抗4-1BB/抗EGFRvⅢ的双特异抗体及其制备方法和应用与流程

本发明属于抗体领域，具体地涉及一种抗4-1bb/抗egfrviii的双特异抗体抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、4-1bb(cd137，肿瘤坏死因子受体超家族9)是广泛研究的共刺激分子，在活化的t细胞和自然杀伤(nk)细胞等免疫细胞上表达。4-1bb介导t细胞触发一个信号级联，诱导抗凋亡分子的上调和细胞因子的分泌，进一步增强免疫细胞的效应功能。在功能失调的细胞毒性能力下降的t细胞中，4-1bb可以介导恢复t细胞的效应功能。另一方面，在nk细胞上，4-1bb信号可以增加抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用。

2、4-1bb和其配体4-1bbl的结合可激活下游nf-κb、jnk/sapk、p38 mapk等通路，进一步产生共刺激信号诱导cd4+和cd8+t细胞的活性，促进t细胞的增殖。此外，4-1bb与4-1bbl的结合也可刺激巨噬细胞产生多种炎症细胞因子，如il-6、tnf-α等，进一步增强抗肿瘤免疫。保持有效的免疫监视而不引起自身免疫反应需要效应t细胞反应的准确性。

3、4-1bb作为共刺激因子结构域(co-stimulatory domains，cd)被广泛用于car-t(嵌合抗原受体t)细胞治疗。car-t细胞治疗，具有针对癌细胞的定向特异性，是一种很有前景的治疗癌症的方法。作为car-t细胞的胞内共刺激结构域，4-1bb可促进car-t在体内的存活和延长留存时间。

4、人类表皮生长因子受体(egfr，human epidermal growth factor receptor，也称为her-1或erb-b1)是一个170kda的跨膜蛋白受体，通过酪氨酸激酶介导的信号转导途径调节多种细胞生理过程，主要包括细胞增殖及分化、细胞存活及凋亡、血管生成、以及细胞的有丝分裂和细胞转移。egfrviii是其中一种突变型蛋白，也称作de2-7egfr、δegfr，成熟的egfrviiimrna中缺失了外显子2-7的801个核苷酸，相应的egfrviii蛋白缺失了267个氨基酸(6-273)，同时插入了一个甘氨酸残基，形成了一个独特的连接肽。egfrviii特异性的表达于肿瘤组织中，在正常组织中不表达，因此在抗体治疗中是一个高度特异性的靶点。egfrviii在神经胶质瘤中的作用机制并没有完全清楚，但是根据已有的报道，egfrviii可以降低神经胶质瘤细胞的凋亡，并小幅度的提高神经胶质瘤细胞的增殖。

5、4-1bb单抗和双抗目前尚处于早期临床或临床前阶段，适应症包括晚期实体瘤、黑色素瘤和非霍奇金淋巴瘤等。部分早期临床研究的结果显示，4-1bb单抗和双抗具有可接受的安全性、耐受性和一定程度的抗肿瘤疗效。但是，早期开的4-1bb强激动剂对肝脏具有毒性而若激动剂抗肿瘤疗效有限。

6、鉴于本领域的4-1bb蛋白和egfrviii蛋白双抗在抗原结合活性、安全性上仍然有许多不足，因此，开发新的抗4-1bb/抗egfrviii的双特异抗体是治疗癌症以及自身免疫性疾病的迫切需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种抗4-1bb/抗egfrviii的双特异抗体及其制备方法和应用。

2、本发明的目的是提供了一种对4-1bb蛋白和egfrviii蛋白两者都具有较高的结合能力的抗4-1bb/抗egfrviii的双特异抗体。该双特异抗体可以结合肿瘤细胞表面的egfrviii分子的同时，结合免疫细胞表面的4-1bb激活受体分子，使免疫细胞聚集在肿瘤细胞周围并刺激免疫细胞的抗肿瘤活性，达到协同杀死肿瘤细胞的作用，与4-ibb单克隆抗体相比，使用双特异性抗体可以有效地减少过度激活造成的肝脏毒性。

