一种检测多种呼吸道病原体的引物及探针组合及试剂盒及应用的制作方法

1.本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种检测多种呼吸道病原体的引物及探针组合及试剂盒及应用。


背景技术：

2.聚合酶链式反应(pcr)技术自1983年由mullis等发明以来，在生命科学研究等方面得到广泛应用。传统的pcr反应中，在存在dna模板、引物、四种dttp、适当的缓冲液的反应混合物的条件下，通过dna聚合酶催化从而对目的dna片段进行扩增。pcr反应一般包括变性、退火和延伸三个步骤，每个步骤重复30至40次，由此对少量目的dna片段进行指数级扩增已达到可以检测的水平。由于pcr技术可将少量核酸分子进行扩增达到仪器可检测的水平，因此迅速应用于多个领域，例如，疾病诊断、动植物病理学研究、微生物检测等等。
3.基于pcr的强大的扩增能力，在实际应用中，将pcr与其它分子生物学方法以及免疫学方法等相结合发展得到了多种检测技术，例如荧光定量pcr技术、多重pcr检测技术等已在疾病检测方面得到广泛使用。
4.目前对传感染病原体进行检测的金标准是基于聚合酶链式反应pcr的实时荧光定量方法，需要在循环之间进行温度的转换，而且由于扩增效率较低，导致耗时长，很难检测到低拷贝数的病毒核酸，导致ct值偏大，易于在病原微生物医学检测出现假阴性结果，灵敏度低。同时该方法缺点是一次只能检测1种病原微生物，结合多重pcr技术与多色荧光标记技术其检测通量得到一定提高。但受到荧光种类与荧光相互干扰的限制，目前基于多重q pcr大多产品集中在3-5种靶标的检测，一次反应检测的病原体数目较少，难以满足临床对病原体进行多重同时检测的要求。
5.目前已经研发出多种等温体外核酸扩增技术，如tma技术(转录介导的核酸扩增技术)、sda技术(链置换核酸扩增技术)、lamp(环介导核酸扩增技术)、hda(解旋酶依赖等温核酸扩增技术)、rpa技术(重组酶介导等温扩增)等等，这些技术在恒定的温度(65度或者37度左右)下就可以实现高效的核酸扩增，从而无需使用对温度进行精准控制的pcr仪。
6.其中，rpa技术被公认是可以替代pcr的核酸检测技术。其原理是利用重组酶与引物结合形成蛋白-dna复合物，能在双链dna中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动dna合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。
7.另外，rpa技术有多重工具酶匹配进行有效扩增，扩增效率远高于传统的pcr技术，所用时间更短，最短可在5min内实现。由于rpa技术具有扩增用时短、不需昂贵仪器、特异性好等特点，使其应用越来越广泛。rpa技术的最大特点是只需要1对引物即可在40℃左右的恒温条件下实现模板核酸的扩增，不需要通过高低温度循环实现核酸解链和退火，因此不需要昂贵的仪器设备。而且37℃的常规反应温度很容易满足，适合基层对病原菌的快速检测。目前，rpa技术已经广泛应用于人体、动物或植物上的病毒检测。
8.然而同样的，现有等温扩增技术，一次只能进行1种至几种病原体的检测，目前基
于等温扩增的大多产品集中在1-4种靶标的检测，一次反应检测的病原体数目较少，难以满足临床对病原体进行多重同时检测的要求。
9.为此，结合等温扩增、多重pcr扩增以及巢式pcr扩增技术，并设计特异的rpa多重引物、巢式pcr引物、rpa探针，解决以上问题。


