一种抗EV71病毒抗体及其制备方法和应用

一种抗ev71病毒抗体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种抗ev71病毒抗体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.肠道病毒71型(enterovirus 71，ev71)是单股正链无囊膜的rna病毒，属于小rna病毒科，肠道病毒a属成员。手足口病(hand,foot,mouth disease,hfmd)是一种由多种肠道病毒引起的儿童感染性疾病，3岁以下儿童易感，其中ev71是导致手足口病的重要病原之一，成人也可被感染，但多呈现隐性感染，没有明显临床症状。ev71主要通过接触患儿唾液、疱疹液、粪便以及被其污染的食物和物品进行传播。
3.我国已有三种ev71灭活疫苗批准上市，手足口病得到了一定的控制，但灭活苗有一定的副作用，如少数接种者出现发热、过敏等现象。同时当应急接种疫苗后，体内中和抗体的变化以及对机体的保护作用，尚未清楚。因此，研制治疗性的中和抗体来应对ev71的感染，显得尤为重要。
4.目前，相关研究通过合成针对ev71 vp1的多肽来免疫小鼠，鉴定出了多个线性中和抗体表位，但并未发现空间表位，如cn102702351a公开了一种利用噬菌体表面展示技术筛选获得的人源抗ev71病毒中和性抗体ev71fabl6，该抗体能够特异性识别ev71病毒颗粒抗原，可与ev71病毒发生显著的酶联免疫反应且具有抗ev71病毒感染的中和活性功能。
5.综上所述，开发不同类型的抗ev71病毒抗体，对进一步开展ev71病毒感染疾病机制研究与防控策略制定有重要意义。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种抗ev71病毒抗体及其制备方法和应用，本发明筛选得到具备良好特异性的抗ev71病毒抗体，且为针对ev71病毒vp1蛋白的空间表位抗体。
7.为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
8.第一方面，本发明提供一种抗ev71病毒抗体，所述抗ev71病毒抗体的重链的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别包括seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示的序列，所述抗体的轻链的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别包括seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6所示的序列。
9.本发明中，筛选得到具备良好特异性的抗ev71病毒抗体，为针对ev71病毒vp1蛋白的空间表位抗体，具备良好的中和活性，为ev71特异性抗病毒药物的研究提供了科学依据，为人源化治疗性抗体研究奠定了基础。
10.优选地，所述抗ev71病毒抗体的重链的可变区的氨基酸序列包括seq id no.7所示的序列，所述抗ev71病毒抗体的轻链的可变区的氨基酸序列包括seq id no.8所示的序列。
11.seq id no.1：sfvms。
12.seq id no.2：sitgggsvyypdsvkg。
13.seq id no.3：qgtaydlwfay。
14.seq id no.4：rasksvstsgysymh。
15.seq id no.5：lvsnles。
16.seq id no.6：qhir。
17.seq id no.7：
18.evqlletggglvkpggslklscaasgftfssfvmswgrqtpdkslewvasitgggsvyypdsvkgrftisrdtagnilylqmsslrsedtamyycarqgtaydlwfaywgqgtlvtvsa。
19.seq id no.8：
20.divmsqspaslavslgqratisyrasksvstsgysymhwnqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhireltrseggpswk。
21.第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子含有编码第一方面所述的抗ev71病毒抗体的核酸序列。
22.优选地，编码所述抗ev71病毒抗体的重链的可变区的核酸序列包括seq id no.9所示的序列，编码所述抗ev71病毒抗体的轻链的可变区的核酸序列包括seq id no.10所示的序列。
23.seq id no.9：
24.gaagtgcagctgttggagactgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtagttttgtcatgtcttggggtcgccagactccagataagagtctggagtgggtcgcatccattactggaggtggtagtgtatattatccagacagtgtgaagggccgattcaccatctccagagatactgccgggaacatcctgtacctgcagatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgcaagacaaggaacggcgtatgacctctggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca。
25.seq id no.10：
26.gacattgtgatgtcacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa。
27.第三方面，本发明提供一种重组载体，所述重组载体含有第二方面所述的核酸分子。
28.第四方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞含有编码第一方面所述的抗ev71病毒抗体的核酸序列。
