一株高产FR901379的菌株及其构建方法与应用

本发明属于基因工程，具体涉及过表达目的基因使fr901379产量提高的鞘茎点霉属的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术：

1、棘白菌素类抗真菌药物是一类环脂肽类天然产物的衍生物，能够选择性地抑制真菌细胞壁中的β-1,3葡聚糖合成酶活性，从而影响真菌细胞壁的合成，导致真菌细胞裂解死亡。棘白菌素类药物作用机制独特，安全性高，抗菌谱宽且对耐药菌有效。随着真菌耐药性加剧，棘白菌素类药物在全球抗真菌药物市场中所占比例成呈逐年上升趋势。目前，临床上应用的棘白菌素类抗真菌药物有卡泊芬净，米卡芬净和阿尼芬净。其中，米卡芬净具有其独特性，其前体fr901379具有磺酰基基团，从而具有极好的水溶性，进而提高了其生物利用度。

2、米卡芬净的工业生产包括三步：首先由coleophoma empetri发酵产生fr901379，然后经游他游动链霉菌发酵将脂肪酸侧链水解掉，最后通过化学修饰加上4-(5-(4-(戊基氧基)苯基)-3-异噁唑基)苯甲酸甲酯侧链最终生成米卡芬净。其中c.empetri发酵产生fr901379是生产工艺中重要的一步，对于生产成本控制和后处理工艺至关重要。目前对于c.empetri生产性能的优化一般通过发酵培养基优化，物理诱变等方式，未有通过遗传改造提高菌株生产性能的相关报道。c.empetri发酵产物中除了fr901379外，还有另外两个副产物wf11899b和wf11899c，副产物与fr901379最大的区别在于l-鸟氨酸c-4位与l-高酪氨酸c-4位的羟基化修饰程度不同。在c.empetri发酵过程中存在产量低，副产物多的现象，导致后续分离纯化困难，导致米卡芬净的生产成本一直居高不下。目前米卡芬净工业生产上迫切需要解决上述问题，但是负责l-鸟氨酸c-4位与l-高酪氨酸c-4位羟化的酶的编码基因尚不可知，这极大地限制了相关代谢工程改造。因此，鉴定负责l-鸟氨酸c-4位和l-高酪氨酸c-4位羟化的氧化酶将为代谢工程改造提供改造靶点，降低副产物积累，提高fr901379产量，促进米卡芬净生产技术提质增效。

技术实现思路

1、本发明提供了一种基因工程菌株，所述基因工程菌株的出发菌株为鞘茎点霉属真菌。

2、所述鞘茎点霉属真菌包括coleophoma sp.或c.empetri。

3、在一个具体的实施方式中，鞘茎点霉属真菌为鞘茎点霉(coleophoma sp.)mefc009，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.21058，保藏日期为2020年11月18日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。

4、本发明中，针对鞘茎点霉(coleophoma sp.)mefc009中的细胞色素p450单加氧酶mcff和mcfh进行了遗传改造，获得了不同的基因工程菌株，某些基因工程菌株可以高产米卡芬净前体fr901379。

5、本发明中，所述mcff为细胞色素p450单加氧酶(cytochrome p450monooxygenase)，其氨基酸序列如seq id no.2所示，其核酸序列如seq id no.1所示。所述mcfh为细胞色素p450单加氧酶(cytochrome p450 monooxygenase)，其氨基酸序列如seqid no.4所示，其核酸序列如seq id no.3所示。

6、本发明中，所述细胞色素p450单加氧酶又称为p450酶。

7、一方面，本发明提供了一种细胞色素p450单加氧酶。在一个实施方式中，所述细胞色素p450单加氧酶与seq id no.2或4相比具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；优选的，所述细胞色素p450单加氧酶来源于鞘茎点霉属真菌；更优选的，所述细胞色素p450单加氧酶的氨基酸序列与seq id no.2或4相比具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且所述细胞色素p450单加氧酶来源于鞘茎点霉属真菌。所述鞘茎点霉属真菌包括coleophoma sp.或coleophoma empetri，例如，鞘茎点霉(coleophoma sp.)mefc009。

8、在优选的实施方式中，所述细胞色素p450单加氧酶的氨基酸序列如seq id no.2或seq id no.4所示。

9、另一方面，本发明还提供了包含上述细胞色素p450单加氧酶或其编码基因的生物材料。所述生物材料选自：包含上述细胞色素p450单加氧酶的载体，或者，包含上述细胞色素p450单加氧酶的宿主细胞。

