一种猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体及其构建方法和应用

1.本发明属于基因重组和疫苗技术领域，具体涉及克隆猪急性腹泻综合征冠状病毒sads-cov-wt基因组快速制备感染性bac克隆的方法及感染性克隆pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya在构建重组猪急性腹泻综合征冠状病毒中的应用。


背景技术：

2.sads-cov为具有包膜的单股正链rna病毒，在系统分类上属冠状病毒科冠状病毒属。sads-cov基因组大小约为27kb，包括5
’‑
utr、3
’‑
utr及9个编码框，其中sads-cov的辅助蛋白基因为病毒增殖与组装的非必需基因，可插入外源基因，作为活病毒载体应用，同时也可敲除相应基因研究其功能。但产生重组病毒来进行生物学研究及疫苗研发需要精确和有效的遗传操作方法。由于冠状病毒基因组较大、细菌载体的基因组稳定性、难以在体外驱动全长30 kb的rna转录本、转染效率低和病毒基因组的感染性等因素的影响，冠状病毒的反向遗传系统很难实现。细菌人工染色体bac是可以插入 100-300 kb 大片段dna 的克隆载体；目前bac载体已经发展为第二代bac载体系pbelobac11商业化载体，大小为7507bp，其中f因子具有低拷贝性，在细胞内只有1-2个拷贝，从而可以限制细胞内质粒分子之间的重排。bac技术已被证明是描述病毒基因组功能的重要工具。
3.传统的基因工程技术通过在体外反应体系中利用限制性内切酶和dna连接酶获得重组dna分子。还有一种方法则是利用具有末端转移酶活性，而不具有3
’‑5’
外切酶校准活性的taq、tfl、tth等耐热聚合酶，在pcr产物的两个3’末端加上单一腺嘌呤脱氧核苷酸（a）凸出尾；经处理的线性质粒载体3’末端则带有单一的单一胸腺嘧啶脱氧核苷酸（t）凸出尾，该载体能够直接与pcr产物高效连接形成重组dna分子。1990年代末，新技术的出现，使得dna修饰更加简化、快速。1998年，kenan murphy et al.将大肠杆菌的recbcd基因敲除，然后在突变株细胞内表达来源于λ噬菌体的重组酶redα/redβ，利用带有1kb同源臂的线性双链dna分子成功进行了基因替换试验。之后不久，a. francis stewart和他的同事们证明，利用来源于rac前噬菌体的rece/rect，只要40-60bp的同源臂就能得到很高的重组效率。后来，redα/redβ和rece/rect重组系统被不断优化，逐渐发展成为一种能在大肠杆菌细胞内高效的对dna分子进行直接修饰的技术。
4.daniel d gibson等人开发了一种用于dna大片段拼接的技术，称为gibson组装策略，在合成生物学领域具有广泛的应用前景。该技术的主要思路是对两段具有末端同源序列的dna片段，通过核酸外切酶降解，暴露出粘性末端，两段dna片段同源的粘性末端互补配对，再通过dna聚合酶聚合、连接酶连接，便可将任意两段合适大小的 dna 片段拼接起来。
5.由此形成了传统的构建冠状病毒感染性克隆的方法，即通过在体外反应体系中利用限制性内切酶和dna连接酶获得重组dna分子，该方法需要寻找合适的酶切位点方可实现片段的无痕连接，但该方法操作繁琐费时。且冠状病毒基因组较大，是已知基因组最大的rna病毒，构建全长感染性克隆时需连接的片段较多。


技术实现要素：

6.针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体及其构建方法和应用，本发明采用dna同源重组工程技术、gibson组装技术和反向筛选操作系统，最终通过分段克隆sads-cov基因组快速制备得到了感染性bac克隆。并在其基础上结合dna同源重组工程与反向筛选操作系统进一步获得了缺失sads-cov辅助蛋白基因和替换了荧光报告基因的重组质粒和重组猪急性腹泻综合征冠状病毒。这种构建和操作sads-cov感染性克隆的新方法对于构建具有较大基因组的其他rna病毒的感染性克隆具有潜在的借鉴意义，也为后续重组载体疫苗的快速研发提供了支持，也克服了构建大片段rna病毒基因组感染性克隆的繁琐耗时、稳定性差的缺陷。
7.为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体，该重组载体包括通过分段扩增，并覆盖猪急性腹泻综合征冠状病毒全基因组序列的14个基因片段，以及供所述基因片段克隆组装的载体；该基因片段由如seq id no.13~40所示的引物对猪急性腹泻综合征冠状病毒全基因组分段扩增得到。