3、为了达到上述目的，本发明体提供了一种抗4-1bb/抗egfrviii的双特异抗体及其制备方法和应用。所述的抗4-1bb/抗egfrviii双特异抗体包括：(1)一种抗4-1bb的抗体或其抗原结合片段，作为4-1bb的靶向分子，能够特异性地识别4-1bb蛋白；以及(2)一种抗egfrviii的抗体或其抗原结合片段，作为egfrviii的靶向分子，能够特异性地识别egfrviii蛋白。

4、在本发明的第一方面，提供了一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：

5、第一抗原结合结构域(d1)；和

6、第二抗原结合结构域(d2)；

7、其中，所述第一抗原结合结构域特异性结合靶分子4-1bb蛋白；

8、所述第二抗原结合结构域特异性结合靶分子egfrviii蛋白；

9、所述d1为特异性结合4-1bb蛋白的抗体或其抗原结合片段；和

10、所述d2为特异性结合egfrviii蛋白的抗体或其抗原结合片段。

11、在另一优选例中，所述抗4-1bb抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区cdr：

12、seq id no:1所示的vh-cdr1，

13、seq id no:2所示的vh-cdr2，和

14、seq id no:3所示的vh-cdr3；

15、所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区cdr：

16、seq id no:7所示的vl-cdr1，

17、seq id no:8所示的vl-cdr2，和

18、seq id no:9所示的vl-cdr3。

19、其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代1或多个氨基酸并能够保留4-1bb结合亲和力的衍生序列。

20、在另一优选例中，所述重链可变区和/或轻链可变区还包括人源的fr区或鼠源的fr区。

21、在另一优选例中，所述抗4-1bb抗体的重链可变区序列如seq id no:13所示；和/或所述抗4-1bb抗体的轻链可变区序列如seq id no:14所示。

22、在另一优选例中，所述抗egfrvⅲ抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区cdr：

23、seq id no:4所示的vh-cdr1，

24、seq id no:5所示的vh-cdr2，和

25、seq id no:6所示的vh-cdr3；

26、所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区cdr：

27、seq id no:10所示的vl-cdr1，

28、seq id no:11所示的vl-cdr2，和

29、seq id no:12所示的vl-cdr3。

30、其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代1个或多个氨基酸并能够保留egfrviii结合亲和力的衍生序列。

31、在另一优选例中，所述重链可变区和/或轻链可变区还包括人源的fr区或鼠源的fr区。

32、在另一优选例中，所述抗egfrviii抗体的重链可变区序列如seq id no:15所示；和/或所述抗egfrviii抗体的轻链可变区序列如seq id no:16所示。

33、在另一优选例中，所述egfrviii蛋白为人iii型egf缺失突变受体(egfrviii)蛋白。

34、在另一优选例中，所述抗体包括重链和轻链，其中所述重链还包括重链恒定区；所述轻链还包括轻链恒定区。

35、在另一优选例中，所述重链恒定区和轻链恒定区各自独立地为人源或鼠源的。

36、在另一优选例中，所述的抗体包括：动物源抗体(如鼠源抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、或其组合。

37、在另一优选例中，所述的抗体包括单链抗体或双链抗体。

38、在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。

39、在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。

40、在另一优选例中，所述抗原结合片段的结构选自下组：(i)fab片段；(ii)f(ab')2片段；(iii)fd片段；(iv)fv片段；(v)单链fv(scfv)分子；或(vi)dab片段。