29.第五方面，本发明提供如第一方面所述的抗ev71病毒抗体的制备方法，所述制备方法包括：
30.将编码第一方面所述的抗ev71病毒抗体的核酸序列插入表达载体，得到重组载体，将所述重组载体导入宿主细胞进行培养，进行纯化，得到所述抗ev71病毒抗体。
31.第六方面，本发明提供如第一方面所述的抗ev71病毒抗体在制备ev71病毒检测产品中的应用。
32.本发明中的抗ev71病毒抗体具备良好特异性，与ev71病毒特异结合，可用于ev71
病毒的检测，如elisa法检测中。
33.第七方面，本发明提供一种检测ev71病毒的试剂，所述检测ev71病毒的试剂包括第一方面所述的抗ev71病毒抗体。
34.第八方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的抗ev71病毒抗体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的重组细胞。
35.优选地，所述药物组合物还包括辅料。
36.优选地，所述辅料包括药学上接受的的载体、稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、ph调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。
37.第九方面，本发明提供第一方面所述的抗ev71病毒抗体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的重组载体、第四方面所述的重组细胞或第八方面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗由ev71病毒引起的疾病的药物中的应用。
38.优选地，所述疾病包括手足口病。
39.本发明的抗ev71病毒抗体对ev71不同株型病毒均具有良好的中和活性，能够识别ev71-vp1蛋白的空间表位，具有广谱中和效果，为ev71特异性抗病毒药物的研究提供了科学依据，为人源化治疗性抗体研究奠定了基础。
40.与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：
41.本发明中，筛选得到具备良好特异性的抗ev71病毒抗体，为针对ev71病毒vp1蛋白的空间表位抗体，具备良好的中和活性，能够应用于ev71的检测，以及为ev71特异性抗病毒药物的研究提供了科学依据，对进一步开展ev71病毒感染疾病机制研究与防控策略制定有重要意义。
附图说明
42.图1为纯化后ev71-vlps电镜检测图；
43.图2为抗ev71病毒抗体免疫荧光检测结果图。
具体实施方式
44.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
45.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
46.实施例1
47.本实施例制备ev71病毒颗粒(ev71-vlps)。
48.(1)构建ac-p1-3cd和ac-vp1重组杆状病毒。
49.将ev71病毒(genebank：jq804832)的p1和3cd基因分别插入到pfastbacdual载体的启动子为polyhedrin和p10的多克隆位点区域，得到供体质粒pfastbac-p1-3cd。将ev71
病毒的vp1基因插入到pfastbaci载体的多克隆位点，得到供体质粒pfastbac-vp1。利用bac-to-bac系统，将两种供体质粒转到dh10bac感受态中，利用蓝白斑筛选技术，得到正确的acbac-p1-3cd和acbac-vp1。在此基础上，分别将两种供体质粒转染到sf9细胞中，获得ac-p1-3cd和ac-vp1重组杆状病毒。
50.(2)ev71-vlps的大量表达与制备
51.利用生物反应器(广州齐志有限公司，bc-7l)大量培养sf9细胞，待细胞密度达到5
×
106个细胞/毫升后，以moi＝5的剂量，加入ac-p1-3cd重组杆状病毒，72h后分别收取感染后的上清和细胞。
52.(3)ev71-vlps的纯化
53.将用ac-p1-3cd感染72h的sf9细胞，于5000rpm离心10min收集，用pbs重悬细胞沉淀，并用高压破碎仪将细胞破碎，继而将破碎后的细胞于9000
×
g离心30min，取上清，将上清放置于超滤装置中，用300kd的滤膜超滤过夜，取超滤后的样品，利用液相色谱仪(ge，akta-fplc900)和sephacryl s200凝胶柱(ge)，进行纯化，根据出峰时间，收取样品。
54.(4)ev71-vlps的电镜观察
55.取10μl纯化后的ev71-vlps样品，放置在铜网上，让其吸附2min，再用磷钨酸染色1min，待自然风干后，电镜下观察ev71-vlps的形态。
56.通过杆状病毒表达系统大量制备ev71-vlps并纯化后，电镜下能观察到大小均一，直径约为30nm左右的ev71-vlps，如图1所示。
57.实施例2
58.本实施例筛选并鉴定抗ev71病毒抗体。
59.(1)动物免疫
60.将实施例1中纯化的ev71-vlps用等体积的弗氏佐剂充分乳化后，通过腹腔及皮下多点注射的方式对6-8周龄的spf级雌性balb/c小鼠(湖北省疾控中心购买)进行三次免疫，每次免疫间隔两周，免疫剂量为100μg/只，共免疫5只，每次免疫前进行眼眶采血，用于后续检测。
61.(2)细胞融合与杂交瘤细胞的筛选
62.取加强免疫后的balb/c小鼠，摘眼球取血处死后，无菌取小鼠的脾脏，放在无菌装有10ml rpmi-1640培养基匀浆器中进行研磨，静置10min后取研磨上清，1000rpm离心10min，弃上清，沉淀加入10ml培养基重悬作为免疫脾细胞悬液待用，将1
×
108个免疫脾细胞与2
×
107个骨髓瘤细胞混匀后，1000rpm离心10min，弃上清，将装有细胞混合液的离心管在37℃水浴条件下，缓慢加入1ml预热的peg，边加边混匀，然后再补充预热的rpmi-1640培养基至10ml，混匀后，1000rpm离心5min，弃上清，随后将细胞用50ml hat培养基重悬，接种在96孔板中，每孔100μl，将培养板置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养8d。