8.一种上述猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体的构建方法包括以下步骤：s1、以sads-cov-wt病毒全基因组反转录所得cdna为模板，利用seq id no.13~40所示的引物，通过pcr分段扩增得到覆盖整个基因组序列的f1-f14共14个用于后续重组的片段；s2、以pbelobac11-spect、p15a-amp和pbelobac11-cm载体为模板，利用seq id no.1~8所示的引物，通过pcr扩增，将cmv左同源臂和f6右同源臂、f7左同源臂和f10右同源臂、f11左同源臂和sv40polya右同源臂、cmv左同源臂和sv40polya右同源臂分别加载到pbelobac11-spect、pbelobac11-spect、p15a-amp和pbelobac11-cm载体的两端，得到带有相邻重组片段同源臂的载体线性片段；s3、以pci-neo载体为模板，利用seq id no.9~12所示的引物，通过pcr扩增，将f1左同源臂、hdvrz右同源臂分别加载到cmv+intron的右端和sv40polya的左端，得到带有相邻重组片段同源臂的线性片段；s4、通过全基因合成得到左端带有f14右同源臂和28个a的hdvrz片段；s5、以r6k-amp-ccdb质粒为模板，利用seq id no.41~42所示的引物，通过pcr扩增，将f3右同源臂和f5左同源臂分别加载到amp-ccdb的两端，得到带有相邻重组片段同源臂的线性片段；s6、将步骤s2中带cmv左同源臂和f6右同源臂的pbelobac11-spect线性片段与步骤s1中得到的f1-f3、f5-f6片段、步骤s5中得到的amp-ccdb片段以及步骤s3中得到的cmv+intron片段进行gibson组装后转化e. coli db3.1即得重组载体pbelobac11-spect-ci-sads-cov-wt-f1-f6
‑△
f4-amp-ccdb；s7、将步骤s2中带f7左同源臂和f10右同源臂的pbelobac11-spect线性片段与步骤s1中得到的f7-f10片段进行gibson组装后转化e. coli gb2005，即得重组载体pbelobac11-spect-sads-cov-wt-f7-f10；
s8、将步骤s2中带f11左同源臂和sv40polya右同源臂的p15a-amp线性片段与步骤s1中得到的f11-f14片段、步骤s4得到的hdvrz片段以及步骤s3中得到的sv40polya片段进行gibson组装后转化e. coli gb2005，即得重组载体p15a-amp-sads-cov-wt-f11-f14-hdvrz-sv40polya；s9、将步骤s6、s7、s8得到的重组载体分别通过载体两端预设的酶切位点切下中间目的片段并回收，随后将这三个回收片段与步骤s2所得的带有cmv左同源臂和sv40polya右同源臂的pbelobac11-cm线性片段进行gibson组装后转化e. coli db3.1即得重组载体pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-f1-f14
‑△
f4-amp-ccdb-hdvrz-sv40polya；s10、将步骤s9所得重组载体pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-f1-f14
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f4-amp-ccdb-hdvrz-sv40polya通过预设的酶切位点切去amp-ccdb并回收，随后将回收片段与步骤s1所得f4片段进行gibson组装后转化e. coli gb2005，即得重组载体pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya。
9.采用上述技术方案的有益效果为：本发明选用真核表达常用的cmv启动子，其多应用于表达外源基因，且较容易通过pcr扩增得到，而添加了intron的cmv+intron相较于单独的cmv启动子可以大大提高转录效率，从而增强表达。
10.为了确保克隆的高保真性，在同源重组的每一步过程中都要进行pcr测序鉴定，以确保得到的是无突变的目的片段，尤其是同源臂部分，需要通过pcr验证在同源重组过程中是否发生碱基突变。另外，为了提高同源重组和阳性克隆筛选效率，减少碱基突变，本发明采用了两次重组得到全长感染性克隆的方式，先将4-6个小片段重组成一个较大的片段，测序筛选出序列完全正确的克隆后再重组为全长克隆。
11.一种含有上述猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体的重组菌。
12.上述猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体，或重组菌在猪急性腹泻综合征冠状病毒拯救、非疾病治疗目的的猪急性腹泻综合征冠状病毒的致病机理和致病力研究以及制备猪急性腹泻综合征冠状病毒疫苗中的应用。
13.上述猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体，或重组菌在抗猪急性腹泻综合征冠状病毒药物筛选中的应用。
14.一种重组猪急性腹泻综合征冠状病毒，包括上述猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体，以及表达sads-cov结构蛋白n的pci载体的辅助质粒pci-amp-sads-cov-n。