10、另一方面，本发明还提供了编码上述细胞色素p450单加氧酶的基因。

11、另一方面，本发明还提供了包含上述基因的载体，或者，包含所述载体的宿主细胞。

12、在一个实施方式中，所述载体包括克隆载体和表达载体，例如，pet系列载体(如，pet-14、pet-21、pet-22、pet-28、pet-30、pet-42、pet-gst、pet-his、pet-trx、pet-gst、pet-cks、pet-dsba)，pmal系列载体(如pmal-2c)、pgex系列载体(如pgex-4t-2、pgex-6t-1)、pbad系列载体(如pbad-his、pbad-myc)、pmbp系列载体(pmbp-p、pmbp-c)、ptyb2、pqe-9、pacycduet-1、pcdfduet-1、pcoladuet-1、prsfduet-1、pllp-ompa、puc系列载体(如，puc18、puc19)，pqe-30、pxh2-1，pxh-43，ptrii，pgsf957。

13、在一个实施方式中，所述宿主细胞选自大肠杆菌(例如，大肠杆菌dh5α、大肠杆菌bl21(de3)、rosetta(de3)、codon plus(de3)-ripl、bl21 codon plus(de3)、top 10、jm109)、酵母菌(例如，酿酒酵母、毕赤酵母、解酯耶氏酵母)、鞘茎点霉真菌。

14、另一方面，本发明还提供了上述细胞色素p450单加氧酶、其编码基因、包含基因的载体、上述宿主细胞、或上述生物材料在制备米卡芬净前体fr901379中的应用。

15、另一方面，本发明还提供了上述细胞色素p450单加氧酶、其编码基因、包含基因的载体、上述宿主细胞、或上述生物材料在制备高产米卡芬净前体fr901379的基因工程菌株中的应用；优选的，所述基因工程菌株的出发菌株为鞘茎点霉属真菌。

16、所述鞘茎点霉属真菌包括coleophoma sp.或c.empetri。

17、在一个具体的实施方式中，鞘茎点霉属真菌为鞘茎点霉(coleophoma sp.)mefc009，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.21058，保藏日期为2020年11月18日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。

18、上述制备高产米卡芬净前体fr901379的基因工程菌株，为在出发菌株中引入上述细胞色素p450单加氧酶；优选的，所述引入为过表达。

19、所述的“引入”包括将上述目的基因在出发菌株中进行表达的步骤，优选，过表达。例如，将目的基因构建到表达载体上，将表达载体转入到宿主细胞中以表达目的基因，优选，过表达。在其他的实施方式中，所述的“引入”包括将目的基因插入到宿主细胞的基因组中；优选的，所述插入到宿主细胞的基因组中可以采用同源重组双交换的方法；在一个实施方式中，可以采用将目的基因以及同源臂插入到载体上，然后将载体转入到宿主细胞中，利用同源臂与宿主细胞基因组发生同源重组双交换从而将目的基因插入到合适的基因组的位置；在其他的实施方式中，还可以采用基因编辑的方式，例如，利用crispr/cas系统在期望的基因组位点上进行切割，同时将目的基因作为外源供体插入到切割位点上。

20、另一方面，本发明还提供了上述基因工程菌株在生产米卡芬净前体fr901379中的应用。

21、另一方面，本发明还提供了一种制备米卡芬净前体fr901379的方法，所述方法包括利用上述基因工程菌株进行发酵的步骤；任选的，所述方法还包括分离/纯化fr901379的步骤。

22、本发明中，fr901379为米卡芬净前体，其结构式如式(i)所示：

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24、本发明中，wf11899b和wf11899c的结构式分别如式(ii)和式(iii)所示：

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27、本发明中还提供了一种化合物，其结构式如式(iv)所示：

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29、另一方面，本发明还提供了一种高产米卡芬净前体fr901379的基因工程菌，所述基因工程菌为过表达上述细胞色素p450单加氧酶的基因工程菌，所述基因工程菌的出发菌株为鞘茎点霉属真菌。

