大规模制备164.88°三螺旋结构胶原蛋白生物方法与流程

本发明涉及利用大规模生物发酵实现具有164.88°三螺旋结构的胶原蛋白制备方法属于合成生物学。

背景技术：

1、人有28种不同的胶原蛋白，胶原蛋白是人和动物体内含量最多的蛋白，占体内蛋白总量的25-30％，约占体重的6％。胶原蛋白是皮肤、骨骼、牙齿、角膜、肌腱、韧带以及各种组织器官中存在的重要的结构蛋白，起支撑和保护机体组织的功能。胶原蛋白是细胞外基质的主要组分，其生物学活性主要表现在促进细胞粘附、生长分化、细胞信号通路的应答、血小板凝集、细胞和组织器官功能的维护和损伤修复等功能。胶原蛋白在空间结构上呈现出三股螺旋缠绕的结构，三条独立的胶原α肽链主要以氢键的形式缠绕形成螺旋结构。在体内胶原蛋白以三螺旋的结构与组织和细胞结合以发挥其生物学效应，因此胶原蛋白的生物学活性很大程度上依赖其天然的三螺旋结构。胶原蛋白优良的生物学活性使其在生物医学材料，医疗美容、化妆品等领域拥有巨大的应用价值和潜力。

2、现在市场上主要的胶原蛋白产品来源于动物组织提取，这种方法在提取的过程中破坏了天然的三螺旋结构，影响了胶原生物学活性的发挥。而且使用动物来源提取工艺得到的胶原蛋白其肽段分子量不均一，可加工性较差。由于动物胶原蛋白与人胶原蛋白在氨基酸序列上存在差异，因此可能会在临床上造成潜在的免疫原性，安全性较差。而且动物组织受其来源的影响需要解决动物病毒的安全隐患才能进入市场。随着市场对胶原蛋白产品安全性、有效性要求的提高，传统的从动物组织中提取胶原蛋白的方式已经无法满足现有市场的需求。而且，以胶原蛋白作为生物材料应用于医疗场景的产品需求量也在日益增大，需要通过别的的途径来解决目前市场上存在的问题。通过基因工程等分子生物学技术来生产具有天然三螺旋结构的重组胶原蛋白在解决以上所述问题方面具有极大的潜力。

3、市场上已经有企业通过基因重组的方式制备iii型胶原蛋白的产品，但是难以实现三螺旋结构，利用合成生物发酵具有正确三螺旋结构的胶原蛋白具有较高技术壁垒。

4、本领域中需要合成生物发酵具有正确三螺旋结构的胶原蛋白的方法。

技术实现思路

1、发明人发现了一种人iii型胶原蛋白，结构研究证实，人iii型胶原蛋白核心功能区具有164.88°三螺旋结构(cn109593126a)。发明人已经通过基因重组的方式，利用大肠杆菌表达系统成功制备了重组ⅲ型人源化胶原蛋白。然而，发明人发现大肠杆菌表达系统存在蛋白表达量有限，工艺放大受限等缺点。因此，发明人尝试以真核表达系统表达人iii型胶原蛋白。经过大量前期筛选工作，发明人发现当以毕赤酵母表达人iii型胶原蛋白时可以体外合成大量具有164.88°三螺旋结构胶原蛋白。发明人在先前的申请中还发现人iii型胶原蛋白在通过大肠杆菌表达时存在细菌内毒素，这增加了胶原蛋白纯化的复杂性和难度。发明人通过在酵母表达系统中表达胶原蛋白消除了该技术问题。

2、本发明通过改造“底盘细菌”获得了大规模生产，具有164.88°三螺旋结构的重组人源化胶原蛋白，属于a型，通过大规模生产能够满足市场需求。

3、在一方面，提供了一种构建表达胶原蛋白的酵母细胞的方法，其包括将重组表达载体导入酵母细胞中，其中重组表达载体包含编码胶原蛋白的多核苷酸，所述胶原蛋白包含以seq id no.1所示的序列的重复单元，重复单元的数目是2-32，重复单元是直接连接的。在一个实施方案中，胶原蛋白是重组ⅲ型人源化胶原蛋白。在一个实施方案中，胶原蛋白是164.88°三螺旋结构胶原蛋白。

