一种冠状病毒的通用疫苗及其应用

1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种冠状病毒异源四聚体抗原蛋白、其制备方法、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、包含该核酸构建体的重组载体、表达系统细胞、及它们在制备通用疫苗中的应用和作为冠状病毒通用疫苗的免疫原性组合物，以及它们在制备预防或冠状病毒的药物中的应用。


背景技术：

2.冠状病毒属于套式病毒目(nidovirales)冠状病毒科(coronaviridae)冠状病毒属(coronavirus)，是有囊膜的正链rna病毒，在所有rna病毒中基因组最大。冠状病毒主要感染哺乳动物和鸟类。到目前为止，有7种冠状病毒能感染人，其中hcov-nl63、hcov-229e、hcov-oc43和hcov-hku1这四种冠状病毒只会使人患轻度感冒，患者很快就能恢复；还有三种冠状病毒能使人致死，分别是2002-2003年流行的严重呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、2012年暴发并持续至今的中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)以及当前仍在流行的新型冠状病毒(sars-cov-2)。此外，在蝙蝠和穿山甲等野生动物体内发现了较多冠状病毒，如：2013年从菊头蝠中分离到的ratg13、2013年石正丽团队从云南的菊头蝠中分离到的sars相关的冠状病毒rsshc014以及属于rs3367分支的wiv1、2014年吉林省的军事兽医研究所与云南省的地方病防治研究所合作分离到了与sars-cov基因组有91％同源性的毒株lyra11、2019年由山东医学科学院新发传染病病因学与流行病学重点实验室从云南省的蝙蝠样品中分离到了一种与sars-cov-2基因组同源性达93.3％的病毒rmyn02、2020年柬埔寨的巴斯德研究所从菊头蝠中分离到了与sars-cov-2基因组92.6％同源性的病毒株rshstt182以及从穿山甲中分离到的与sars-cov-2序列同源性达90％左右的病毒株pangolin gd/1和pangolin gx-p4l，但毒株的差异使得疫苗诱导机体产生的抗体发生免疫逃逸。因此，研究一款通用疫苗十分关键。
3.冠状病毒的刺突蛋白(s蛋白)是病毒识别宿主细胞受体的“钥匙”，辅助病毒入侵细胞。s蛋白含有s1和s2亚基，s1亚基中的受体结合结构域(rbd)负责与宿主受体蛋白的结合。目前为止，大多数针对冠状病毒具有强中和活性的抗体都是靶向rbd的，因此，rbd通常被选为疫苗的设计靶点，我们基于rbd设计了通用疫苗。


技术实现要素：

4.发明目的
5.本发明的目的在于提供一种冠状病毒异源四聚体抗原蛋白、其制备方法、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的核酸构建体、包含该核酸构建体的重组载体、表达系统细胞、及它们在制备通用疫苗中的应用和作为冠状病毒通用疫苗的免疫原性组合物，以及它们在制备预防或冠状病毒的药物中的应用。
6.本发明通过采用不同来源的冠状病毒的抗原分子构成异源四聚体抗原蛋白，不仅能够正确表达、而且表达量稳定，表达的抗原能够诱导机体产生更多、更广谱的针对不同毒
株甚至各种新冠变异株的中和抗体。尤其是异源四聚体抗原蛋白p-b-shc-s、p-b-ly-s不仅能有效诱导机体产生中和抗体，而且结构稳定，不易降解。
7.解决方案
8.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
9.第一方面，本发明提供了一种冠状病毒异源四聚体抗原蛋白，其包含直接串联或通过连接序列串联的、四种不同冠状病毒病毒株的刺突蛋白的受体结合区(rbd)的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列；
10.所述四种不同冠状病毒选自下组中的四种：sars-cov-2原型毒株、sars-cov-2变异毒株、冠状病毒rsshc014株、冠状病毒lyra11株、冠状病毒ratg13株、冠状病毒pangolin gx/p4l株、冠状病毒pangolin gd/1株、冠状病毒wiv1株、冠状病毒rshstt182株、冠状病毒btky72株、冠状病毒rmyn02株、冠状病毒sars-cov、冠状病毒mers-cov、冠状病毒hcov-229e、冠状病毒hcov-oc43、冠状病毒hcov-nl63、冠状病毒hcov-hku1、冠状病毒bat-cov。
11.进一步地，所述四种不同冠状病毒，可选地，选自下组中的四种：sars-cov-2原型毒株、sars-cov-2变异毒株、冠状病毒rsshc014株、冠状病毒lyra11株、冠状病毒ratg13株、冠状病毒pangolin gx/p4l株、冠状病毒pangolin gd/1株、冠状病毒wiv1株、冠状病毒rshstt182株、冠状病毒btky72株、冠状病毒rmyn02株、sars-cov。