15.进一步地，辅助质粒pci-amp-sads-cov-n由含sads-cov结构基因n同源臂的pci-amp载体线性片段与sads-cov结构基因n片段通过gibson组装后转化e. coli gb2005获得。
16.进一步地，含sads-cov结构基因n同源臂的pci载体线性片段与sads-cov结构基因n片段通过seq id no.104~107所示的引物扩增得到。
17.进一步地，重组猪急性腹泻综合征冠状病毒中可缺失和/或替换sads-cov中的orf3a、orf7a和orf7b中的至少一个基因。
18.进一步地，缺失orf3a或orf7a或orf7b基因的重组猪急性腹泻综合征冠状病毒的构建方法，包括以下步骤：（1）利用seq id no：108~114所示的引物，通过pcr将同源臂加载到amp-ccdb两端
得到两端分别带有orf3a、orf7a/b同源臂的筛选标记片段；（2）利用seq id no：115~121所示的引物，通过pcr将同源臂加载到插入片段两端得到两端分别带有相应插入位置同源臂的目的基因片段；（3）将步骤（1）的线性片段与pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya感染性克隆通过dna同源重组工程进行线环重组；（4）利用预设的酶切位点切去amp-ccdb筛选标记片段，并与步骤（2）所得目的基因片段体外进行gibson组装后即得到部分或全部缺失orf3a或orf7a或orf7b基因的重组质粒和重组猪急性腹泻综合征冠状病毒。
19.进一步地，上述缺失orf3a或orf7a或orf7b基因的重组猪急性腹泻综合征冠状病毒的构建方法，包括以下步骤：s1、通过seq id no：108~114所示的引物进行pcr扩增，将orf3a(all)、orf3a(part)、orf7a/b同源臂加载到amp-ccdb两端得到两端分别带有orf3a(all)、orf3a(part)、orf7a/b同源臂的amp-ccdb筛选标记片段；s2、通过seq id no：115~121所示的引物进行pcr扩增，将orf3a同源臂加载到orf3a(part)两端，将orf7a/b同源臂加载到orf7a、orf7b、orf7a/b-58bp片段两端得到两端分别带有orf3a、orf7a/b同源臂的目的基因片段；s3、将s1的片段分别与sads-cov感染性克隆pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya在大肠杆菌gb08-red-gyra462感受态中通过dna同源重组工程进行线环重组，得到重组载体pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf3a(all)-amp-ccdb、pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf3a(part)-amp-ccdb、pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf7a/b-amp-ccdb；s4、通过amp-ccdb两端预设的asci酶切位点将其切去并乙醇沉淀回收片段。将pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf3a(all)-amp-ccdb的回收片段在体外进行gibson组装后转化e. coli gb2005；将s2所得的目的片段orf3a(part)与pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf3a(part)-amp-ccdb回收片段在体外进行gibson组装后转化e. coli gb2005；orf7a、orf7b、orf7a/b-58bp片段分别与pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf7a/b-amp-ccdb回收片段gibson组装，得到重组病毒的感染性克隆pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf3a(all)、pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf3a(part)、pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf7a、pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf7b、pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf7a/b-58bp。
20.进一步地，重组猪急性腹泻综合征冠状病毒由荧光报告基因acgfp分别替换sads-cov的orf3a、orf7a/b基因得到；所述荧光报告基因acgfp替换orf3a基因时在前端插入p2a序列间隔。
