含有吗啉丙基的[(喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺类化合物及其制备与应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种含有吗啉丙基的[(喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺类化合物及其制备与应用，具体作为抗流感病毒药物应用。


背景技术：

[0002]
流感是由流感病毒引起的具有传染性的疾病。流感病毒属于正黏病毒科(orthomyxoviridae family)流感病毒属。根据流感病毒核蛋白(nucleoprotein,np)的抗原性不同，可将其分为a、b、c(也称甲、乙、丙)三种类型。其中，a型是历次流感病毒的最主要元凶，而且宿主范围广泛，在人、家禽、猪、马体内都能够分离到，b型和c型主要感染人类。
[0003]
目前，流感疫苗和抗流感药物是临床上最为有效的预防和治疗流感的有效手段。但是，流感疫苗存在缺陷性：(1)流感病毒变异速度快，需要每年接种疫苗才能产生有效的保护；(2)疫苗预防的有效性是建立在疫苗的病毒株与正在流行的流感病毒株一致的基础上的；(3)疫苗的接种人群受限。因此，抗流感药物仍是治疗流感病毒感染的首要选择。已经上市的抗流感药物主要有三类(m2蛋白抑制剂：金刚烷胺(amantadine)、金刚乙胺(rimantidine)；神经氨酸酶(neuraminidase,na)抑制剂：扎那米韦(zanamivir)、奥司他韦(oselmitevir)、帕拉米韦(peramivir)；rna聚合酶抑制剂：法匹拉韦(favipiravir)等)，但这些药物的耐药性病毒株所占的比例呈上升趋势(deyde v,xu x,bright r,et al.surveillance of resistance to adamantanes among influenza a(h3n2)and a(h1n1)viruses isolated worldwide.journal of infectious diseases,2007,196(2):249-257；poland g,jacobson r,ovsyannikova i.influenza virus resistance to antiviral agents:a plea for rational use.clinical infectious diseases an official publication of the infectious diseases society of america,2009,48(9):1254-1256.)因此，研制新型抗流感病毒药物迫在眉睫。
[0004]
2006年，流感病毒核蛋白的晶体结构被成功解析。核蛋白作为病毒主要的结构蛋白，参与病毒复制的多个过程，是进行转录以及病毒基因组复制的流感核糖核蛋白(ribonucleoprotein,rnp)复合物的主要组分(hagiwara k,kondoh y,ueda a,et al.discovery of novel antiviral agents directed against the influenza a virus nucleoprotein using photo-cross-linked chemical arrays.biochemical and biophysical research communications,2010,394(3):721-727.)。在目前处于流感病毒感染临床前和临床发展阶段的各种化合物中，流感病毒核蛋白抑制剂的研究具有明显的优势。首先，流感病毒核蛋白抑制剂具有强大的抗病毒功效和广谱抗病毒活性；其次，作为一种病毒蛋白，流感病毒核蛋白没有宿主细胞对应物，表明流感病毒核蛋白抑制剂具有很高的选择性；此外，流感病毒核蛋白在不同物种的a型流感病毒株中高度保守，这意味着流感病毒不容易对流感病毒核蛋白抑制剂产生耐药性。因此，靶向流感病毒核蛋白的流感病毒抑制剂的发现对流感的治疗具有重要理论意义和应用前景。
[0005]
位于核蛋白尾环结合口袋区域的glu339
…
arg416盐桥是形成核蛋白三聚体的重要组分(shen y f,chen y h,chu s y,et al.e339...r416 salt bridge of nucleoprotein as a feasible target for influenza virus inhibitors.proceedings of the national academy of sciences of the united states of america,2011,108(40):16515-16520.)。两个核蛋白单体之间的glu339
…
arg416盐桥是高度保守的，当核蛋白单体之间的glu339
…
arg416盐桥发生突变时，将抑制病毒的复制。2-[(3,4-二氯苯基)氨基]-n-[3-(吗啉-4-基)丙基]噻唑-4-甲酰胺是文献报道(shen y f,chen y h,chu s y,et al.e339...r416 salt bridge of nucleoprotein as a feasible target for influenza virus inhibitors.proceedings of the national academy of sciences of the united states of america,2011,108(40):16515-16520.)的靶向流感病毒核蛋白尾环区域结合口袋活性位点的化合物(对流感病毒株a/wsn/33(h1n1)的ec
50
值为2.7μm)，通过阻断glu339
…
