa基因型的总胎次死胎数极显著高于ta基因型(p《0.01)；aa基因型的总胎次产活仔数显著高于ta基因型(p《0.05)。
[0060]
本发明鉴定了大白猪群体中mmp2基因的snp多态性并分析其与总产仔数、活产仔数、木乃伊数、死胎数性状的相关性。在大白猪群体中，该snp位点与活产仔数和死胎数性状呈显著相关，ta基因型可能是于减少死胎数有益的基因型，提示该特异性核苷酸序列425位的snp位点可以作为猪产仔数性状的候选标记位点。在实际对母猪选育的工作过程中，可根据母猪携带的基因型是否为ta基因型，而判断出该个体与其他个体相比期望有更低的死胎数。因此，本发明可用于指导母猪的早期筛选的辅助选择，从而可以降低生猪养殖的生产成本，增加经济效益。