21.进一步地，替换orf3a或orf7a/b基因的荧光报告基因重组猪急性腹泻综合征冠状病毒的构建方法，包括以下步骤：（1）利用seq id no：123~126所示的引物，通过pcr将同源臂加载到amp-ccdb两端得到两端分别带有orf3a、orf7a/b同源臂的筛选标记片段；
sads-cov-wt-f1-f14
‑△
f4-amp-ccdb-hdvrz-sv40polya的xmni酶切鉴定，泳道24~30为pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya的xmni酶切鉴定；图4为本发明表达sads-cov结构蛋白n的辅助质粒的构建示意图；图5为本发明构建表达sads-cov结构蛋白n的辅助质粒的bani酶切鉴定图；其中，泳道1为辅助质粒pci-sads-n；图6为本发明部分或全部缺失orf3a或orf7a或orf7b的重组质粒的构建示意图；图7为本发明部分或全部缺失orf3a或orf7a或orf7b的重组质粒的psti酶切鉴定图；其中，泳道1~6分别表示质粒pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya、pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf3a(all)、pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf3a(part)、pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf7a、pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf7b、pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf7a/b-58bp；图8为本发明部分或全部缺失orf3a或orf7a或orf7b的重组质粒的pcr鉴定图；其中，泳道1~7分别表示质粒pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya的orf3a位置、质粒pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya的orf7a/b位置、质粒pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf3a(all) 的orf3a位置、质粒pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf3a(part) 的orf3a位置、质粒pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf7a的orf7a/b位置、质粒pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf7b的orf7a/b位置、质粒pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf7a/b-58bp的orf7a/b位置；图9为本发明在orf3a和orf7a/b表达荧光报告基因的重组质粒的构建示意图；图10为本发明在orf3a和orf7a/b表达荧光报告基因的重组质粒的psti酶切鉴定图；其中，泳道1~3分别表示质粒pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya 、pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf3a-acgfp(p2a)、pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
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orf7a/b-acgfp；图11为本发明在orf3a和orf7a/b表达荧光报告基因的重组质粒的pcr鉴定图；其中，泳道1~4分别表示质粒pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya的orf3a位置、质粒pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya的orf7a/b位置、质粒pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
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orf3a-acgfp(p2a)的orf3a位置、质粒pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf7a/b-acgfp的orf7a/b位置；图12为拯救病毒接种vero细胞12h病变图；图13为替换入荧光报告基因的重组病毒f3代荧光蛋白表达检测图；图14为sads-cov重组病毒f5代pcr检测图； 其中，1~9泳道均分别对应病毒rsads-cov-wt的orf3a位置、病毒rsads-cov-wt的orf7a/b位置、病毒rsads-cov-wt