arg416盐桥的形成，抑制病毒的复制。n-[3-(吗啉-4-基)丙基]基团在化合物发挥抗流感病毒活性和与流感病毒核蛋白的结合中起到了关键作用。含有吗啉丙基基团的化合物可以显著提高目标化合物的水溶性。因此，我们以2-[(3,4-二氯苯基)氨基]-n-[3-(吗啉-4-基)丙基]噻唑-4-甲酰胺为先导化合物，运用药物设计中常用的生物电子等排原理、拼合原理和结构修饰策略，设计了8个含有吗啉丙基的[(喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺类化合物。化合物2-[(3,4-二氯苯基)氨基]-n-[3-(吗啉-4-基)丙基]噻唑-4-甲酰胺与核蛋白(pdb id:2iqh)的结合模式图如图1所示，本发明的目标化合物n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(7-三氟甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺与核蛋白(pdb id:2iqh)的结合模式图如图2所示。
[0006]
对2-[(3,4-二氯苯基)氨基]-n-[3-(吗啉-4-基)丙基]噻唑-4-甲酰胺和目标化合物n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(7-三氟甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺与核蛋白(pdb id:2iqh)(ye q,krug rm,tao y j.the mechanism by which influenza a virus nucleoprotein forms oligomers and binds rna.nature,2006,444(7122):1078-1082.)的结合模式进行预测(图1)。2-[(3,4-二氯苯基)氨基]-n-[3-(吗啉-4-基)丙基]噻唑-4-甲酰胺与核蛋白的对接结果显示，两个氨基(-nh)均与glu339形成氢键相互作用(和)。n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(7-三氟甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺与核蛋白的对接结果(图1)显示，与喹啉环4位连接的氨基(-nh)和苯甲酰胺中的氨基(-nh)均与glu339产生氢键相互作用(和)。n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(7-三氟甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺中苯甲酰基中的氧原子均与thr390形成氢键相互作用，其距离为n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(7-三氟甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺中喹啉环上的苯环与phe458形成π-π堆积作用。由分子对接结果可知，n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(7-三氟甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺和2-[(3,4-二氯苯基)氨基]-n-[3-(吗啉-4-基)丙基]噻唑-4-甲酰胺，均可与glu339形成氢键相互作用。由分子对接结果，猜测含有吗啉丙基的[(喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺类化合物均可与glu339形成氢键相互作用，阻断glu339
…
arg416盐桥的形成，抑制病毒的复制。
[0007]
综上所述，研究靶向流感病毒核蛋白的抑制剂具有潜在的优势。含有吗啉丙基的[(喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺类化合物作为流感病毒抑制剂的发现对流感病毒抑制剂分子
库的扩充和新型流感病毒抑制剂的研究具有重要意义。


技术实现要素：

[0008]
本发明所解决的技术问题是，提供一种含有吗啉丙基的[(喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺类化合物及其制备与应用，具体为如式ⅰ所示的n-[3-(吗啉-4-基)丙基][(喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺类化合物、其前体药物和药物活性代谢物，以及该化合物的立体异构体及其药学上可接受的盐，并提供了其在制备治疗与流感相关的疾病的药物中的应用。
[0009]
结构式如式i所示的含有吗啉丙基的[(喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺类化合物，其前体药物和药物活性代谢物，以及该化合物的立体异构体及其药学上可接受的盐：
[0010][0011]
其中，r选自氢，c1-c8烷基，c1-c8烷氧基，卤素。
[0012]
进一步地，r选自氢，甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，氯，溴。
[0013]
更进一步地，所述含有吗啉丙基的[(喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺类化合物具体为如下化合物中的任一个：
[0014]
n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺；
[0015]
n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(6-氯喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺；
[0016]
