对棘白菌素类化合物氧磺酰化的酶及其应用

本发明属于生物制药，涉及一种可以对棘白菌素类化合物具有氧磺酰化的p450酶和磺酰基转移酶及其应用；更进一步地，涉及氧磺酰化纽莫康定b0的形成。

背景技术：

1、近年来随着老龄化人口的增多，器官移植治疗的临床应用推广，hiv病毒的蔓延等，免疫力低下患者数量不断增加，导致深部真菌感染率呈迅速上升的趋势。深部真菌感染逐渐成为免疫力低下患者发病和死亡的重要诱因，对人类社会健康造成了极大威胁。

2、目前临床上应用的传统抗真菌药物对人体存在毒副作用，并且真菌耐药性问题也日益突出，因此亟需开发新一代的高效、低毒且对耐药菌有效的抗真菌药物。棘白菌素类药物作为一类新型的环脂肽类抗真菌药物，作用机制独特，能够选择性地抑制真菌细胞壁中的β-1,3葡聚糖合成酶活性从而抑制真菌细胞壁的合成，导致真菌细胞裂解死亡，该类药物安全性高，抗菌谱宽且对耐药菌有效。

3、临床上应用的棘白菌素类抗真菌药物包括三种，分别是卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净。其中，米卡芬净具有其独特性，与另外两种棘白菌素类抗真菌药物相比，米卡芬净具有磺酰基基团，磺酰基基团能赋予化合物极好的水溶性，进而增加其生物利用度。然而目前fr901379结构中的氧磺酰基基团形成机制仍然是未知的，这极大地限制了磺酰基转移酶在重要化合物生物活性修饰方面的应用。因此，解析米卡芬净前体fr901379中氧磺酰基基团合成机制，可以为生物信息学挖掘提供靶标，发现更多磺酰化的环脂肽类化合物，同时为棘白菌素类化合物氧磺酰化修饰提供了酶学元件和理论指导，有助于芬净类抗真菌药物的新药创制。

技术实现思路

1、一方面，本发明提供了一种细胞色素p450单加氧酶。

2、在一个实施方式中，所述细胞色素p450单加氧酶与seq id no.2相比具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列同一性；优选的，所述细胞色素p450单加氧酶来源于鞘茎点霉属真菌(coleophoma sp.)；更优选的，所述细胞色素p450单加氧酶的氨基酸序列与seq id no.2相比具有至少70％的序列同一性，并且所述细胞色素p450单加氧酶来源于鞘茎点霉属真菌；所述鞘茎点霉属真菌包括coleophoma sp.或coleophoma empetri，例如，鞘茎点霉(coleophoma sp.)mefc009。在其他的实施方式中，所述c.empetri为c.empetri f-11899。更优选的，所述细胞色素p450单加氧酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。

3、在其他的实施方式中，所述细胞色素p450单加氧酶的氨基酸序列如ncbi数据库中的序列号分别为rdw63434.1、rdw57263.1和xp_031866084.1所示的序列，分别来自于丝状真菌coleophoma cylindrospora、coleophoma crateriformis和venustampullaechinocandica。

4、另一方面，本发明提供了一种磺酰基转移酶。

5、在一个实施方式中，所述磺酰基转移酶与seq id no.4相比具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列同一性；优选的，所述磺酰基转移酶来源于鞘茎点霉属真菌(coleophoma sp.)；更优选的，所述磺酰基转移酶的氨基酸序列与seq id no.4相比具有至少70％的序列同一性，并且所述磺酰基转移酶来源于鞘茎点霉属真菌；所述鞘茎点霉属真菌包括coleophoma sp.或c.empetri，例如，鞘茎点霉(coleophoma sp.)mefc009。在其他的实施方式中，所述c.empetri为c.empetri f-11899。更优选的，所述磺酰基转移酶的氨基酸序列如seq id no.4所示。