技术实现要素：

10.为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种检测多种呼吸道病原体的引物及探针组合及试剂盒及应用。
11.为了实现本发明的目的，所采用的技术方案是：
12.一种检测多种呼吸道病原体的引物及探针组合，
13.所述引物为rpa多重引物和巢式rpa引物，所述探针为巢式rpa探针；
14.所述rpa多重引物具体为seq no.1-24所示的上游或下游rpa多重引物所组成的引物对；
15.所述巢式rpa引物具体为seq no.25-48所示的上游或下游巢式rpa引物所组成的引物对；
16.所述巢式rpa探针为如seq no.49-60所示的序列。
17.在本发明的一个优选实施例中，所述rpa多重引物中的上游或下游rpa多重引物的摩尔比例为1:1。
18.检测时，浓度为10um的上述各rpa多重引物混合物用量为4ul。
19.检测时，浓度为10um的上述各巢式rpa引物用量为2ul。
20.检测时，浓度为5pm的上述各巢式rpa探针用量为0.6ul。
21.一种检测多种呼吸道病原体的试剂盒，所述试剂盒包括所述引物及探针组合，所述多种呼吸道病原体为冠状病毒oc43型、人偏肺病毒、鼻病毒、甲型流感病毒a型、甲型h1n1流感病毒、乙型流感病毒、冠状病毒hku1型、冠状病毒nl63型、冠状病毒229e型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、呼吸道合胞病毒。
22.一种检测多种呼吸道病原体的试剂盒，所述试剂盒还包括重组酶聚合酶冻干酶粉、水解缓冲液、醋酸镁溶液及去离子水。
23.一种检测多种呼吸道病原体的试剂盒的应用，所述应用为通过等温扩增、多重pcr扩增和巢式pcr扩增对样本核酸进行处理，进行所述多种呼吸道病原体的检测。
24.所述检测包括如下步骤：
25.样本核酸首先经过一个快速的逆转录过程，将rna转变成为cdna，之后采用rpa多重引物开始进行第一阶段的多重rpa反应；
26.第一阶段反应结束后，利用dna吸附磁珠进行多重rpa扩增产物纯化和稀释；第一阶段多重rpa的产物在经过稀释后，做为第二阶段巢式rpa的模板待用，
27.采用巢式rpa引物和巢式rpa探针，在第二阶段巢式rpa扩增反应中，通过监测各反应内荧光信号水平的变化实现对目标病原体的检测和定量。
28.本发明的有益效果在于：
29.通过几种技术的优势结合，以及独特设计的引物探针，一次反应可检测12种呼吸道病原体，1.5小时内完成pcr扩增，信号读取，结果报告；检测灵敏度为100拷贝/反应。
附图说明
30.图1为本发明实施例1中对冠状病毒oc43型(hcovoc43)质粒标准品进行检测的结果图，结果显示其两个100copies复孔均为阳性。
31.图2为本发明实施例1中对人偏肺病毒(hmpv)质粒标准品进行检测的结果图，结果显示其两个100copies复孔均为阳性。
32.图3为本发明实施例1中对鼻病毒(rhv)质粒标准品进行检测的结果图，结果显示其两个100copies复孔均为阳性。
33.图4为本发明实施例1中对甲型流感病毒a型(flua)质粒标准品进行检测的结果图，结果显示其两个100copies复孔均为阳性。
34.图5为本发明实施例1中对甲型h1n1流感病毒(2009h1n1)质粒标准品进行检测的结果图，结果显示其两个100copies复孔均为阳性。
35.图6为本发明实施例1中对乙型流感病毒(flub)质粒标准品进行检测的结果图，结果显示其两个100copies复孔均为阳性。
36.图7为本发明实施例1中对冠状病毒hku1型(hcovhku1)质粒标准品进行检测的结果图，结果显示其两个100copies复孔均为阳性。
37.图8为本发明实施例1中对冠状病毒nl63型(hcovnl63)质粒标准品进行检测的结果图，结果显示其两个100copies复孔均为阳性。
38.图9为本发明实施例1中对冠状病毒229e型(hcov229e)质粒标准品进行检测的结果图，结果显示其两个100copies复孔均为阳性。
39.图10为本发明实施例1中对副流感病毒2型(pifv2)质粒标准品进行检测的结果图，结果显示其两个100copies复孔均为阳性。
40.图11为本发明实施例1中对副流感病毒3型(pifv3)质粒标准品进行检测的结果图，结果显示其两个100copies复孔均为阳性。
41.图12为本发明实施例1中对呼吸道合胞病毒质粒标准品进行检测的结果图，结果显示其两个100copies复孔均为阳性。
具体实施方式
42.一种检测多种呼吸道病原体的引物及探针组合，
43.引物为rpa多重引物和巢式rpa引物，探针为巢式rpa探针；
44.rpa多重引物具体为seq no.1-24所示的上游或下游rpa多重引物所组成的引物对；
45.巢式rpa引物具体为seq no.25-48所示的上游或下游巢式rpa引物所组成的引物对；
46.巢式rpa探针为如seq no.49-60所示的序列。
47.rpa多重引物中的上游或下游rpa多重引物的摩尔比例为1:1。
48.检测时，浓度为10um的上述各rpa多重引物混合物用量为4ul。
49.检测时，浓度为10um的上述各巢式rpa引物用量为2ul。
50.检测时，浓度为5pm的上述各巢式rpa探针用量为0.6ul。
51.病原体和引物、探针对应关系，以及引物、探针序列为表1所述。
52.表1
53.54.55.56.[0057][0058]
注：
[0059]
*引物探针名称中含f的代表上游引物，含r的代表下游引物，含p的代表探针。
[0060]
探针的下游引物在5’端耦连上生物素，探针上游耦连fam，中间位置采用thf(四氢呋喃)替代一个碱基，3’端进行磷酸化处理。