n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(6-溴喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺；
[0017]
n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(7-三氟甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺；
[0018]
n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(7-三氟甲氧基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺；
[0019]
n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(7-甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺；
[0020]
n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(8-甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺；
[0021]
n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-4-[(7-三氟甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺。
[0022]
本发明还提供一种药物组合物，包含如式ⅰ所示的含有吗啉丙基的[(喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺类化合物和药学上可接受的载体或稀释剂。
[0023]
该药物组合物用于制备治疗流感病毒疾病的药物。例如采用盐水的水溶液作为载体，ph值为7.4，则该药物组合物以溶液形式通过局部推注而被引入到患者的血流中。
[0024]
本发明的化合物可以单独给予或依据常规的制药习惯与药学上可接受的载体或稀释剂等辅剂联合，以药物组合物的形式给予。给药途径包括经口服给予或经非胃肠道包括静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下、直肠和局部途径给予。
[0025]
对于口服给药途径，除片剂或胶囊的形式，还可以采用水溶液或混悬液的形式给予。通过口服给药时，活性药物成分与可口服，无毒，药学上可接受的惰性载体组合形成药物组合物，对片剂或胶囊形式的口服给药来说，载体包括乳糖，淀粉，蔗糖，葡萄糖，甲基纤
维素，硬脂酸镁，磷酸二钙，硫酸钙，甘露醇，山梨醇；对液体形式的口服给药来说，载体包括乙醇，甘油，水及其组合。此外，还可以在药物组合物中加入药学上可接受的的粘合剂，润滑剂，崩解剂和着色剂。粘合剂包括淀粉，明胶，天然糖，如葡萄糖或乳糖，玉米甜味剂，天然和合成的树胶如阿拉伯胶，西黄蓍胶或海藻酸钠，羧甲基纤维素，聚乙二醇，蜡。润滑剂包括油酸钠，硬脂酸钠，硬脂酸镁，苯甲酸钠，醋酸钠，氯化钠。当水性混悬液口服使用时，将活性成分与乳化剂和混悬剂组合。也可加入甜味剂或矫味剂。对肌内，腹膜内，皮下和静脉内使用来说，通常制备成活性成分的无菌溶液，溶液的ph值应该作适当的调节和缓冲。对静脉内使用来说，应当控制溶质的总浓度以使制剂维持等渗。
[0026]
本发明的含有吗啉丙基的[(喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺类化合物还可与已知的可用于治疗或预防流感的药剂组合使用。优选的组合包括本发明化合物和m2离子通道蛋白抑制剂、本发明化合物和神经氨酸酶抑制剂、本发明化合物和干扰素诱导剂、本发明化合物和反义寡核苷酸、以及本发明化合物和肌苷单磷酸脱氢酶抑制剂。
[0027]
当本发明的化合物被给予人类受试中，日剂量将通常由处方医师确定，剂量一般根据患者个体的年龄、体重和反应以及患者症状的严重程度而变化。在一个示例性应用中，将适宜量的化合物给予接受治疗的哺乳动物。当用于所指示的作用时，本发明的口服剂量将为约0.01mg每kg体重每天(mg/kg/天)到约100mg/kg/天，优选0.01mg/kg/天到10mg/kg/天，最优选0.1mg/kg/天到5.0mg/kg/天。对口服给药来说，组合物优选以片剂的形式被提供，其中片剂包含0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，15.0，25.0，50.0，100和500mg的活性成分，优选1mg到100mg活性成分。对于静脉注射，在恒速输注期间，最优选的剂量为0.1mg/kg/min到10mg/kg/min。本发明的化合物或包含该化合物的药物组合物可以以每日一次的剂量给予，或者是可以将每日总剂量分为每日两次、三次或四次的剂量给予。对于经皮给药系统的形式进行的给药来说，剂量给药在整个给药方案中当然将是连续的而不是间断的。
[0028]
使用本发明化合物的剂量方案将根据多种因素进行选择，包括患者的类型，种属，年龄，体重，性别和医学状况；受治状况的严重程度；给药途径；患者的肾和肝功能；以及所用的特定化合物或其盐。普通技术医师，兽医或临床医师可容易地确定和开具需要预防、抗击或阻止状况发展的有效药量。
[0029]
在本发明的方法中，在此详细描述的化合物能形成活性成分，并根据给药形式即口服片剂，胶囊，酏剂，糖浆剂等而与适当选择的适宜的药学稀释剂，赋形剂或载体(在此统称为“载体”物质)混合，并符合常规的药学习惯。
[0030]