12.进一步地，所述四种不同冠状病毒选自下组中的四种：sars-cov-2原型毒株、sars-cov-2变异毒株、冠状病毒rsshc014株、冠状病毒lyra11株、冠状病毒ratg13株、冠状病毒pangolin gx/p4l株、冠状病毒sars-cov。
13.进一步地，所述四种不同冠状病毒的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列的串联顺序为：按病毒株同源性从高到低的顺序进行串联。
14.进一步地，所述异源四聚体抗原蛋白包含直接串联或通过连接序列串联的、如下四种氨基酸序列：
15.(a)sars-cov-2原型毒株的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列，其中sars-cov-2原型毒株的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列为其全部氨基酸序列的至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％；
16.(b)sars-cov-2变异毒株的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列，其中sars-cov-2变异毒株的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列为其全部氨基酸序列的至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％；
17.(c)冠状病毒x株的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列，其中冠状病毒x株的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列为其全部氨基酸序列的至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％；
18.(d)sars-cov的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列，其中sars-cov株的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列为其全部氨基酸序列的至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％；
19.其中，冠状病毒x株选自冠状病毒rsshc014株、冠状病毒lyra11株、冠状病毒ratg13株、冠状病毒pangolin gx/p4l株中的至少一种；可选地冠状病毒x株选自冠状病毒rsshc014株或冠状病毒lyra11株；
20.其中，sars-cov-2变异毒株选自alpha、beta、gamma、kappa、lambda、delta或
omicron毒株，可选地，sars-cov-2变异毒株为beta毒株。
21.进一步地，所述串联为直接串联；
22.作为一种可替代的方案，所述串联通过连接序列串联，可选地连接序列为(ggs)n；其中，n＝1,2,3,4或5；
23.进一步地，所述四种氨基酸序列的串联顺序依次为(a)、(b)、(c)、(d)的氨基酸序列。
24.进一步地，所述异源四聚体抗原蛋白包含直接串联或通过连接序列串联的、如下四种氨基酸序列：
25.(a)如seq id no:1所示的氨基酸序列，或与如seq id no:1所示的氨基酸序列具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；或优选与如seq id no:1所示的氨基酸序列具有一个、两个、三个或四个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的氨基酸序列且与其具有相同或基本相同的免疫原性，该新的氨基酸序列也视为包含在本发明的保护范围之内；
26.(b)如seq id no:2所示的氨基酸序列，或与如seq id no:2所示的氨基酸序列具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；或优选与如seq id no:2所示的氨基酸序列具有一个、两个、三个或四个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的氨基酸序列且与其具有相同或基本相同的免疫原性，该新的氨基酸序列也视为包含在本发明的保护范围之内；
27.(c)如seq id no:3、5、6或7所示的氨基酸序列；或与如seq id no:3、5、6或7所示的氨基酸序列具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；或优选与如seq id no:3、5、6或7所示的氨基酸序列具有一个、两个、三个或四个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的氨基酸序列且与其具有相同或基本相同的免疫原性，该新的氨基酸序列也视为包含在本发明的保护范围之内；