‑△
orf3a(all) 的orf3a位置、病毒rsads-cov-wt
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orf3a(part) 的orf3a位置、病毒rsads-cov-wt
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orf7a的orf7a/b位置、病毒rsads-cov-wt
‑△
orf7b的orf7a/b位置、病毒rsads-cov-wt
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orf7a/b-58bp的orf7a/b位置、病毒rsads-cov-wt
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orf3a-acgfp(p2a)的orf3a位置、病毒rsads-cov-wt
‑△
orf7a/b-acgfp的orf7a/b位置；图15为表达荧光蛋白的拯救病毒连续于ipi-2i细胞上传代15代后目的基因的pcr
cov-r、bac-spec-1-6-f、bac-spec-1-6-r、bac-spec-7-10-f、bac-spec-7-10-r、p15a-amp-11-14-f、p15a-amp-11-14-r、sads-cmv+intron-f、sads-cmv+intron-r、sads-cov-sv40 polya-f、sads-cov-sv40 polya-r），通过pcr扩增得到pbelobac11-cm、pbelobac11-spect(f1-f6)、pbelobac11-spect(f7-f10)、p15a-amp(f11-f14)、cmv+intron、sv40polya片段，经凝胶电泳后，胶回收线性片段备用。
41.另外，通过全基因合成制备得到hdvrz片段，水溶干粉备用。
42.3、其他线性片段的制备利用seq id no.41和42的引物（包括引物
△
f4-amp-ccdb-f、
△
f4-amp-ccdb-r）扩增得到片段
△
f4-amp-ccdb，经凝胶电泳后，胶回收线性片段备用。
43.4、第一次重组所得中间载体的构建（1）pbelobac11-spect-ci-sads-cov-wt-f1-f6
‑△
f4-amp-ccdb将步骤1、2、3扩增所得片段pbelobac11-spect(f1-f6)、cmv+intron、f1、f2、f3、f5、f6、
△
f4-amp-ccdb经gibson组装后转化e. coli db3.1得到pbelobac11-spect-ci-sads-cov-wt-f1-f6
‑△
f4-amp-ccdb，扩增后每个片段两端均带有同源臂。
44.（2）pbelobac11-spect-sads-cov-wt-f7-f10将步骤1、2扩增所得片段pbelobac11-spect(f7-f10)、f7、f8、f9、f10经gibson组装后转化e. coli gb2005得到pbelobac11-spect-sads-cov-wt-f7-f10，扩增后每个片段两端均带有同源臂。
45.（3）p15a-amp-sads-cov-wt-f11-f14将步骤1、2扩增/合成所得片段p15a-amp(f11-f14)、f11、f12、f13、f14、hdvrz、sv40polya经gibson组装后转化e. coli gb2005中得到p15a-amp-sads-cov-wt-f11-f14，扩增后每个片段两端均带有同源臂。
46.（4）中间载体的制备具体过程为：a、将上述所需的胶回收或合成得到的各个线性片段先用t4聚合酶进行连接处理，pcr程序为：25 ℃ 60 min；75 ℃ 20 min；50 ℃ 30 min；4 ℃保存。pcr体系：t4聚合酶 0.13 μl，t4 buffer 2.1 2 μl，各线性片段 200 ng，ddh2o补齐至20 μl。t4聚合酶处理后，将pcr产物过除盐膜，进行除盐30 min；b、同时制备e. coli db3.1和e. coli gb2005感受态。前一天于平板挑取单克隆菌落于含1 ml lb培养基的1.5 ml 离心管中，30 ℃ 950 rpm过夜培养。取扩摇好的70 μl菌液转接于含1.3 ml lb培养基的1.5 ml 离心管中，30 ℃ 950 rpm 扩摇2 h。添加35 μl 的l-arabinaose诱导重组酶的表达，30 ℃ 950 rpm 摇菌40 min；9500 rpm离心1 min收集菌体，1 ml ddh2o 9600 rpm，离心1 min，弃上清；1 ml ddh2o 9700 rpm，离心1 min，弃废液得到所需菌体。