本发明化合物的药学上可接受的盐类指保留了式i化合物的生物效力和性质，并与合适的非毒性有机酸或无机酸或有机碱或无机碱形成的常规酸加成盐或碱加成盐。酸加成盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、高氯酸盐、硫氰酸盐、硫酸氢盐、过硫酸盐、硼酸盐、甲酸盐、乙酸盐、辛酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、油酸盐、环丙酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、肉桂酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、扁桃酸盐、抗坏血酸盐、葡萄糖酸盐、甘露糖酸盐、乳糖酸盐、苯甲酸盐、烟酸盐、异烟酸盐、水杨酸盐、乙酰水杨酸盐、没食子酸盐、咖啡酸盐、阿魏酸盐、苦味酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、对氨基苯磺酸盐、氨基磺酸盐、牛磺酸盐、2-羟基乙磺酸盐、甘氨酸盐、丙氨酸盐、缬氨酸盐、亮氨酸盐、异亮氨酸盐、苯
丙氨酸盐、色氨酸盐、酪氨酸盐、天冬氨酸盐、天冬酰胺盐、谷氨酸盐、赖氨酸盐、谷氨酰胺盐、甲硫氨酸盐、丝氨酸盐、苏氨酸盐、半胱氨酸盐、脯氨酸盐、组氨酸盐、精氨酸盐、丙酮酸盐、α-酮戊二酸盐、3-苯基丙酸盐、2-萘甲酸盐、2-萘磺酸盐、甘油磷酸盐等。碱加成盐包括铵盐，碱金属盐，例如钠和钾盐，碱土金属盐，例如钙和镁盐，有机碱的盐，例如二环己胺盐，n-甲基-d-葡糖胺盐等，而且，碱性含氮基团可以用这样的试剂季铵化，例如低级烷基卤化物，如甲基、乙基、丙基和丁基的氯、溴和碘化物；硫酸二烷基酯，如硫酸二甲酯、二乙酯、二丁酯和二戊酯；长链卤化物，如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂酰基的氯、溴和碘化物；芳烷基卤化物，如苄基和苯乙基的溴化物等。
[0031]
本发明还提供通式i所示含有吗啉丙基的[(喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺类化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0032][0033]
r选自氢，c1-c4烷基，c1-c4烷氧基，卤素。
[0034]
进一步地，r选自氢，甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，氯，溴。
[0035]
本发明的有益效果：
[0036]
本发明提供的化合物用于抑制流感病毒，是一类作用于核蛋白的新型流感病毒抑制剂。与现已上市的作用于其他靶点的抗流感病毒药物相比，作用在核蛋白的流感病毒抑制剂具有稳定性。这类流感病毒抑制剂化合物对流感具有广泛的治疗作用。且所述化合物制备方法简单，收率稳定，制备的化合物能较好地治疗流感相关的疾病。
附图说明
[0037]
图1为本发明背景技术中化合物2-[(3,4-二氯苯基)氨基]-n-[3-(吗啉-4-基)丙基]噻唑-4-甲酰胺与核蛋白(pdb id:2iqh)的结合模式图；
[0038]
图2为本发明背景技术中目标化合物n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(7-三氟甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺与核蛋白(pdb id:2iqh)的结合模式图。
chloroquinolines by the ethoxymethylenemalonic ester method.journal of the american chemical society,1946,68(7):1264-1266.)值：214℃)。
[0050]
步骤e：4-氯喹啉的制备
[0051]
于100ml的茄形瓶中加入4-羟基喹啉1.45g(0.01mol)，三氯氧磷4.60g(0.03mol)，加热至105℃反应3h，之后抽真空条件下蒸除剩余的三氯氧磷，得到黑色油状物。向反应瓶中加入饱和碳酸氢钠溶液，边加入边搅拌，抽滤，用蒸馏水洗涤一次滤饼，得黑色固体。经柱层析分离[v
(乙酸乙酯)
:v
(石油醚)
＝1:10]得到4-氯喹啉白色固体3.15g，收率为64.28％；m.p.:34.5
–
35.8℃。(文献(hauser c r,reynolds g a.relative ease of cyclization of 2-,3-,and4-aminopyridine derivatives.synthesis of naphthyridines.the journal of organic chemistry,1950,15(6):1224-1232.)值：34
–
35℃)。
[0052]
步骤f：2-[(喹啉-4-基)氨基]苯甲酸的制备
[0053]
于100ml的茄形瓶中依次加入4-氯喹啉3.27g(0.02mol)，10ml无水乙醇，2-氨基苯甲酸3.62g(0.024mol)，再滴加15滴浓盐酸，回流反应2h。反应结束向茄形瓶中再加入饱和碳酸氢钠溶液，直至析出固体，此时反应液为碱性，抽滤，蒸馏水洗涤三次滤饼，得到2-[(7-喹啉-4-基)氨基]苯甲酸白色固体，收率为86.53％；m.p.:225.1
–
228.3℃；hrms(esi):265.09561([m+h]
+
)；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.54(s,1h),8.74(d,j＝8.5hz,1h),8.53(d,j＝6.9hz,1h),8.24(s,1h),8.15(d,j＝8.5hz,1h),8.06
–
8.02(m,1h),7.84
–
7.81(m,2h),7.71
–
7.67(m,1h),7.62
–
7.59(m,1h),7.55
–
7.51(m,1h),6.64(d,j＝6.9hz,1h)。
[0054]
步骤g：n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺(化合物zc01)的制备
[0055]