28.优选地，(c)氨基酸序列优选如seq id no:6或7所示的氨基酸序列；或与如seq id no:6或7所示的氨基酸序列具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；或优选与如seq id no:6或7所示的氨基酸序列具有一个、两个、三个或四个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的氨基酸序列且与其具有相同或基本相同的免疫原性，该新的氨基酸序列也视为包含在本发明的保护范围之内；
29.(d)如seq id no:4所示的氨基酸序列；或与如seq id no:4所示的氨基酸序列具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；或优选与如seq id no:4所示的氨基酸序列具有一个、两个、三个或四个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的氨基酸序列且与其具有相同或基本相同的免疫原性，该新的氨基酸序列也视为包含在本发明的保护范围之内。
30.可选地，所述串联为直接串联；
31.作为一种可替代的技术方案，所述串联通过连接序列串联，可选地连接序列为(ggs)n；其中，n＝1,2,3,4或5。
32.在一些实施例中，氨基酸序列(a)、(b)、(c)、(d)的连接顺序可以改变或替换为相
应变异毒株的rbd氨基酸序列，也能获得广谱的免疫应答。尤其是氨基酸序列(a)、(b)均来源于新冠病毒毒株，其连接顺序的改变或替换也能获得广谱的免疫应答。
33.进一步地，所述异源四聚体抗原蛋白包含如seq id no:8、9、10或11所示的氨基酸序列；或包含与如seq id no:8、9、10或11所示的氨基酸序列具有至少90％、92％、95％，96％，97％，98％或99％序列同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；或包含与如seq id no:8、9、10或11所示的氨基酸序列具有一个、两个、三个或四个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的氨基酸序列且与其具有相同或基本相同的免疫原性，该新的氨基酸序列也视为包含在本发明的保护范围之内；
34.进一步地，所述异源四聚体抗原蛋白包含如seq id no:10或11所示的氨基酸序列；或包含与如seq id no:10或11所示的氨基酸序列具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；或包含与如seq id no:10或11所示的氨基酸序列具有一个、两个、三个或四个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的氨基酸序列且与其具有相同或基本相同的免疫原性，该新的氨基酸序列也视为包含在本发明的保护范围之内。
35.上述序列中，如seq id no:1所示的氨基酸序列为冠状病毒sars-cov-2原型毒株的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列(genbank：nc_045512.2)，seq id no:1所示的氨基酸序列具体可以如下：
36.rvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknk
37.上述序列中，如seq id no:2所示的氨基酸序列为冠状病毒sars-cov-2变异毒株(beta)的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列(gisaid：epi_isl_825109)，seq id no:2所示的氨基酸序列具体可以如下：
38.rvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgniadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvkgfncyfplqsygfqptygvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknk
39.上述序列中，如seq id no:3所示的氨基酸序列为冠状病毒ratg13的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列(genbank：mn996532.2)，seq id no:3所示的氨基酸序列具体可以如下：
40.rvqptdsivrfpnitnlcpfgevfnattfasvyawnrkrisncvadysvlynstsfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvitgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnskhidakeggnfnylyrlfrkanlkpferdisteiyqagskpcngqtglncyyplyrygfyptdgvghqpyrvvvlsfellnapatvcgpkkstnlvknk