6、在其他的实施方式中，所述磺酰基转移酶的氨基酸序列如ncbi数据库中的序列号分别为rdw57264.1和xp_031866072.1所示的序列；其中，rdw57264.1的氨基酸序列如seqid no.5所示，其来源于c.crateriformis；xp_031866072.1的氨基酸序列如seq id no.6所示，其来源于v.echinocandica。

7、在其他的实施方式中，本发明所述磺酰基转移酶与seq id no.5相比具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列同一性；优选的，所述磺酰基转移酶来源于c.crateriformis；更优选的，所述磺酰基转移酶的氨基酸序列与seq id no.5相比具有至少70％的序列同一性，并且所述磺酰基转移酶来源于c.crateriformis。更优选的，所述磺酰基转移酶的氨基酸序列如seq id no.5所示。

8、因此，在其他的实施方式中，本发明所述磺酰基转移酶与seq id no.6相比具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的序列同一性；优选的，所述磺酰基转移酶来源于v.echinocandica；更优选的，所述磺酰基转移酶的氨基酸序列与seq id no.6相比具有至少70％的序列同一性，并且所述磺酰基转移酶来源于v.echinocandica。更优选的，所述磺酰基转移酶的氨基酸序列如seq id no.6所示。

9、本发明中，鞘茎点霉(coleophoma sp.)mefc009，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.21058，保藏日期为2020年11月18日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。

10、另一方面，本发明还提供了包含上述细胞色素p450单加氧酶或磺酰基转移酶或其编码基因的生物材料。所述生物材料选自：包含上述细胞色素p450单加氧酶或磺酰基转移酶的载体，或者，包含上述细胞色素p450单加氧酶或磺酰基转移酶的宿主细胞。

11、另一方面，本发明还提供了编码上述细胞色素p450单加氧酶或磺酰基转移酶的基因。

12、另一方面，本发明还提供了包含上述基因的载体，或者，包含所述载体的宿主细胞。

13、在一个实施方式中，所述载体包括克隆载体和表达载体，例如，pet系列载体(如pet-14、pet-21、pet-22、pet-28、pet-30、pet-42、pet-gst、pet-his、pet-trx、pet-gst、pet-cks、pet-dsba)、pmal系列载体(如pmal-2c)、pgex系列载体(如pgex-4t-2、pgex-6t-1)、pbad系列载体(如pbad-his、pbad-myc)、pmbp系列载体(pmbp-p、pmbp-c)、ptyb2、pqe-9、pacycduet-1、pcdfduet-1、pcoladuet-1、prsfduet-1、pllp-ompa、puc系列载体(如puc18、puc19)、pqe-30、pxh2-1、pxh-43、ptrii、pgsf957。

14、在一个实施方式中，所述宿主细胞选自大肠杆菌(例如，大肠杆菌dh5α、大肠杆菌bl21(de3)、rosetta(de3)、codon plus(de3)-ripl、bl21 codon plus(de3)、top10、jm109)、酵母菌(例如，酿酒酵母、毕赤酵母、解酯耶氏酵母)、鞘茎点霉真菌、纽莫康定产生菌(glarea lozoyensis)。

15、另一方面，本发明还提供了上述细胞色素p450单加氧酶和/或磺酰基转移酶、其编码基因、包含基因的载体、上述宿主细胞、或上述生物材料在棘白菌素类化合物羟基化、磺酰化或氧磺酰化中的应用。

16、在一个实施方式中，本发明提供了上述细胞色素p450单加氧酶、其编码基因、包含基因的载体、上述宿主细胞、或上述生物材料在棘白菌素类化合物羟基化中的应用。

17、在一个实施方式中，本发明提供了上述磺酰基转移酶、其编码基因、包含基因的载体、上述宿主细胞、或上述生物材料在棘白菌素类化合物磺酰化中的应用。

18、在一个实施方式中，本发明提供了上述细胞色素p450单加氧酶和磺酰基转移酶、其编码基因、包含基因的载体、上述宿主细胞、或上述生物材料在棘白菌素类化合物氧磺酰化中的应用。