[0061]
引物组及探针均采用page纯化并结合质谱方式对合成物进行检验。
[0062]
采用本发明的试剂盒的检测流程包含以下步骤：
[0063]
2)样本处理和核酸提取，得到待测样本核酸模板；
[0064]
2)配制第一阶段rpa多重扩增试剂，以得到的核酸为模板进行多重扩增；具体为：在装有rpa核酸扩增基础性试剂检测干粉的反应单元管中加入缓冲液a buffer 12.5μl，10μm的rpa多重引物混合物4μl，无菌双蒸水8.8μl，模板1μl。为了保证反应同时进行，b buffer(mgac)1.25μl应该加在八连管的盖子上，小心翻转盖上，将rpa扩增体系充分混匀，5,000
×
g离心10s，置于40℃pcr仪上反应30min。
[0065]
其中a buffer具体成分为：氯化钠、tris-hcl缓冲液、氯化钾、氯化镁、二硫苏糖醇或聚乙烯吡咯烷酮。
[0066]
3)利用dna吸附磁珠进行多重rpa扩增产物纯化和稀释。
[0067]
4)配置第二阶段巢式rpa扩增试剂，以得到的纯化产物为模板进行巢式rpa扩增，并完成荧光检测；具体为：在装有rpa核酸扩增荧光型试剂检测干粉的反应单元管中加入缓冲液a buffer 12.5μl，10μm的上游引物1μl，10μm的下游引物1μl，探针0.6μl，无菌双蒸水8μl，模板1μl。为了保证反应同时进行，b buffer(mgac)1.25μl应该加在八连管的盖子上，小心翻转盖上，将rpa扩增体系充分混匀，5,000
×
g离心10s，置于qpcr仪上反应30min，qpcr仪
设置为40℃、3min，40℃45sec/cycles，40cycles，检测fam通道荧光。
[0068]
5)应用荧光探针进行扩增产物检测，与阴性对照比较，检测孔在qpcr仪设备上有s形曲线判定为阳性，表明样本中含有对应的病原体；未见s形曲线判定为阴性，表明样本中不含有对应的病原体。
[0069]
下面结合具体实施例，对本发明进行进一步地解释和说明：
[0070]
实施例1呼吸道病原体质粒标准品检测验证所述方法的灵敏度：
[0071]
1.质粒标准品制备和稀释：
[0072]
通过对genebank数据库和国内外已发表文献中报道的呼吸道病原体相关核酸序列进行序列比对分析，选择无二级结构且高度保守的区段为扩增靶片段，对挑选的12种病原体，制备其质粒标准品，质粒大小在400bp左右；合成的质粒标准品原液为10
10
copies/μl，按照梯度稀释，使用te溶液，将其稀释到100copies/μl。常规qpcr检测的灵敏度在100copies/反应。
[0073]
2.第一阶段多重rpa扩增：
[0074]
采用杭州众测生物科技有限公司的基础型核酸扩增试剂进行第一阶段体系配制。
[0075]
按照表2所列组分配置反应体系(反应液配制在冰上进行)，震荡混匀，短暂离心。
[0076]
表2第一阶段扩增体系配置
[0077][0078]
为了保证反应同时进行，b buffer(mgac)1.25μl应该加在八连管的盖子上，小心翻转盖上，将rpa扩增体系充分混匀，5,000
×
g离心10s，置于40℃pcr仪上反应30min。
[0079]
3.第一阶段扩增产物纯化：
[0080]
利用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的vahts dna clean beads，吸附磁珠进行多重rpa扩增产物纯化和稀释。吸取30ul磁珠置上一步扩增完的pcr管中，(总体积61.25ul)震荡混匀，静置5min,将pcr管置于磁力架上，吸附2-3min,待溶液澄清后弃上清，加入80％乙醇100ul,(总体积100ul)静置30s,弃上清，重复洗涤一次，彻底弃上清，加入100ul去离子水，震荡混匀，将pcr置于磁力架上，待溶液澄清后吸取上清转移到新的离心管中，然后加入100ul nf水，稀释至200ul总体积。
[0081]
4.第二阶段巢式rpa扩增：
[0082]
采用杭州众测生物科技有限公司的荧光型核酸扩增试剂进行第二阶段体系配制。
[0083]
按照表3所列组分配置反应体系(反应液配制在冰上进行)，震荡混匀，短暂离心。其中，每种质粒标准品的检测都设置两个复孔，并添加阴性对照。
[0084]
表3第二阶段扩增体系配置
[0085][0086][0087]
为了保证反应同时进行，b buffer(mgac)1.25μl应该加在八连管的盖子上，小心翻转盖上，将rpa扩增体系充分混匀，5,000
×
g离心10s，置于qpcr仪上反应30min，qpcr仪设置为40℃、3min，40℃45sec/cycles，40cycles，检测fam通道荧光。
[0088]
5.结果分析：
[0089]
扩增完毕，由qpcr仪自带软件进行数据处理，与阴性对照比较，检测孔在qpcr仪设备上有s形曲线判定为阳性，未见s形曲线判定为阴性。
[0090]
6.质粒标准品检测结果：
[0091]
采用100copies的制备后的质粒标准品，检测结果如表4。
[0092]
表4
[0093][0094][0095]
每项病原体质粒标准品的实验结果如图1-图12所示。
[0096]
综上，本发明的主要创新点在于：
[0097]
1.相比于传统的pcr及荧光定量pcr，本发明操作更为简单，所需时间更短，对仪器要求不高。
[0098]
2.本发明可以通过一次反应检测12种呼吸道病原体，极大提高检测效率，为医生提供更全面的结果参考，满足临床需求。
[0099]
3.本发明可以达到100copies/反应的检测灵敏度，与现有金标准qpcr检测的灵敏度一致，保证检测准确性。