41.上述序列中，如seq id no:4所示的氨基酸序列为冠状病毒sars-cov的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列(genbank：aas00003.1)，seq id no:4所示的氨基酸序列具体可以如下：
42.rvvpsgdvvrfpnitnlcpfgevfnatkfpsvyawerkkisncvadysvlynstffstfkcygvsatklndlcfsnvyadsfvvkgddvrqiapgqtgviadynyklpddfmgcvlawntrnidatstgnynykyrylrhgklrpferdisnvpfspdgkpctppalncywplndygfytttgigyqpyrvvvlsfellnapatvcgpklstdliknq
43.上述序列中，如seq id no:5所示的氨基酸序列为冠状病毒pangolin gx/p4l的刺
突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列(genbank：mt040333.1)，seq id no:5所示的氨基酸序列具体可以如下：
44.rvqptisivrfpnitnlcpfgevfnaskfasvyawnrkrisncvadysvlynstsfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvvkgdevrqiapgqtgviadynyklpddftgcviawnsvkqdaltggnygylyrlfrksklkpferdisteiyqagstpcngqvglncyyplerygfhpttgvnyqpfrvvvlsfellngpatvcgpklsttlvkdk
45.上述序列中，如seq id no:6所示的氨基酸序列为冠状病毒lyra11的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列(genbank：kf569996.1)，seq id no:6所示的氨基酸序列具体可以如下：
46.rvspskevvrfpnitnlcpfgevfnattfpsvyawerkrisncvadysvlynstsfstfkcygvsaiklndlcfsnvyadsfvvkgddvrqiapgqtgviadynyklpddfmgcvlawntrnidatssgnfnykyrslrhgklrpferdisnvpfspdgkpctppafncywplndygfyttngigyqpyrvvvlsfellnapatvcgpklstdlitnq
47.上述序列中，如seq id no:7所示的氨基酸序列为冠状病毒rsshc014的刺突蛋白的受体结合区的部分氨基酸序列或全部氨基酸序列(genbank：kc881005.1)，seq id no:7所示的氨基酸序列具体可以如下：
48.rvapskevvrfpnitnlcpfgevfnattfpsvyawerkrisncvadysvlynstsfstfkcygvsatklndlcfsnvyadsfvvkgddvrqiapgqtgviadynyklpddflgcvlawntnskdsstsgnynylyrwvrrsklnpyerdlsndiyspggqscsavgpncynplrpygffttagvghqpyrvvvlsfellnapatvcgpklstdliknq
49.seq id no:1、2、3、4直接依次串联而成的异源四聚体抗原蛋白的氨基酸序列如seq id no:8所示，编码其的核苷酸序列如seq id no:12所示。
50.seq id no:1、2、5、4直接依次串联而成的异源四聚体抗原蛋白的氨基酸序列如seq id no:9所示，编码其的核苷酸序列如seq id no:13所示。
51.seq id no:1、2、6、4直接依次串联而成的异源四聚体抗原蛋白的氨基酸序列如seq id no:10所示，编码其的核苷酸序列如seq id no:14所示。
52.seq id no:1、2、7、4直接依次串联而成的异源四聚体抗原蛋白的氨基酸序列如seq id no:11所示，编码其的核苷酸序列如seq id no:15所示。
53.进一步地，所述异源四聚体抗原蛋白的氨基酸序列的n端和/或c端还连接有信号肽和/或标签；可选地，所述异源四聚体抗原蛋白的氨基酸序列的n端连接有信号肽，c端连接有标签；可选地，所述标签选自flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签、sumo标签中的至少一种；优选地标签为his标签；可选地信号肽为mers-cov刺突蛋白的信号肽。
54.第二方面，提供一种制备第一方面所述的冠状病毒异源四聚体抗原蛋白的方法，包括以下步骤：在编码第一方面所述的冠状病毒异源四聚体抗原蛋白的核苷酸序列的5’端加入编码信号肽的序列，3’端加上编码标签的序列，进行克隆表达，筛选正确的重组子，然后转染表达系统的细胞进行表达，表达后收集细胞上清，纯化得到冠状病毒异源四聚体抗原蛋白；可选地，所述标签选自flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签、sumo标签中的至少一种；优选地标签为his标签；可选地，所述信号肽为mers-cov刺突蛋白的信号肽。