47.c、将除盐后的pcr产物加入菌体中，吹打均匀后，将其加入处理好的电转杯，1350v 电转。向电转杯中加入1 ml lb培养基，轻轻吹打均匀后转移至新的1.5 ml离心管，30 ℃ 950 rpm复苏1 h。再将其置于离心机中，10000 rpm离心1 min，弃上清，重悬菌体，划线并涂布在分别含spect+amp、spect和amp抗性的lb平板上。正面朝上放置在30℃培养箱中1 h后，翻板，过夜培养18~24 h。挑取上述平板中的单菌落分别于1.7 ml含spect+amp、spect和amp抗性lb培养液的2 ml ep管中，30 ℃ 950 rpm 过夜培养。根据tiangen试剂盒小提质粒的
dp214-03）说明书回收dna片段。
58.1、线性片段的扩增a、pci-amp载体片段的制备以seq id no.104和105所示的引物（包括引物pci-amp-f、pci-amp-r），以酶切线性化后的pci-amp-neo质粒为模板，通过pcr扩增得到带有sads-cov n基因同源臂的pci-amp载体片段，经凝胶电泳后，胶回收线性片段备用。
59.b、sads-cov-n基因片段的制备以seq id no.106和107的引物（包括引物sads-cov-n-f、sads-cov-n-r），以sads-cov核酸逆转录所得cdna为模板，扩增得到n基因片段，经凝胶电泳后，胶回收线性片段备用。
60.2、表达sads-cov结构蛋白n的辅助质粒的构建将步骤1所得片段pci-amp和sads-cov-n经gibson组装后转化e. coli gb2005，随后挑单菌落进行酶切和测序验证，挑选其中正确的单克隆即得到表达sads-cov结构蛋白n的辅助质粒pci-amp-sads-cov-n。
61.上述表达sads-cov结构蛋白n的辅助质粒的构建示意图如图4所示。上述辅助质粒的酶切鉴定图如图5所示。
62.实施例3 部分或全部缺失orf3a或orf7a或orf7b位置的重组质粒的构建引物设计原则：设计引物时在amp-ccdb的两端预设asci酶切位点。在各个扩增引物序列之间设计同源臂，引物之间有30~60bp的重叠，引物具体序列如seq id no.108~121所示，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
63.pcr扩增程序：同实施例1。
64.pcr扩增反应体系为：primestar max dna polymearse 25 μl，上下游引物(10 pmol/μl)各0.5 μl，模板 0.5 μl，加ddh2o补齐至50 μl。
65.胶回收扩增产物：将各pcr产物放置于1%琼脂糖凝胶上电泳，电泳仪上的电压与时间分别设置为125 v，30 min。电泳结束后，在凝胶成像仪的紫外灯照射下，小心切下目的片段条带处的凝胶，并将其放置于已灭菌处理的2 ml ep管中，按照胶回收试剂盒（tiangen， dp214-03）说明书回收dna片段。
66.1、线性片段的扩增a、amp-ccdb片段的制备以seq id no.108~141所示的引物（依次为引物
△
ns3a(all)-ampccdb-f、
△
ns3a(all)-ampccdb-r、
△
ns3a(part)-ampccdb-f、
△
ns3a(part)-ampccdb-r、
△
ns7a/b-ampccdb-f、
△
ns7a/b-58bp-ampccdb-f、
△
ns7-ampccdb-r），通过pcr扩增得到分别带有orf3a(all)、orf3a(part)、orf7a/b、orf7a/b-58bp同源臂的amp-ccdb片段，经凝胶电泳后，胶回收线性片段备用。
67.b、orf3a/orf7a/orf7b缺失后基因片段的制备以seq id no.115~119所示的引物（依次为引物
△
ns3a(part)-f、
△
ns3a(part)-r、
△
ns7a-f、
△
ns7b-f、
△
ns7-r），以sads-cov 10代毒核酸逆转录所得cdna为模板，扩增得到缺失部分序列的orf3a（参照pedv cv777的缺失）、缺失orf7a的orf7a/b（点突变缺失起始密码子）、缺失orf7b的orf7a/b（点突变缺失起始密码子）；以seq id no.120和121所示的引
物（包括引物
△
ns7a/b-58bp-f、
△
ns7a/b-58bp-r），以sads-cov 83代毒核酸逆转录所得cdna为模板，扩增缺失58bp的orf7a/b（于vero细胞连续传代产生的自然缺失），经凝胶电泳后，胶回收线性片段备用。
68.2、大肠杆菌gb08-red-gyra462感受态的制备接种大肠杆菌gb08-red-gyra462于1 ml的lb培养基中，30 ℃ 950 rpm过夜培养。第二天转接70ul至新的含1.3 ml lb培养基1.5 ml ep管中，于30 ℃ 950 rpm 扩摇2 h。9500 rpm离心1 min收集菌体，1 ml ddh2o 9600 rpm，离心1 min，弃上清；1 ml ddh2o 9700 rpm，离心1 min，弃废液得到制备的感受态。