41、在另一优选例中，所述抗原结合片段为纳米抗体。

42、在另一优选例中，所述的抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区。

43、在另一优选例中，所述的抗原结合片段包含单链可变区片段(scfv)、双链可变区片段(dcfv)。

44、在另一优选例中，所述d1和所述d2通过连接肽相连

45、在另一优选例中，所述连接肽包括抗体恒定区序列或抗体可变区序列。

46、在另一优选例中，所述连接肽为(g4s)n，较佳地，(g4s)ng，其中，n为正整数(例如1、2、3、4、5或6)，较佳地，n＝3。

47、在另一优选例中，d1为抗4-1bb抗体，并且d2通过连接肽连接在d1的选自下组的区域：重链可变区、重链恒定区、轻链可变区、轻链恒定区或其组合。

48、在另一优选例中，d1为抗4-1bb抗体，d2为抗egfrviii抗体的scfv；并且d2通过连接肽连接在d1的重链恒定区末端。

49、在另一优选例中，d2为抗egfrviii抗体，并且d1通过连接肽连接在d2的选自下组的区域：重链可变区、重链恒定区、轻链可变区、轻链恒定区或其组合。

50、在另一优选例中，d2为抗egfrviii抗体，d1为抗4-1bb抗体的scfv；并且d1通过连接肽连接在d1的重链恒定区末端。

51、在另一优选例中，所述双特异性抗体从n端到c端具有式i所示的结构：

52、

53、其中，

54、d各自独立地为无或抗4-1bb抗体或其抗原结合片段，优选地为抗4-1bb抗体的scfv，且至少一个d为抗4-1bb抗体或其抗原结合片段；

55、l1、l2、l3、l4各自独立地为键或接头；

56、vl代表抗egfrviii抗体的轻链可变区；

57、cl代表抗egfrviii抗体的轻链恒定区；

58、vh代表抗egfrviii抗体的重链可变区；

59、ch代表抗egfrviii抗体的重链恒定区；

60、或

61、d各自独立地为无或抗egfrviii抗体或其抗原结合片段，优选地为抗egfrviii抗体的scfv，且至少一个d为抗egfrviii抗体或其抗原结合片段；

62、l1、l2、l3、l4各自独立地为键或接头；

63、vl代表抗4-1bb抗体的轻链可变区；

64、cl代表抗4-1bb抗体的轻链恒定区；

65、vh代表抗4-1bb抗体的重链可变区；

66、ch代表抗4-1bb抗体的重链恒定区；

67、“～”代表二硫键或共价键；

68、“-”代表肽键；

69、其中，所述双特异性抗体具有同时结合4-1bb以及结合egfrviii的活性。

70、在另一优选例中，所述双特异性抗体还包括所述双特异性抗体的活性片段和/或衍生物，其中，所述活性片段和/或所述衍生物保留了所述双特异性抗体的70-100％(如70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)的抗4-1bb活性和70-100％的抗ox40活性。

71、在另一优选例中，所述抗体的衍生物具有与本发明抗体至少85％的序列同一性。

72、在另一优选例中，所述抗体的衍生物是本发明抗体经过一个或几个氨基酸缺失、插入和/或取代后并保持至少85％的同一性的序列。

73、在另一优选例中，所述抗体的衍生物具有与本发明抗体至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。

74、在另一优选例中，所述抗4-1bb/抗egfrviii的双特异抗体，该双特异抗体可以包括抗4-1bb抗体或其结合片段作为4-1bb靶向分子，

75、在另一优选例中，抗4-1bb抗体或其结合片段可以特异性地结合到4-1bb蛋白。

76、在另一优选例中，抗4-1bb抗体或其结合片段能够增强免疫应答和/或治疗肿瘤。抗4-1bb抗体或其结合片段地特征在于与先前存在的4-1bb抗体相比，具有交联依赖性，可以显著降低肝毒性并且保持增强的免疫应答和/或抗肿瘤效应。

77、在另一优选例中，所述交联是指抗体可通过其本身的fc段与其他介质结合富集，所述的其他介质包括特异性结合抗体的fc段，包括但不限于抗fc抗体，细胞表面fc受体。

78、在另一优选例中，所述抗4-1bb/抗egfrviii的双特异抗体，该双特异抗体呈igg-scfv形式。

79、其中，抗4-1bb/抗egfrviii的双特异抗体可以包括：igg组分，包括抗4-1bb抗体或其结合片段，所述抗体的重链可变区序列如seq id no.:13所示；并且所述的抗体的轻链可变区序列如seq id no.:14所示。scfv组分，包括抗egfrviii抗体或其结合片段，其包含重链可变区序列如seq id no:15所示或具有至少90％序列同源性的氨基酸序列；和轻链可变区序列如seq id no:16所示或具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。