19、本领域公知，棘白菌素类化合物的结构中通常包含l-高酪氨酸苯环，在抗真菌药物卡泊芬净和阿尼芬净前体纽莫康定b0和棘白菌素b中都含有l-高酪氨酸苯环，同时在本发明中的fr901379、fr133302、化合物13a、化合物13、纽莫康定b0、羟化纽莫康定b0、氧磺酰化纽莫康定b0、化合物4。

20、例如，fr901379为米卡芬净前体，其结构式如式(i)所示：

21、

22、羟化纽莫康定b0的结构式如式(ii)所示：

23、

24、氧磺酰化纽莫康定b0的结构式如式(iii)所示：

25、

26、纽莫康定b0的结构式如式(iv)所示：

27、

28、fr133302的结构式如式(v)所示：

29、

30、化合物13a的结构式如式(vi)所示：

31、

32、化合物13的结构式如式(vii)所示：

33、

34、化合物4的结构式如式(viii)所示：

35、

36、上述fr901379、fr133302、化合物13a、化合物13、纽莫康定b0、羟基化纽莫康定b0、氧磺酰化纽莫康定b0或化合物4包括l-高酪氨酸苯环，并且，在l-高酪氨酸苯环上的c3’位置存在不同的修饰。例如，fr901379、化合物13和氧磺酰化纽莫康定b0在l-高酪氨酸苯环上的c3’位置存在氧磺酰基修饰；fr133302、化合物13a和羟基化纽莫康定b0在l-高酪氨酸苯环上的c3’位置存在羟基修饰；化合物4和纽莫康定b0则在l-高酪氨酸苯环上的c3’位置上不存在任何修饰。

37、在一个实施方式中，所述对棘白菌素类化合物羟基化、磺酰化或氧磺酰化为对棘白菌素类化合物的l-高酪氨酸苯环上的c3’位进行羟基化、磺酰化或氧磺酰化。

38、在一个实施方式中，所述羟基化为在棘白菌素类化合物l-高酪氨酸苯环未羟基化的c3’位上添加羟基；优选的，所述未羟基化的c3’位上无任何修饰；

39、在一个实施方式中，所述磺酰化为在棘白菌素类化合物l-高酪氨酸苯环羟基化c3’位的羟基上添加磺酰基(so3-)。

40、在一个实施方式中，所述氧磺酰化为在棘白菌素类化合物的l-高酪氨酸苯环无修饰的c3’位上添加氧磺酰基(oso3-)。

41、上述棘白菌素类化合物包括但不限于fr901379、fr133302、化合物13a、化合物13、纽莫康定b0、羟基化纽莫康定b0、氧磺酰化纽莫康定b0、化合物4中的一种或任意几种，上述化合物的结构域如式i-式viii所示。

42、在一个实施方式中，所述羟基化为将式viii所示的化合物羟基化为式v所示的化合物，或者，将纽莫康定b0羟基化为式ii所示的化合物。

43、在一个实施方式中，所述磺酰化为将式v所示的化合物磺酰化为式i所示的化合物，或者，将式ii所示的化合物磺酰化为式iii所示的化合物，或者，将式vi所示的化合物磺酰化为式vii所示的化合物。

44、在一个实施方式中，所述氧磺酰化为将式viii所示的化合物氧磺酰化为式i所示的化合物，或者，将纽莫康定b0氧磺酰化为式iii所示的化合物。

45、在一个实施方式中，本发明提供了上述细胞色素p450单加氧酶在fr901379形成过程中l-高酪氨酸苯环上的c3’位的羟基化中的用途。

46、在一个实施方式中，本发明提供了上述磺酰基转移酶在fr901379形成过程中将磺酰基转移到l-高酪氨酸苯环上的c3’位的羟基中的用途。

47、在一个实施方式中，本发明提供了上述细胞色素p450单加氧酶和上述磺酰基转移酶在fr901379形成过程中在l-高酪氨酸苯环上的c3’位形成氧磺酰基团中的用途。