69.3、pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya质粒重转化于e. coli gb08-red-gyra462感受态将200 ng pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya质粒加入gb08-red-gyra462感受态中，轻柔吹打混合均匀后转移至电转杯中，1350 v电转。30 ℃ 950 rpm复苏1 h，10000 rpm离心1 min，弃上清，重悬菌体。取50 μl重悬后的菌液，划线并涂布在含cm抗性的lb平板上。正面朝上放置在30 ℃培养箱中1 h后，倒置，过夜培养。挑取单菌落，小提质粒，进行酶切验证。
70.4、amp-ccdb替换orf3a和orf7a/b位置的基因过夜培养前一步中酶切验证正确的单克隆，转接后30 ℃ 950 rpm 摇菌2 h。添加35 μl l-arabinaose诱导40 min后离心收集菌体，清洗菌体。分别加入200 ng步骤1制备得到的用于缺失sads-cov基因组上orf3a(all)、orf3a(part)、orf7a/b、orf7a/b-58bp基因的amp-ccdb片段，1350 v电转后，30 ℃ 950 rpm复苏1 h，收集菌体重悬，涂布于cm+amp抗性的lb平板上，30 ℃过夜培养。挑取单菌落，小提质粒，进行酶切验证，pcr验证。
71.5、利用ccdb反向筛选获得缺失orf3a或orf7a或orf7b的重组质粒将步骤4构建得到的带有含amp-ccdb质粒的菌分别接菌于100 ml含cm+amp抗性lb培养液的锥形瓶中，30℃ 200 rpm过夜培养。根据tiangen试剂盒大提质粒的说明书进行操作，提取质粒。使用asci于37 ℃酶切2 h切除amp-ccdb，通过酚氯仿抽提和乙醇沉淀得到切除了amp-ccdb的线性化片段。将上述沉淀所得片段与步骤1扩增所得相应片段经体外gibson组装后转化e. coli gb2005得到部分或全部缺失orf3a或orf7a或orf7b的重组质粒pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf3a(all)、pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf3a(part)、pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf7a、pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf7b、pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf7a/b-58bp（
△
orf3a(all)质粒仅沉淀所得片段自身重组）。挑取单菌落，小提质粒，进行酶切验证，pcr验证。
72.上述pcr验证及测序使用引物如seq id no.91、92、122和100所示。
73.pcr程序：94 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 20 s，设定32个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存。pcr体系：primestar max dna polymearse 15 μl，上下游引物(10 pmol/μl)各1 μl，模板 1 μl，加ddh2o补齐至30 μl。
74.部分或全部缺失orf3a或orf7a或orf7b位置的重组质粒的构建示意图如图6所示。部分或全部缺失orf3a或orf7a或orf7b位置的重组质粒的酶切分析和pcr扩增图如图7和图8所示。
℃ 950 rpm复苏1 h，收集菌体重悬，涂布于cm+amp抗性的lb平板上，30 ℃过夜培养。挑取单菌落，小提质粒，进行酶切验证，pcr验证。
84.5、利用ccdb反向筛选获得表达荧光报告基因acgfp的重组质粒将步骤4构建得到的带有含amp-ccdb质粒的菌分别接菌于100 ml含cm+amp抗性lb培养液的锥形瓶中，30℃ 200 rpm过夜培养。根据tiangen试剂盒大提质粒的说明书进行操作，提取质粒。使用asci于37 ℃酶切2 h切除amp-ccdb，通过酚氯仿抽提和乙醇沉淀得到切除了amp-ccdb的线性化片段。将上述沉淀所得片段与步骤1扩增所得带有相应同源臂的acgfp片段经体外gibson组装后转化e. coli gb2005得到orf3a或orf7a/b位置表达荧光报告基因的重组质粒pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf3a-acgfp(p2a)、pbelobac11-cm-ci-sads-cov-wt-hdvrz-sv40polya
‑△
orf7a/b-acgfp。挑取单菌落，小提质粒，进行酶切验证，pcr验证。
85.上述pcr验证及测序使用引物如seq id no.91、92、122和100所示。