向100ml的茄形瓶中，依次加入2-[(喹啉-4-基)氨基]苯甲酸0.53g(0.002mol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，edci)0.41g(0.0025mol)，1-羟基苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole，hobt)0.34g(0.0025mol)，三乙胺0.40g(0.004mol)以及20ml n,n-二甲基甲酰胺，室温搅拌1h后，加入含有0.0015mol甲胺的甲胺甲醇溶液与15ml n,n-二甲基甲酰胺的混合溶液，室温搅拌12h，停止反应。将反应液缓慢滴入150ml饱和碳酸氢钠溶液中，搅拌下有大量固体析出，抽滤，滤饼以蒸馏水洗涤三次，得到n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺黄色固体，收率为53.5％；m.p.:88.4
–
89.4℃；hrms(esi):391.20139([m+h]
+
)；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ10.86(s,1h),8.84(s,1h),8.54(s,1h),8.18(d,j＝8.3hz,1h),7.94(d,j＝8.4hz,1h),7.82(d,j＝7.8hz,1h),7.78
–
7.74(m,1h),7.68
–
7.61(m,2h),7.56
–
7.53(m,1h),7.19
–
7.14(m,2h),3.53
–
3.51(m,4h),3.31
–
3.26(m,2h),2.28
–
2.25(m,6h),1.65
–
1.60(m,2h)；
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ168.74,132.29,130.08,129.53,126.09,124.12,122.49,121.42,120.79,120.61,102.84,66.53,56.32,53.63,38.09,26.03。
[0056]
实施例2：n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(6-氯喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺(化合物zc02)的制备
[0065]
甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺黄色固体，收率为43.05％；m.p.:152.8
–
156.9℃；hrms(esi):405.22592([m+h]
+
),427.20782([m+na]
+
)；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ10.76(s,1h),8.77(s,1h),8.50(s,1h),8.01(d,j＝8.6hz,1h),7.77(d,j＝7.8hz,1h),7.71(s,1h),7.64(s,1h),7.53
–
7.49(m,1h),7.43(d,j＝8.6hz,1h),7.15
–
7.11(m,2h),3.49
–
3.48(m,10h),3.29
–
3.24(m,2h),2.23(s,3h),1.62
–
1.55(m,2h)；
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ168.88,151.22,149.52,145.75,141.27,139.71,132.27,129.46,128.97,128.06,123.71,122.20,121.01,120.29,118.72,102.54,66.61,56.40,53.69,38.16,26.07,21.59。
[0066]
实施例5：n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(7-三氟甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺(化合物zc05)的制备
[0067][0068]
参考实施例1的制备方法，采用3-三氟甲基苯胺为原料，得到n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(7-三氟甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺黄色固体，收率为33.05％；m.p.:106.2
–
108.9℃；ms(esi):459.2([m+h]
+
)；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ10.72(s,1h),8.72(s,1h),8.65(d,j＝5.7hz,1h),8.39(d,j＝8.7hz,1h),8.23(s,1h),7.90(d,j＝8.8hz,1h),7.76(d,j＝7.8hz,1h),7.67(d,j＝8.2hz,1h),7.58
–
7.54(m,1h),7.25
–
7.18(m,2h),3.50
–
3.48(m,2h),3.37
–
3.33(m,2h),3.24
–
3.20(m,2h),2.33
–
2.22(m,6h),1.56
–
1.48(m,2h)；
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ168.54,152.98,148.36,146.66,140.21,132.24,129.57,127.27,125.59,123.77,123.42,122.65,121.73,121.09,104.20,66.55,56.29,53.62,38.06,26.06。
[0069]
实施例6：n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(7-三氟甲氧基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺(化合物zc06)的制备