55.进一步地，所述表达系统的细胞包括为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞，可选地；所述哺乳动物细胞包括hek293t、hek293f细胞或cho细胞，所述细菌细胞包括
大肠杆菌细胞。
56.第三方面，提供一种编码第一方面所述的冠状病毒异源四聚体抗原蛋白的多核苷酸，可选地，所述多核苷酸序列包含如seq id no:12、13、14和/或15所示的核苷酸序列。
57.第四方面，提供一种核酸构建体，其包含第三方面所述的多核苷酸。可选地，还包含mers的信号肽的编码序列、启动子序列、标签序列和/或酶切位点序列。例如，异源四聚体抗原蛋白的四种序列排序可以为：kozak序列-信号肽-第一个rbd基因-第二个rbd基因-第三个rbd基因-第四个rbd基因-组氨酸标签-终止密码子。
58.第五方面，提供一种包括第四方面所述的核酸构建体的重组载体。
59.第六方面，提供一种包括第五方面所述的重组载体的表达系统细胞；优选地，所述表达系统细胞为哺乳动物细胞；进一步优选地，所述哺乳动物细胞为hek293t、hek293f细胞或cho细胞。
60.第七方面，提供一种第一方面所述的冠状病毒异源四聚体抗原蛋白、第三方面所述的多核苷酸、第四方面所述的核酸构建体、第五方面所述的重组载体或第六方面所述的表达系统细胞在制备冠状病毒的通用疫苗中的应用。
61.优选地，所述疫苗用于单独免疫或者与其他类型的新型冠状病毒疫苗进行序贯免疫。
62.第八方面，提供一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含第一方面所述的冠状病毒异源四聚体抗原蛋白、或第二方面所述的方法制备的异源四聚体抗原蛋白、或第三方面所述的多核苷酸、或第四方面所述的核酸构建体、或第五方面所述的重组载体、或第六方面所述的表达系统细胞，以及生理学可接受的媒介物、佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂。
63.进一步地，所述免疫原性组合物为冠状病毒蛋白通用疫苗，其包括：
64.(1)第一方面所述的冠状病毒异源四聚体抗原蛋白；优选包含如seq id no:8、9、10和/或11所示的氨基酸序列，或优选包含在如seq id no:8、9、10和/或11所示的氨基酸序列上带有信号肽序列和/或标签氨基酸序列的氨基酸序列；和
65.(2)佐剂；
66.可选地，所述佐剂选自铝佐剂、mf59佐剂和类mf59佐剂；可选地，类mf59佐剂包括addavax佐剂；
67.可选地，第一方面所述的冠状病毒异源四聚体抗原蛋白和佐剂的体积比为1：1-2；可选地，体积比为1：1。
68.在一些实施例中，免疫原性组合物为冠状病毒蛋白通用疫苗可以为多种异源四聚体抗原蛋白的混合物。
69.进一步地，所述免疫原性组合物为冠状病毒dna通用疫苗，其包括：
70.(i)真核表达载体；和
71.(ii)构建入所述真核表达载体中的、编码如第一方面所述的冠状病毒异源四聚体抗原蛋白的dna序列；可选地，所述dna序列包含如seq id no:12、13、14和/或15所示的核苷酸序列；
72.优选地，所述真核表达载体选自pgx0001、pvax1、pcaggs和pcdna系列载体。
73.进一步地，所述免疫原性组合物为冠状病毒mrna通用疫苗，其包括：
74.(i)编码如权利要求1-5之一所述的冠状病毒异源四聚体抗原蛋白的mrna序列；和(ii)脂质纳米颗粒。
75.进一步地，所述免疫原性组合物为冠状病毒-病毒载体疫苗，其包括：
76.(
①
)病毒骨架载体；和
77.(
②
)构建入所述病毒骨架载体中的、编码如第一方面所述的冠状病毒异源四聚体抗原蛋白的dna序列；可选地，所述dna序列包含如seq id no:12、13、14和/或15所示的核苷酸序列；
78.优选地，所述病毒骨架载体选自以下病毒载体中的一种或几种：腺病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体、腺相关病毒载体。
79.进一步地，所述免疫原性组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
80.优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
81.优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂；
82.优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。