63.待细胞孔中出现大的集落时，挑选不同孔内细胞用ht培养基进行稀释，传至新的96孔板，使孔内细胞为单细胞，待细胞孔内细胞再次出现大的集落时，取细胞上清进行免疫荧光检测，具体步骤参照下文(4)中所述，取检测阳性孔进行下一轮筛选，经过三轮筛选后，将阳性单克隆细胞扩大培养，设编号为22e7。
64.(3)单克隆抗体的蛋白免疫印迹分析(westernbloting，wb)
65.取ev71病毒感染18h后的rd细胞以及ac-p1-3cd和ac-vp1感染后的sf9细胞，进行
sds-page分析及westernblot鉴定(参照bio-rad操作指南和laemmli方法)，同时分别取rd细胞和sf9细胞作为阴性对照，将筛选得到的细胞株作为一抗，hrp标记的1:1000稀释的羊抗鼠igg作为二抗，进行检测，利用ge image quant las 4000仪器(ge healthcare，英国)进行成像。
66.(4)单克隆抗体的间接免疫荧光验证(immunofluorescence assay,ifa)
67.ac-vp1重组杆状病毒感染sf9细胞48h后，弃上清，每孔加入300μl 4％的多聚甲醛进行固定15min，同设健康sf9细胞为空白对照组，15min后，pbs洗三遍，立即加入100μl 0.5％triton x-100，透化10min，pbs洗三遍后，每孔加300μl 5％bsa封闭，37℃孵育2h，弃掉封闭液后，将筛选得到的阳性细胞株产生的抗体作为一抗，37℃孵育2h，pbs洗三遍后，用1:1000稀释fitc标记的羊抗鼠作为二抗，37℃孵育1h，最后pbs洗三遍后，每孔加入100μlpbs，在荧光显微镜下观察。
68.将ac-ev71-vp1重组杆状病毒感染48h后的细胞，用阳性单克隆细胞株进行免疫荧光鉴定，结果如图2所示，筛选到的22e7单抗能识别ev71结构蛋白vp1，此外，进行蛋白免疫印迹分析筛选，未出现明显条带，说明22e7单抗能识别ev71-vp1的空间表位，不能识别ev71蛋白的线性表位。
69.(5)单克隆抗体可变区序列测定
70.将细胞培养瓶置于冰上，弃去上清，加入qixzol试剂(nzk-r15008)1ml，室温裂解8min，轻轻吹打，将液体吸至ep管中后，按qixzol试剂说明书提取阳性单克隆抗体细胞株22e7的总rna，提取结束后用紫外分光光度计测rna浓度和纯度。取4μg rna，加入10mm dntp mix、oligo(dt)(500μg/ml)、5x first-strand buffer、0.1m dtt、rnaseout
tm
recombinant ribonuclease inhibitor和m-mlv rt进行逆转录合成cdna。以cdna为模板使用高保真酶(flash mastermix，p510-aa)对目的基因片段进行扩增，引物序列见下表1。pcr反应条件：98℃预变性30s后，98℃10s，55℃5s，72℃5s，共30个循环，最后72℃，1min彻底延伸。取40μl pcr产物使用1％琼脂糖电泳进行核酸电泳。
71.表1
72.[0073][0074]
按gel extractionkit说明书纯化条带大小在300bp左右的pcr产物。按照zero backgroundptopo-blunt cloning kit说明书分别将轻重链可变区域目的基因与ptopo-blunt载体连接，构建重组子，冰上融化感受态dh10b受体菌，加入2μl构建好的重组子进行电转，加入提前准备好的soc，37℃，250rpm，1h，然后涂布于lb平板(含100μg/mlamp)上，37℃过夜培养。第二天，使用无菌枪头从平板上分别挑取10个轻重链单克隆菌落于1ml含50μg/ml amp的lb培养基中，37℃，250rpm培养10h后送菌液一代测序，测序引物使用通用引物m13f和m13r。
[0075]
对筛选到单克隆抗体轻链和重链可变区进行测序，细胞株22e7的单克隆抗体的重链的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示，轻链的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6所示，重链可变区的氨基酸序列为seq id no.7，对应核酸序列为seq id no.9，轻链可变区的氨基酸序列为seq id no.8，对应核酸序列为seq id no.10。
[0076]
实施例3
[0077]
本实施例测定筛选到单克隆抗体的中和效价。
[0078]
对筛选获得的单克隆细胞株22e7进行中和效价的测定，实验选取ev71-xf株型(genebank：jq804832)来进行测定，首先将单抗分别稀释成0.4μg/ml、0.7μg/ml、1.4μg/ml、2.8μg/ml、5.6μg/ml、11.3μg/ml、22.5μg/ml、45μg/ml、90μg/ml和180μg/ml的浓度梯度，再将ev71病毒稀释至100tcid
50
，随后分别与稀释好的单抗等体积混匀，在37℃孵育，2h后，感染rd细胞，3天后观察细胞病变，计算中和效价，结果如表2所示，其中“√”表示无细胞病变，有中和活性，
“‑”
表示有细胞病变，无中和活性，结果表明，本发明抗ev71病毒抗体对ev71-xf株具有良好的中和活性。
[0079]
表2
[0080][0081]
综上所述，本发明筛选得到的抗ev71病毒抗体能够识别ev71-vp1蛋白的空间表位，不能识别线性表位，对ev71-xf株具有良好的中和效果，为ev71特异性抗病毒药物的研究提供了科学依据，为人源化治疗性抗体研究奠定了基础，对进一步开展ev71病毒感染疾病机制研究与防控策略制定有重要意义。
[0082]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。