[0070][0071]
参考实施例1的制备方法，采用3-三氟甲氧基苯胺为原料，得到n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(7-三氟甲氧基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺黄色固体，收率为25.56％；m.p.:152.8
–
153.5℃；hrms(esi):475.19247([m+h]+),497.17450([m+na]
+
)；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ10.75(s,1h),8.78(s,1h),8.59(s,1h),8.33(d,j＝9.2hz,1h),7.83
–
7.79(m,2h),7.65(d,j＝8.6hz,2h),7.60
–
7.56(m,1h),7.26
–
7.22(m,1h),7.13(s,1h),3.54
–
3.52(m,4h),3.29
–
3.25(m,2h),2.28
–
2.24(m,6h),1.62
–
1.55(m,2h)；
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)
δ168.59,149.30,132.27,129.52,125.27,124.45,123.28,121.89,121.59,119.41,119.33,103.16,66.44,56.22,53.55,38.01,25.95。
[0072]
实施例7：n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(8-甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺(化合物zc07)的制备
[0073][0074]
参考实施例1的制备方法，采用2-甲基苯胺为原料，得到n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(8-甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺黄色固体，收率为45.68％；m.p.:81.3
–
82.5℃；hrms(esi):405.22620([m+h]
+
)；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ10.77(s,1h),8.78
–
8.75(m,1h),8.60(d,j＝5.2hz,1h),7.97(d,j＝8.4hz,1h),7.77(d,j＝7.8hz,1h),7.68(d,j＝8.2hz,1h),7.61(d,j＝7.0hz,1h),7.55
–
7.49(m,2h),7.22(d,j＝5.2hz,1h),7.16
–
7.13(m,1h),3.51(t,j＝4.6hz,4h),3.30
–
3.25(m,2h),2.70(s,3h),2.27
–
2.23(m,6h),1.64
–
1.59(m,2h)；
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ168.92,150.15,148.24,146.04,141.35,137.41,132.31,130.01,129.43,125.73,123.62,122.17,120.58,120.14,119.03,103.23,66.60,56.38,53.69,38.15,26.07,18.80。
[0075]
实施例8：n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-4-[(7-三氟甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺(化合物zc08)的制备
[0076][0077]
参照实施例1的制备方法，得到n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-4-[(7-三氟甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺黄色固体，收率为35.55％；m.p.:207.3
–
209.1℃；hrms(esi):459.19928([m+h]
+
),481.18134([m+na]
+
)；1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.40(s,1h),8.66
–
8.62(m,2h),8.47
–
8.44(m,1h),8.23(s,1h),7.92(d,j＝8.2hz,2h),7.82(d,j＝8.8hz,1h),7.46(d,j＝8.2hz,2h),7.24(d,j＝5.3hz,1h),3.57(t,j＝4.6hz,4h),3.34
–
3.29(m,2h),2.35
–
2.32(m,6h),1.73
–
1.66(m,2h)；
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ166.02,152.85,148.52,147.31,143.53,129.81,129.03,127.06,124.93,122.64,120.93,120.38,104.84,66.66,56.59,53.81,38.23,26.50；ir:(kbr,cm-1
)υ3311.75,2937.88,2858.05,2812.95,1628.77,1582.50,1527.85,1432.47,1376.71,1323.55,1261.57,1182.99,1161.82,1115.97,1074.54,920.09,894.38,863.71,822.62,757.33,739.72,682.25,595.85。
[0078]
实施例9：流感病毒核糖核蛋白复合物活化活性测试实验(rnp活化活性测试实验)