48、具体的，本发明提供了上述细胞色素p450单加氧酶和上述磺酰基转移酶在如式(i)所示的fr901379形成过程中催化形成式(i)中的氧磺酰基团(oso3-)中的用途。

49、在一个实施方式中，本发明提供了上述细胞色素p450单加氧酶在催化纽莫康定b0形成羟基化纽莫康定b0中的用途。

50、在一个实施方式中，本发明提供了上述细胞色素p450单加氧酶和磺酰基转移酶在催化纽莫康定b0形成氧磺酰化纽莫康定b0中的用途。

51、本发明中，所述细胞色素p450单加氧酶又称为p450酶。

52、另一方面，本发明还提供了一种对棘白菌素类化合物的l-高酪氨酸苯环上的c3’位进行羟基化、磺酰化或氧磺酰化的方法，所述方法包括利用上述细胞色素p450单加氧酶和/或磺酰基转移酶、其编码基因、包含基因的载体、上述宿主细胞、或上述生物材料对棘白菌素类化合物的l-高酪氨酸苯环上的c3’位进行羟基化、磺酰化或氧磺酰化的步骤。

53、另一方面，本发明还提供了一种纽莫康定产生菌(g.lozoyensis)基因工程菌株，所述工程菌株为在纽莫康定产生菌中引入上述细胞色素p450单加氧酶和/或磺酰基转移酶所得到的工程菌株。

54、优选的，所述引入为过表达。

55、所述的“引入”包括将上述目的基因在出发菌株中进行表达的步骤，优选，过表达。例如，将目的基因构建到表达载体上，将表达载体转入到宿主细胞中以表达目的基因，优选，过表达。在其他的实施方式中，所述的“引入”包括将目的基因插入到宿主细胞的基因组中；优选的，所述插入到宿主细胞的基因组中可以采用同源重组双交换的方法；在一个实施方式中，可以采用将目的基因以及同源臂插入到载体上，然后将载体转入到宿主细胞中，利用同源臂与宿主细胞基因组发生同源重组双交换从而将目的基因插入到合适的基因组的位置；在其他的实施方式中，还可以采用基因编辑的方式，例如，利用crispr/cas系统在期望的基因组位点上进行切割，同时将目的基因作为外源供体插入到切割位点上。

56、另一方面，本发明还提供了上述基因工程菌株在生产羟基化纽莫康定b0和/或氧磺酰化纽莫康定b0中的应用。

57、所述羟基化纽莫康定b0的结构式如式(ii)所示，所述氧磺酰化纽莫康定b0的结构式如式(iii)所示。

58、另一方面，本发明还提供了一种制备羟基化纽莫康定b0和/或氧磺酰化纽莫康定b0的方法，所述方法包括利用上述基因工程菌株进行发酵的步骤。

59、本发明中的“过表达”是指基因工程菌与野生型的出发菌株相比，所述目的基因的表达量或活性要高于野生型的出发菌株。在一个实施方式中，上述过表达可以通过引入表达载体来过表达目的基因来实现；其他的实施方式中，上述过表达也可以通过在出发菌株中引入额外的目的基因的拷贝、通过增加目的基因的拷贝数来实现；其他的实施方式中，还可以通过对目的基因的启动子优化来实现，比如，通过将目的基因的原始启动子替换为启动子活性更高的启动子来实现目的基因的过表达。

60、本发明所述的突变包括通过基因缺失、基因插入或基因取代的方式导致基因功能或活性丧失。

61、在优选的实施方式中，基因突变为将目标基因进行基因敲除。

62、在一个实施方式中，所述基因突变可以采用本领域常规的技术操作来实现，例如，通过同源重组的方式进行基因敲入或基因敲除从而导致基因功能或活性丧失；或者，采用基因编辑的方式，如锌指核酸内切酶(zfn)、类转录激活因子效应物核酸酶(talen)或crispr技术对上述基因进行突变从而导致基因功能或活性丧失。

63、另一方面，本发明还提供了上述基因工程菌的构建方法。