30、在一个实施方式中，所述基因工程菌中过表达第一细胞色素p450单加氧酶；所述第一细胞色素p450单加氧酶与seq id no.2相比具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；优选的，所述第一细胞色素p450单加氧酶来源于鞘茎点霉属真菌；更优选的，所述第一细胞色素p450单加氧酶的氨基酸序列与seq idno.2相比具有至少70％的序列同一性，并且所述第一细胞色素p450单加氧酶来源于鞘茎点霉属真菌。

31、在一个实施方式中，所述基因工程菌中过表达第二细胞色素p450单加氧酶；所述第二细胞色素p450单加氧酶与seq id no.4相比具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；优选的，所述第二细胞色素p450单加氧酶来源于鞘茎点霉属真菌；更优选的，所述第二细胞色素p450单加氧酶的氨基酸序列与seq idno.4相比具有至少70％的序列同一性，并且所述第二细胞色素p450单加氧酶来源于鞘茎点霉属真菌。

32、在一个实施方式中，所述基因工程菌中同时过表达上述第一细胞色素p450单加氧酶和上述第二细胞色素p450单加氧酶。

33、本发明中的“过表达”是指基因工程菌与野生型的出发菌株相比，所述目的基因的表达量或活性要高于野生型的出发菌株。在一个实施方式中，上述过表达可以通过引入表达载体来过表达目的基因来实现；其他的实施方式中，上述过表达也可以通过在出发菌株中引入额外的目的基因的拷贝、通过增加目的基因的拷贝数来实现；其他的实施方式中，还可以通过对目的基因的启动子优化来实现，比如，通过将目的基因的原始启动子替换为启动子活性更高的启动子来实现目的基因的过表达。

34、另一方面，本发明还提供了利用上述基因工程菌株制备/生产米卡芬净前体fr901379的方法，所述方法包括对上述基因工程菌株进行培养的步骤；或者，上述基因工程菌株在制备/生产米卡芬净前体fr901379中的应用。

35、另一方面，本发明还提供了一种制备/生产米卡芬净前体fr901379的方法，所述方法包括利用上述基因工程菌株进行培养的步骤；优选的，所述方法还包括分离/纯化fr901379的步骤。

36、另一方面，本发明还提供了一种高产wf11899b的基因工程菌株，所述wf11899b如上述式ii所示，所述基因工程菌的出发菌株为鞘茎点霉属真菌。进一步的，所述高产wf11899b的基因工程菌株为将出发菌株中的细胞色素p450单加氧酶进行突变所得到的基因工程菌株；所述细胞色素p450单加氧酶与seq id no.2相比具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

37、另一方面，本发明还提供了利用上述基因工程菌株制备/生产wf11899b的方法，所述方法包括对上述基因工程菌株进行培养的步骤；或者，上述基因工程菌株在制备/生产wf11899b中的应用。

38、另一方面，本发明还提供了一种制备/生产wf11899b的方法，所述方法包括利用上述基因工程菌株进行培养的步骤；优选的，所述方法还包括分离/纯化wf11899b的步骤。

39、另一方面，本发明还提供了一种高产式iv所示化合物的基因工程菌株，所述基因工程菌的出发菌株为鞘茎点霉属真菌。进一步的，所述高产式iv所示化合物的基因工程菌株为将出发菌株中的细胞色素p450单加氧酶突变所得到的基因工程菌株；所述细胞色素p450单加氧酶与seq id no.4相比具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

40、另一方面，本发明还提供了利用上述基因工程菌株制备/生产式iv所示化合物的方法，所述方法包括对上述基因工程菌株进行培养的步骤；或者，上述基因工程菌株在制备/生产式iv所示化合物中的应用。

41、另一方面，本发明还提供了一种制备/生产式iv所示化合物的方法，所述方法包括利用上述基因工程菌株进行培养的步骤；优选的，所述方法还包括分离/纯化式iv所示化合物的步骤。

42、本发明所述的突变包括通过基因缺失、基因插入或基因取代的方式导致基因功能或活性丧失。

43、在优选的实施方式中，基因突变为将目标基因进行基因敲除。

44、在一个实施方式中，所述基因突变可以采用本领域常规的技术操作来实现，例如，通过同源重组的方式进行基因敲入或基因敲除从而导致基因功能或活性丧失；或者，采用基因编辑的方式，如锌指核酸内切酶(zfn)、类转录激活因子效应物核酸酶(talen)或crispr技术对上述基因进行突变从而导致基因功能或活性丧失。

45、另一方面，本发明还提供了上述基因工程菌的构建方法。