[0079]
流感病毒核糖核蛋白复合物活化活性测试实验使用293t细胞为测试细胞系。以nucleozin为活性对照药。该核糖核蛋白复合物包含流感病毒np和rna聚合酶(包括pa、pb1和pb2亚基)片段。
[0080]
首先培养293t细胞：在一个培养皿中(直径6cm)，加入混有1/10t75的培养液，并检查一下对于转染是否有足够的质粒。
[0081]
将1
×
105个293t细胞接种在96孔微量滴定板上过夜。将125ng pcdna3a-pb1，pcdna3a-pb2，pcdna3a-pa，pcdna3a-np，ppol-ns-luci质粒和pegfp共转染到293t细胞中，用lipofectamine 2000(invitrogen)重构rnp复合物。转染6小时后，加入含有被测试化合物的生长培养基。24小时后，通过steady-glo荧光素酶底物(promega)测定荧光素酶活性。使用victor 3multilabel板读数器(perkin elmer)读取gfp表达和发出的荧光。
[0082]
rnp活化活性测试实验的结果(％)，是将含有被测试化合物的荧光素酶信号(相对发光值)除以阴性对照品(dmso)的荧光素酶信号(相对发光值)来计算的。rnp活化活性值低，说明被测试化合物与rnp发生了相互作用，具有一定的流感病毒抑制活性。对每一种被测试化合物，本实验均用其最高的非细胞毒性浓度进行测试。
[0083]
本发明方法制得的部分含有吗啉丙基的2-[(喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺类化合物样品rnp活化活性测试实验结果列表如下(n＝3)：
[0084][0085]
从受试目标化合物的流感病毒核糖核蛋白复合物活化活性测试实验的初步筛选结果可以看出，本发明提供的含有吗啉丙基的2-[(喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺类化合物与rnp均明显存在相互作用，对流感病毒具有抑制活性，其中实施例2制备的n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(6-氯喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺、实施例3制备的n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(6-溴喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺和实施例5制备的n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(7-三氟甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺与rnp相互作用最强。
[0086]
实施例10：考察化合物对流感病毒感染细胞的存活率的影响。
[0087]
将mdck细胞接种在96孔板中，每孔3000个细胞，培养24h。加入100tcid
50
(50％tissue culture infective dose，引起半数培养细胞病变的病毒量的100倍)的流感病毒，
吸附细胞3h后，吸出病毒，将化合物稀释成多个浓度，加到96孔板中，每个浓度做4个复孔。同时设病毒对照组、细胞对照组和空白培养基对照组，培养36h。加入cck-8试剂，采用mtt法，测试并计算感染了流感病毒、且添加了目标化合物(或对照化合物)的细胞的吸光度与未感染病毒的细胞的吸光度的比值，测试结果表示目标化合物存在下细胞的存活率，通过观察化合物是否能够提高感染病毒后细胞的存活率，来评估化合物对流感病毒感染的细胞的保护作用。
[0088]
按照上述方法测定本发明的化合物对流感病毒的抑制活性，结果示于下表。
[0089][0090][0091]
从受试目标化合物对mdck细胞保护的测试实验的筛选结果表明本发明化合物能明显保护mdck细胞，有效地抑制流感病毒的活性，其中实施例2制备的n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(6-氯喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺、实施例3制备的n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(6-溴喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺和实施例5制备的n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(7-三氟甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺对mdck细胞保护活性最强。
[0092]
实施例11：受试化合物对流感病毒抑制率的测定
[0093]
采用标准蚀斑法对部分目标化合物的抗流感病毒活性进行测试，以a/wsn/33(h1n1)流感病毒为测试病毒株，受试化合物以dmso溶解，用培养液稀释配制为100μm的浓度，以二甲基亚砜为空白对照。
[0094]
将mdck细胞按一定浓度接种于96孔细胞培养板，在5％co2、37℃的环境中培养细胞24h，除去培养液，将a/wsn/33(h1n1)流感病毒接种于mdck细胞，37℃下吸附2h，倾去病毒液。加入100μmol
·
l-1
的受试化合物，每个化合物做3个复孔，设置病毒对照组(感染病毒，不加化合物)37℃下继续培养24h，用mdck细胞的标准蚀斑测定法测定细胞的病毒株数量，计算病毒存活率。病毒存活率＝(实验组病毒株数/病毒对照组病毒株数)
×
100％。
[0095]
按照上述方法测定本发明的化合物对流感病毒的抑制活性，结果示于下表。
[0096][0097]