83.第九方面，提供一种第一方面所述的冠状病毒异源四聚体抗原蛋白、或第二方面所述的方法制备的异源四聚体抗原蛋白、或第三方面所述的多核苷酸、第四方面所述的核酸构建体、或第五方面所述的重组载体、或第六方面所述的表达系统细胞、或第八方面所述的免疫原性组合物在制备治疗和/或预防新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的疾病的药物中的用途；
84.可选地，冠状病毒包括sars-cov-2原型毒株、sars-cov-2变异毒株、冠状病毒rsshc014株、冠状病毒lyra11株、冠状病毒ratg13株、冠状病毒pangolin gx/p4l株、冠状病毒pangolin gd/1株、冠状病毒wiv1株、冠状病毒rshstt182株、冠状病毒btky72株、冠状病毒rmyn02株、冠状病毒sars-cov、冠状病毒mers-cov、冠状病毒hcov-229e、冠状病毒hcov-oc43、冠状病毒hcov-nl63、冠状病毒hcov-hku1、冠状病毒bat-cov中的至少一种或多种。
85.第十方面，提供一种引发受试者针对冠状病毒的免疫应答或治疗受试者的冠状病毒感染的方法，向所述受试者施用有效剂量的如第一方面所述的冠状病毒异源四聚体抗原蛋白、或第二方面所述的方法制备的异源四聚体抗原蛋白、或第三方面所述的多核苷酸、第四方面所述的核酸构建体、或第五方面所述的重组载体、或第六方面所述的表达系统细胞、或第八方面所述的免疫原性组合物；
86.可选地，冠状病毒包括sars-cov-2原型毒株、sars-cov-2变异毒株、冠状病毒rsshc014株、冠状病毒lyra11株、冠状病毒ratg13株、冠状病毒pangolin gx/p4l株、冠状病毒pangolin gd/1株、冠状病毒wiv1株、冠状病毒rshstt182株、冠状病毒btky72株、冠状病毒rmyn02株、冠状病毒sars-cov、冠状病毒mers-cov、冠状病毒hcov-229e、冠状病毒hcov-oc43、冠状病毒hcov-nl63、冠状病毒hcov-hku1、冠状病毒bat-cov中的至少一种或多种。
87.进一步地，上述sars-cov-2变异毒株选自alpha、beta、gamma、kappa、lambda、delta或omicron毒株，可选地，sars-cov-2变异毒株选自beta毒株。
88.有益效果
89.本发明异源四聚体可以激发产生多种冠状病毒株(sars-cov-2原型毒株、变异毒
株及其它冠状病毒pangolin gx/p4l、shc014、wiv1、lyra11、sars-cov等)更强的中和抗体水平，即具有良好的免疫原性和广谱性，且异源四聚体抗原蛋白p-b-ly-s和p-b-shc-s相对p-b-ra-s及p-b-pggx-s的稳定性和免疫原性效果都更均衡、更稳定。
附图说明
90.一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
91.图1是代表性毒株的rbd进化树；
92.图2是本发明实施例1的四种异源四聚体的构建示意图；
93.图3是本发明实施例1的四种异源四聚体的分子筛洗脱峰及sds-page胶图；
94.图4是本发明实施例2的p-p-p-p的分析型超速离心结果；其中，4℃,1w代表4℃放置一周；4℃,2w代表4℃放置两周；4℃,3w代表4℃放置三周；
95.图5是本发明实施例2的p-b-ra-s的分析型超速离心结果；其中，4℃,1w代表4℃放置一周；4℃,2w代表4℃放置两周；4℃,3w代表4℃放置三周；
96.图6是本发明实施例2的p-b-pggx-s的分析型超速离心结果；其中，4℃,1w代表4℃放置一周；4℃,2w代表4℃放置两周；4℃,3w代表4℃放置三周；
97.图7是本发明实施例2的p-b-ly-s的分析型超速离心结果；其中，4℃,1w代表4℃放置一周；4℃,2w代表4℃放置两周；4℃,3w代表4℃放置三周；
98.图8是本发明实施例2的p-b-shc-s的分析型超速离心结果；其中，4℃,1w代表4℃放置一周；4℃,2w代表4℃放置两周；4℃,3w代表4℃放置三周；
99.图9是本发明的实施例3的实验分组；
100.图10是本发明的实施例3的免疫和采血流程；
101.图11是本发明的实施例5的小鼠血清中对sars-cov-2原型毒株假病毒的中和抗体水平；
102.图12是本发明的实施例5的小鼠血清中对sars-cov-2beta变异毒株假病毒的中和抗体水平；
103.图13是本发明的实施例5的小鼠血清中对sars-cov-2delta变异株假病毒的中和抗体水平；
104.图14是本发明的实施例5的小鼠血清中对sars-cov-2omicron(ba.1)变异株假病毒的中和抗体水平；
105.图15是本发明的实施例5的小鼠血清中对冠状病毒pangolin gd/1假病毒的中和抗体水平；
106.图16是本发明的实施例5的小鼠血清中对冠状病毒ratg13假病毒的中和抗体水平；
107.图17是本发明的实施例5的小鼠血清中对冠状病毒shc014假病毒的中和抗体水平；
108.图18是本发明的实施例5的小鼠血清中对冠状病毒wiv1假病毒的中和抗体水平；
109.图19是本发明的实施例5的小鼠血清中对冠状病毒lyra11假病毒的中和抗体水
平；
110.图20是本发明的实施例5的小鼠血清中对冠状病毒sars-cov假病毒的中和抗体水平；