80、在本发明的第二方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：(i)如本发明第一方面所述的双特异性抗体；以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

81、在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。

82、在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体

83、在本发明的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的双特异性抗体或本发明第二方面所述的重组蛋白。

84、在另一优选例中，编码所述抗4-1bb抗体的重链可变区的核酸如seq id no：17所示；编码所述抗4-1bb抗体的轻链可变区的核酸如seq id no：18所示。

85、在另一优选例中，编码所述抗egfrviii抗体的重链可变区的核酸如seq id no：19所示；编码所述抗egfrviii抗体的轻链可变区的核酸如序列表seq id no：20所示。

86、在本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明的第三方面所述的多核苷酸。

87、在另一优选例中，所述载体为表达载体。

88、在另一优选例中，所述载体包括质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。

89、在本发明的第五方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有本发明的第四方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第三方面所述的多核苷酸。

90、在本发明的第六方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的双特异性抗体的方法，其特征在于，包括步骤：

91、(i)在合适的条件下，培养本发明的第五方面所述的宿主细胞，获得含有本发明的第一方面所述的双特异性抗体的混合物；和

92、(ii)对步骤(i)中得到的混合物进行纯化和/或分离，从而获得本发明的第一方面所述的双特异性抗体。

93、在另一优选例中，所述纯化可以通过蛋白a亲和柱纯化分离获得目标抗体。

94、在另一优选例中，所述经过纯化分离后的目标抗体纯度大于95％，大于96％、大于97％、大于98％、大于99％，优选为100％。

95、在本发明的第七方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明第一方面所述的双特异性抗体；如本发明第二方面所述的重组蛋白、或其组合，所述活性成分用于(a)制备检测试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗相关疾病的药物。

96、在另一优选例中，所述相关疾病选自下组：癌症、自身免疫疾病、病毒感染、移植物抗宿主病、炎症性疾病、免疫性疾病、或其组合。

97、在另一优选例中，所述的癌症包括实体瘤、血液癌。

98、在另一优选例中，所述的实体瘤选自下组：膀胱癌、胆道癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食管癌、胃癌、神经胶质瘤、头癌、白血病、肝癌、肺癌癌症、淋巴瘤、骨髓瘤、颈癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、肾癌、唾液癌、胃癌、胸腺上皮癌和甲状腺癌、或其组合。

99、在另一优选例中，所述的自身免疫疾病选自下组：系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、溃疡性结肠炎、i型糖尿病、银屑病、多发性硬化症、或其组合。

100、在另一优选例中，所述检测试剂或试剂盒用于检测样品中4-1bb。

101、在另一优选例中，所述检测试剂或试剂盒用于检测样品中egfrviii。

102、在另一优选例中，所述检测试剂或试剂盒用于同时检测样品中4-1bb和样品中egfrviii。

103、在本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：

104、(i)如本发明第一方面所述的双特异性抗体；和

105、(ii)药学上可接受的载体。

106、在另一优选例中，所述药物组合物可以用于治疗和/或预防癌症。

107、在另一优选例中，所述药物组合物中还含有额外的抗肿瘤剂。

108、在另一优选例中，所述药物组合物为单元剂型。

109、在另一优选例中，所述抗肿瘤剂包含紫杉醇、多柔比星、环磷酰胺、阿西替尼、乐伐替尼、或派姆单抗。

110、在另一优选例中，所述的抗肿瘤剂可以与所述双特异性抗体单独存在于独立的包装内，或所述抗肿瘤剂可以与所述双特异性抗体偶联。

111、在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。

112、在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。

113、在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括胃肠给药剂型或胃肠外给药剂型。

114、在另一优选例中，所述的胃肠外给药剂型包括静脉注射、静脉滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤内注射、腹腔内注射、颅内注射、或腔内注射。