从受试目标化合物对a/wsn/33(h1n1)流感病毒抑制活性测试实验的筛选结果表明本发明化合物能明显减少流感病毒的存活量，有效地抑制流感病毒的活性，其中实施例2制备的n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(6-氯喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺、实施例3制备的n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(6-溴喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺和实施例5制备的n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(7-三氟甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺抑制流感病毒活性相对强。
[0098]
实施例12：受试化合物对多种流感病毒株ic
50
的测定
[0099]
采用标准蚀斑法对部分目标化合物的抗流感病毒活性进行测试，多种测试病毒株分别为a/wsn/33(h1n1)、a/pr/8(h1n1)和a/hk/68(h3n2)，受试化合物以dmso溶解，用培养液稀释配制为100μm的浓度，以二甲基亚砜为空白对照。
[0100]
将mdck细胞按一定浓度接种于96孔细胞培养板，在5％co2、37℃的环境中培养细胞24h，除去培养液，将流感病毒a/wsn/33(h1n1)/a/pr/8(h1n1)或a/hk/68(h3n2)接种于mdck细胞，37℃下吸附2h，倾去病毒液。加入不同浓度(100、50、25、12.5、6.25、3.125μmol
·
l-1
)的受试化合物，每个化合物做3个复孔，设置病毒对照组(感染病毒，不加化合物)37℃下继续培养24h，用mdck细胞的标准蚀斑测定法测定细胞的病毒株数量，计算病毒存活率。根据不同浓度下的病毒存活率计算每个化合物对不同病毒株的ic
50
。
[0101][0102]
对实施例2制备的n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(6-氯喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺、实施例3制备的n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(6-溴喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺和实施例5制备的n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(7-三氟甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺进行进一步的流感病毒抑制实验，测得其对病毒株a/wsn/33(h1n1)的ic
50
分别为1.79
±
0.75、2.59
±
0.38和2.56
±
0.75μm；对病毒株a/pr/8(h1n1)的ic
50
分别为3.52
±
1.56、2.18
±
1.21和4.48
±
1.25μm；对病毒株a/hk/68(h3n2)的ic
50
分别为2.56
±
0.25、2.47
±
0.42和2.16
±
0.85μm。结果示于上表。因此，实施例2制备的n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(6-氯喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺、实施例3制备的n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(6-溴喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺和实施例5制备的n-[3-(吗啉-4-基)丙基]-2-[(7-三氟甲基喹啉-4-基)氨基]苯甲酰胺是广谱抗流
感病毒抑制剂。
[0103]
在下述制剂中，“活性组分”是指式i所示化合物，或其盐或溶剂化物。
[0104]
实施例13：明胶胶囊
[0105][0106]
实施例14：片剂
[0107][0108]
实施例15：片剂
[0109][0110]
将活性组分、淀粉和纤维素通过45目u.s.筛并充分混合，将所得粉末与聚乙烯吡咯烷酮混合，然后通过14目u.s.筛，将这样得到的颗粒在50-60℃干燥，并通过18目u.s.筛。将羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁和滑石，先通过60目u.s.筛，然后加入至上述颗粒中，混合后，在压片机上压制成片剂。
[0111]
实施例16：悬浮剂
[0112]
[0113][0114]
将药物通过45目u.s.筛，并与羧甲基纤维素钠及糖浆混合，以形成均匀糊状物，将苯甲酸溶液、矫味剂和着色剂用一些水稀释，并边搅拌边加入，然后加入足够量水，以达到所需的体积。
[0115]
实施例17：气溶胶
[0116][0117]
将活性成分与乙醇混合，并将所得混合物加入至抛射剂22中，冷却至30℃，并转移至容器中。然后将所需量加入至不锈钢容器中，并用剩余喷射剂稀释，然后安装阀门装置。
[0118]
实施例18：栓剂
[0119][0120]
将活性组分通过60目u.s.筛，并将其悬浮于预先熔化的饱和脂肪酸甘油酯类化合物中，然后将混合物倾入至标准的2g腔栓剂模中并冷却。
[0121]
实施例19：可注射制剂
[0122][0123]
将以上溶液静脉内注射给药至患者，速度约1ml/min。
[0124]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所
作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。