4、在一个实施方案中，胶原蛋白包含seq id no.2或3所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，多核苷酸包含seq id no.4或5所示的核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以在酵母宿主细胞中有效表达胶原蛋白。

5、在一个实施方案中，重组表达载体是酵母系统表达载体。在一个实施方案中，酵母系统表达载体为ppiczαa、ppic9、ppic9k、phil-s1、或pyam75p载体。

6、在一个实施方案中，酵母是巴斯德毕赤酵母。在一个实施方案中，巴斯德毕赤酵母是巴斯德毕赤酵母x33、gs115、smd1168、km71或km71h菌株。

7、在一个实施方案中，方法包括以下一个或多个步骤：

8、(1)将多核苷酸插入表达载体，优选ppiczalαa表达载体的noti和xhoi酶切位点之间，以得到重组表达质粒；

9、(2)对重组表达质粒进行酶切，优选用sac1进行酶切；

10、(3)对酶切后的重组表达质粒进行纯化；

11、(4)通过电转化，将酶切后的重组表达质粒导入酵母细胞中。

12、在另一个方面，提供了表达胶原蛋白的酵母细胞，其中所述胶原蛋白包含以seqid no.1所示的序列的重复单元，重复单元的数目是2-32，重复单元是直接连接的；酵母细胞是巴斯德毕赤酵母。

13、在一个实施方案中，巴斯德毕赤酵母是巴斯德毕赤酵母x33、gs115、smd1168、km71或km71h菌株。在一个实施方案中，胶原蛋白包含seq id no.2或3所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，胶原蛋白是重组ⅲ型人源化胶原蛋白。在一个实施方案中，胶原蛋白是164.88°三螺旋结构胶原蛋白。

14、在一个实施方案中，酵母细胞包含酵母系统表达载体。在一个实施方案中，酵母系统表达载体为ppiczαa、ppic9、ppic9k、phil-s1、或pyam75p载体。在一个实施方案中，表达载体包含多核苷酸，该多核苷酸包含seq id no.2或3所示的核苷酸序列。

15、在另一个方面，提供了本文所述的酵母细胞用于制备胶原蛋白的用途。

16、在一个实施方案中，胶原蛋白包含以seq id no.1所示的序列的重复单元，重复单元的数目是2-32，重复单元是直接连接的。在一个实施方案中，胶原蛋白包含seq id no.2或3所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，胶原蛋白是重组ⅲ型人源化胶原蛋白。在一个实施方案中，胶原蛋白是164.88°三螺旋结构胶原蛋白。

17、在另一个方面，提供了通过发酵生产胶原蛋白的方法，其包括在合适的条件下培养本文所述的酵母细胞，对酵母细胞添加甲醇以进行诱导表达，并且收获培养上清液以得到胶原蛋白。

18、在一个实施方案中，培养基为补充有无氨基酵母氮源和生物素的bmmy培养基。

19、在一个实施方案中，胶原蛋白包含以seq id no.1所示的序列的重复单元，重复单元的数目是2-32，重复单元是直接连接的。在一个实施方案中，胶原蛋白包含seq id no.2或3所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，胶原蛋白是重组ⅲ型人源化胶原蛋白，优选164.88°三螺旋结构胶原蛋白。

20、本发明的优点包括：

21、1.发明人发现了适合于表达重组ⅲ型人源化胶原蛋白的酵母细胞、其构建方法和生产方法；

22、2.本发明的酵母细胞是巴斯德毕赤酵母相比于原核表达系统，诸如大肠杆菌具有表达量大、工艺可放大的优点；

23、3.本发明的方法体外合成具有164.88°三螺旋结构胶原蛋白，实现吨级大规模量产，具有重要产业意义；

24、4.本发明可以不需要消除细胞内毒素的步骤。