115、在本发明的第九方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：

116、(a)如本发明第一方面所述的双特异性抗体；和

117、(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。

118、在另一优选例中，所述偶联物部分选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如il-2等)、抗体、抗体fc片段、抗体scfv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，dt-心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶-样蛋白质(bphl))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

119、在另一优选例中，所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。

120、在本发明的第十方面，提供了一种本发明第一方面所述的双特异性抗体、如本发明第二方面所述的重组蛋白、或如本发明第九方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备(a)检测试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗相关疾病的药物。

121、在另一优选例中，所述相关疾病选自下组：癌症、自身免疫疾病、病毒感染、移植物抗宿主病、炎症性疾病、免疫性疾病、或其组合。

122、在另一优选例中，所述的癌症包括实体瘤、血液癌。

123、在另一优选例中，所述的实体瘤选自下组：膀胱癌、胆道癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食管癌、胃癌、神经胶质瘤、头癌、白血病、肝癌、肺癌癌症、淋巴瘤、骨髓瘤、颈癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、肾癌、唾液癌、胃癌、胸腺上皮癌和甲状腺癌、或其组合。

124、在另一优选例中，所述的自身免疫疾病选自下组：系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、溃疡性结肠炎、i型糖尿病、银屑病、多发性硬化症、或其组合。

125、在另一优选例中，所述肿瘤为高表达4-1bb和/或egfrviii的肿瘤。

126、在另一优选例中，所述药物或制剂用于制备预防和/或治疗与4-1bb和/或egfrviii(表达阳性的)相关的疾病的药物或制剂。

127、在另一优选例中，所述的抗体为药物偶联物(adc)形式。

128、在另一优选例中，所述的检测试剂或试剂盒用于诊断4-1bb和/或egfrviii相关疾病。

129、在另一优选例中，所述检测试剂或试剂盒用于检测样品中4-1bb和/或egfrviii蛋白。

130、在另一优选例中，所述的检测试剂为检测片。

131、在本发明的第十一方面，提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中4-1bb、egfrviii或同时检测4-1bb、egfrviii的组合物及方法，所述组合物包括抗4-1bb/抗egfrviii双特异抗体；所述方法包括步骤：

132、(1)在体外，将所述样品与如本发明第一方面所述的双特异性抗体接触；

133、(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中4-1bb和/或egfrviii存在。

134、另一优选例中，所述的组合物包括双特异抗体。

135、在另一优选例中，所述的检测方法包括双特异抗体用于诊断与4-1bb、egfrviii或两者相关的疾病的用途。

136、在另一优选例中，所述的与4-1bb、egfrviii或两者相关的疾病可以是4-1bb的激活和/或egfrviii过表达相关的疾病。

137、在本发明的第十二方面，提供了一种重组多肽的制备方法，所述方法包括：

138、(a)在适合表达的条件下，在细胞中表达编码双特异抗体的重链和轻链的核苷酸；

139、(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明第一方面所述的双特异性抗体或如本发明第二方面所述的重组蛋白。

140、在本发明的第十三方面，提供了一种治疗肿瘤、癌症或自身免疫病的方法，包括步骤：向需要的对象施用安全有效量的如本发明第一方面所述的双特异性抗体、或本发明的第八方面所述的药物组合物、或本发明的第九方面所述的免疫偶联物、或其组合。

141、在另一优选例中，所述的癌症包括实体瘤、血液癌。

142、在另一优选例中，所述的实体瘤选自下组：膀胱癌、胆道癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食管癌、胃癌、神经胶质瘤、头癌、白血病、肝癌、肺癌癌症、淋巴瘤、骨髓瘤、颈癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、肾癌、唾液癌、胃癌、胸腺上皮癌和甲状腺癌、或其组合。

143、在另一优选例中，所述的自身免疫疾病选自下组：系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、溃疡性结肠炎、i型糖尿病、银屑病、多发性硬化症、或其组合。

144、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。