111.图21是本发明的实施例5的不同抗原免疫小鼠的二免血清中中和抗体水平统计学差异分析；
112.图22是本发明的实施例5的不同抗原免疫小鼠的三免血清中中和抗体水平统计学差异分析。
具体实施方式
113.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
114.另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
115.以下，对本发明进行详述。
116.本发明以下实施例中所使用的试剂、酶、培养基、抗生素和牛奶等化学材料均为市售产品。
117.一些常用的生物材料，如感受态细胞、载体、待转化的细胞、鼠源杂交瘤细胞、protein a等也为市售产品。
118.一些合成类生物材料，例如假病毒核苷酸序列等需要人工合成的材料，均委托合成公司完成。
119.实施例1：异源四聚体的构建和表达纯化
120.本实施例中，分别设计了四种异源四聚体抗原蛋白的构建体，具体方案如下：
121.(1)将原型sars-cov-2(氨基酸序列如seq id no:1所示)、sars-cov-2beta变异株(氨基酸序列如seq id no:2所示)、ratg13(氨基酸序列如seq id no:3所示)、sars-cov(氨基酸序列如seq id no:4所示)的s蛋白氨基酸序列中的rbd序列串联起来，得到如seq id no:8所示的氨基酸序列，在如seq id no:8所示的氨基酸序列的n端加上mers-cov刺突蛋白的信号肽(mihsvfllmflltptes，如seq id no:16)，c端加上6个组氨酸(hhhhhh)，得到异源四聚体抗原蛋白p-b-ra-s的构建体；
122.(2)将原型sars-cov-2(氨基酸序列如seq id no:1所示)、sars-cov-2beta变异株(氨基酸序列如seq id no:2所示)、pangolin gx/p4l(氨基酸序列如seq id no:5所示)、sars-cov(氨基酸序列如seq id no:4所示)的s蛋白氨基酸序列中的rbd序列串联起来得到如seq id no:9所示的氨基酸序列，在如seq id no:9所示的氨基酸序列的n端加上mers-cov刺突蛋白的信号肽(mihsvfllmflltptes，如seq id no:16)，c端加上6个组氨酸
(hhhhhh)，得到异源四聚体抗原蛋白p-b-pggx-s的构建体；
123.(3)将原型sars-cov-2(氨基酸序列如seq id no:1所示)、sars-cov-2beta变异株(氨基酸序列如seq id no:2所示)、lyra11(氨基酸序列如seq id no:6所示)、sars-cov(氨基酸序列如seq id no:4所示)的s蛋白氨基酸序列中的rbd序列串联起来得到如seq id no:10所示的氨基酸序列，在如seq id no:10所示的氨基酸序列的n端加上mers-cov刺突蛋白的信号肽(mihsvfllmflltptes，如seq id no:16)，c端加上6个组氨酸(hhhhhh)，得到异源四聚体抗原蛋白p-b-ly-s的构建体；
124.(4)将原型sars-cov-2(氨基酸序列如seq id no:1所示)、sars-cov-2beta变异株(氨基酸序列如seq id no:2所示)、rsshc014(氨基酸序列如seq id no:7所示)、sars-cov(氨基酸序列如seq id no:4所示)的s蛋白氨基酸序列中的rbd序列串联起来得到如seq id no:11所示的氨基酸序列，在如seq id no:11所示的氨基酸序列的n端加上mers-cov刺突蛋白的信号肽(mihsvfllmflltptes，如seq id no:16)，c端加上6个组氨酸(hhhhhh)，得到异源四聚体抗原蛋白p-b-shc
–
s的构建体。
125.本实施例选取的病毒株的rbd同源性远近如图1所示。
126.本实施例中异源四聚体抗原蛋白的表达与纯化：
127.将上述设计的四种构建体的氨基酸序列使用人源密码子优化，对应的dna编码序列分别如seq id no:17、18、19、20所示；在这些dna编码序列的3’端加上终止密码子，包含终止密码子的四个dna序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，通过ecori和xhoi酶切位点克隆到pcaggs质粒，分别获得表达异源四聚体抗原蛋白p-b-ra-s、p-b-pggx-s、p-b-ly-s、p-b-shc-s的表达载体。
128.异源四聚体构建体p-b-ra-s、p-b-pggx-s、p-b-ly-s、p-b-shc-s的核苷酸序列的示意图可以如图2所示。同样地，同源四聚体构建体的示意图参考图2，区别在于，四聚体抗原蛋白部分为4个重复的sars-cov-2(原型毒株)的rbd序列(seq id no:1)直接串联而成，同源二聚体蛋白部分为2个重复的sars-cov-2(原型毒株)的rbd序列(seq id no:1)直接串联而成。