86.pcr程序：94 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 20 s，设定32个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存。pcr体系：primestar max dna polymearse 15 μl，上下游引物(10 pmol/μl)各1 μl，模板 1 μl，加ddh2o补齐至30 μl。
87.orf3a或orf7a/b位置表达荧光报告基因重组质粒的构建示意图如图9所示。orf3a或orf7a/b位置表达荧光报告基因重组质粒的酶切分析和pcr扩增图如图10和图11所示。
88.实施例5 重组质粒的病毒拯救1、试剂盒提取质粒：将构建好的重组质粒接种于200 ml的培养基中，过夜培养，使用aidlab bac/pac大型质粒提取试剂盒提取质粒。
89.2、重组质粒与辅助质粒共转染于vero细胞：检测重组质粒和辅助质粒的浓度后，使用lipofectamin 3000试剂盒(lipofectamine
®
3000 reagent 购自 invitogen 公司)进行转染试验。
90.3、拯救病毒传代培养：将转染后获得的病毒液于vero细胞上传代培养。待vero细胞长满后，弃上清，pbs清洗两遍，加入病毒液及含8ug/ml胰酶的dmem培养液，摇晃均匀，37 ℃，5% co2培养箱孵育1 h，后弃掉上清，重新加入适量含8ug/ml胰酶的dmem培养液，接毒后48 h收毒，放置在-80℃冰箱中冻融一次，收取病毒液，按此方法进行病毒传代培养，观察病毒病变情况，其代次依次记为f1、f2和f3等。重组病毒分别命名为rsads-cov-wt、rsads-cov-wt
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orf3a(all)、rsads-cov-wt
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orf3a(part)、rsads-cov-wt
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orf7a、rsads-cov-wt
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orf7b、rsads-cov-wt
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orf7a/b-58bp、rsads-cov-wt
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orf3a-acgfp(p2a)、rsads-cov-wt
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orf7a/b-acgfp。
91.4、拯救病毒的荧光/pcr检测：连续传代后出现稳定病变，细胞膜融合呈合胞体，且出现空泡（图12）。替换入荧光报告基因的重组病毒同时检测荧光蛋白的表达验证替换修饰的成功，结果见图13。将拯救成功的重组病毒以0.1moi的剂量接毒vero和ipi-2i细胞，接毒后24小时于荧光倒置显微镜观察荧光蛋白的表达情况，结果符合预期，替换了荧光报告基因的重组病毒均表达了相应的荧光蛋白，说明各重组病毒均为成功替换了荧光报告基因的重组猪急性腹泻综合征冠状病毒。同时，冻融接毒样品后收取上清液，使用axyprep体液病毒dna/rna小量试剂盒（axygen公司产品）提取重组病毒的rna，反转录为cdna后设计引物进行pcr检测，检测重组病毒的orf3a或orf7a/b基因，结果见图14。各泳道结果均符合预期，且
不同于未经修饰的拯救病毒rsads-cov-wt，说明经过对orf3a或orf7a/b位置基因进行缺失或替换修饰操作后，该位置均成功进行相应操作。pcr检测引物序列如seq id no.91、92、122和98所示，pcr产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
92.5、插入外源基因拯救病毒的稳定性评价：将拯救病毒持续传代，于ipi-2i细胞上连续传代15代，观察其病变情况，通过pcr和荧光倒置显微镜观察荧光蛋白表达情况鉴定目的基因是否稳定存在。其中，pcr检测引物序列如seq id no.91、92、122和98所示，pcr产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
93.pcr扩增及荧光表达结果见图15，图中，a代表对sads-cov的orf3a位置进行检测，可以看出f15代重组病毒均具有与f3代相同的条带，且目的片段大小符合预期，说明在orf3a位置，插入的荧光报告基因acgfp能稳定存在。b代表对sads-cov的orf7a/b位置进行检测，可以看出f15代重组病毒均具有与f3代相同的条带，且目的片段大小符合预期，说明在orf7a/b位置，插入的荧光报告基因acgfp能稳定存在。c代表对插入sads-cov orf3a和orf7a/b位置的荧光蛋白进行检测，可以看出f3和f15代重组病毒均观察到较明显的荧光，说明在orf3a和orf7a/b位置插入的荧光报告基因能稳定存在。