129.将上述四种异源四聚体的表达载体经哺乳系统(例如hek293f细胞)表达后纯化过superdex200 hiload 16/60柱子(ge)进行分子筛层析，峰图如图3所示。取洗脱体积在65ml附近的蛋白进行sds-page分析，还原与非还原条件下的蛋白条带都在120kd左右，说明构建的表达载体都能稳定表达得到异源四聚体抗原蛋白p-b-ra-s、p-b-pggx-s、p-b-ly-s、p-b-shc-s，且表达量稳定，平均每400ml可纯化得到8-12mg蛋白。
130.实施例2：抗原蛋白的稳定性评估
131.1.操作步骤
132.(1)准备蛋白样品：将-80℃冻存的四种异源四聚体抗原蛋白和同源四聚体抗原蛋白分装至0.3mg/管，每种蛋白准备四管，分别于4℃放3周、2周、1周和-80℃保存，将每种蛋白于4℃放3周、2周、1周的样品同时检测，-80℃的样品单独检测。
133.检测前加入蛋白缓冲液1
×
pbs至体积为400μl，以12000rpm/min的转速，4℃离心30min后将上清转移至新的ep管中；
134.(2)仪器运行前以3000rpm/min的转速下进行径向校准，查看紫外吸收、od值等参数，时间为10min。然后20℃零转速平衡1h。
no:21～30所示，编码其的核苷酸序列由苏州金唯智或金斯瑞提供合成服务。
149.包装得到的冠状病毒的假病毒中sars-cov-2原型、sars-cov-2beta变异株、delta、omicron(ba.1)用vero检测，其它毒株用hek293t-ace2细胞检测。
150.实施例5：免疫血清的假病毒中和实验
151.1.操作步骤
152.(1)细胞铺板：假病毒中和实验前一天用胰酶消化对数生长期的vero细胞或者hek293t-ace2细胞，计数，每孔100μl加入96孔板中，37℃培养箱、5％co2培养过夜。
153.(2)稀释血清：起始40倍稀释，后面两倍梯度稀释，一免血清8个梯度，二免血清11个梯度。
154.(3)稀释病毒：各假病毒分别用10％fbs的dmem稀释适当倍数，充分颠倒混匀，每孔的血清和病毒体积按1：1混匀，即120μl/孔。
155.(4)每块板做一列阳性对照(10％fbs的dmem与假病毒的等体积混合液)，每批中和实验做一列阴性对照(细胞中只有10％fbs的dmem)。圆底96孔板中的血清和假病毒混合液于37℃、5％co2培养箱中孵育1小时。
156.(5)转板：将前一天铺好的96孔平底板中的细胞上清扣干，转移血清和假病毒的混合液100μl到平底板的细胞中。37℃、5％co2培养箱孵育15小时，即可用激光共聚焦高内涵分析成像系统(yokogawa，cq1)进行读数。
157.2.数据分析
158.实施例3中初免后19天、二免后14天、三免后7天采集的血清中针对不同毒株假病毒的中和抗体水平结果如图11-20所示。
159.图11-16的三免(boost2)血清的结果显示，四种异源四聚体抗原蛋白激发产生的对sars-cov-2原型毒株及与原型毒株rbd同源性90％以上毒株的中和抗体水平已经和同源二聚体抗原蛋白p-p和同源四聚体抗原蛋白p-p-p-p的效果持平甚至更优，四种异源四聚体抗原蛋白对omicron(ba.1)的中和抗体水平相对同源四聚体p-p-p-p还具有一定程度的提高。
160.图17-20的二免(boost)血清结果显示，针对与sars-cov-2原型毒株rbd同源性达70％-80％的毒株(如shc014、wiv1、lyra11、sars-cov)四种异源四聚体抗原蛋白诱导产生的中和抗体水平都显著高于同源四聚体抗原蛋白和同源二聚体抗原蛋白，且异源四聚体抗原蛋白p-b-ly-s和p-b-shc-s对四种毒株的中和效果相比较同源二聚体和同源四聚体都能达到极显著水平，且相对另两种异源四聚体p-b-ra-s和p-b-pggx-s对四种毒株的中和效果也能达到显著水平。
161.图17-20的三免(boost)血清结果显示，四种异源四聚体抗原蛋白激发产生的对与sars-cov-2原型毒株rbd同源性达70％-80％的毒株(如shc014、wiv1、lyra11、sars-cov)中和水平也显著更强，尤其是异源四聚体抗原蛋白p-b-ly-s和p-b-shc-s对该四种毒株的中和抗体水平相比较同源二聚体和同源四聚体都能达到极显著水平(图22)。
162.图11-22的结果表明，对sars-cov-2原型毒株及亲缘关系近的毒株，异源四聚体抗原蛋白与现有针对原型毒株设计的疫苗有相似的效果；另外，异源四聚体抗原蛋白能激发产生明显更多交叉中和亲缘关系更远毒株(shc014、wiv1、lyra11、sars)的中和抗体，即异源四聚体的广谱性更强。
163.综上所述，对于原型毒株及亲缘关系近的毒株，异源四聚体与现有针对sars-cov-2原型毒株的疫苗有相似的效果，且相比较现有针对原型毒株的疫苗，异源四聚体抗原蛋白可以激发产生对亲缘关系更远的毒株更强的中和抗体水平，异源四聚体抗原蛋白诱导的抗体广谱性更强，免疫原性和广谱性都要优于现有针对新冠原型毒株的疫苗，且异源四聚体抗原蛋白p-b-ly-s和p-b-shc-s相对p-b-ra-s及p-b-pggx-s的效果更稳定。
164.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。