一种同时检测蒙古白丽蘑和双孢蘑菇真实性的引物和探针的制作方法

1.本发明属于食品检测技术领域，尤其涉及食用菌中蘑菇检测领域。


背景技术：

2.蒙古白丽蘑性平、味甘、有宣肠益气、散热、解表的效用。因其子实体大，菌肉紧实而肥厚，质地鲜嫩，具有独特香味，是远近闻名的野生食用菌。蒙古白丽蘑的名贵之处在其具有的香鲜味道，其含有大量香脂类挥发性物质及谷氨酸钠、白丽蘑氨酸、5
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鸟甘醇等鲜味物质与增鲜物质，其香鲜味回味无穷，远远就能闻到。蒙古白丽蘑不但营养价值高，而且富含多糖、多肽、多不饱和脂肪酸、人体必需的8种氨基酸以及多种维生素和铁、钙、磷、硒等矿物质，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降血压、血脂、血糖等医疗保健作用，可治疗燥热不安等症状。其氨基酸成分可与动物食物中氨基酸成分平衡，在人体内具有更好的吸收作用，调节人体的机能，增强身体的免疫能力，适用于消化不良，腹部胀痛，胃痛。也可降低血压，治疗软骨症，还具有一定的抗癌作用。具有杀菌作用，蒙古族有用白丽蘑作药的记载，治疗外伤、解毒等民间流传方法。其属于低热量食品，非常适用于减肥及健身人群。由于人为因素和气候因素的影响，使得蒙古白丽蘑种群数量减少，蒙古白丽蘑的质量和产量每况愈下，难以满足商品化、市场化的要求，导致蒙古白丽蘑价格上涨。由于其价格的昂贵和特有珍稀价值高，市场上常出现冒充伪劣产品和其他种类野生菌混淆的现象。而商家经常以一些来源广泛、容易获取的蘑菇充当蒙古白丽蘑进行销售。例如，杏鲍菇、秀珍菇、双孢蘑菇等商用食用菌常被用来制作白丽蘑蘑菇酱。
3.我国对于食用菌真伪鉴别技术方面的研究起步晚，这一领域的研究还处于初步阶段。由此可见，当前在食用菌真伪鉴别技术方面的研究领域，实现具有我国自主产权的、安全高效的检测技术是一个充满机遇同时极具挑战的研究课题。作为蒙古白丽蘑产地的锡林郭勒盟迫切需要研发具有自主知识产权的蒙古白丽蘑和双孢蘑菇的相关蘑菇真伪鉴别技术及检测标准，以此保护地方特色蘑菇和维护消费者的合法权益。目前，蘑菇真伪鉴别相关的技术研究、检测标准、发明专利以及商业试剂盒主要集中在普通pcr its的技术，实时荧光pcr直接检测和多通道同管质控检测报道较少。假阴性也是困扰pcr技术在蘑菇真伪鉴别中广泛应用的瓶颈。同管质控是去除假阴性的有效手段。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种高效且特异性强的蘑菇中蒙古白丽蘑、双孢蘑菇以及质控同管检测的引物和探针，解决蘑菇中蒙古白丽蘑和双孢蘑菇源性成分定性和定量检测问题。
5.本发明的技术方案为：蒙古白丽蘑、双孢蘑菇以及质控同管检测的引物和探针组合，引物和探针序列如下：
6.正向引物序列如seq id no.1所示；
7.反向引物序列如seq id no.2所示；
8.蒙古白丽蘑探针序列如seq id no.3所示；
9.双孢蘑菇探针序列如seq id no.4所示；
10.质控探针序列如seq id no.5所示。
11.进一步地，蒙古白丽蘑探针、双孢蘑菇探针和质控探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，报告基团为fam、hex、rox或cy5中的任意一种，淬灭基团为tamra、mgb、bhq1或bhq2中任意一种。
12.上述所述的引物和探针组合在蒙古白丽蘑、双孢蘑菇检测中的应用。
13.一种试剂盒，含有上述所述的引物和探针组合。
14.蘑菇中蒙古白丽蘑源性、双孢蘑菇源性以及质控同管检测的方法，步骤如下：
15.(1)提取蘑菇样品的dna；
16.(2)以步骤(1)的dna为模板，利用seq id no.1～seq id no.5的引物和探针进行多重荧光定量pcr扩增，以蒙古白丽蘑和双孢蘑菇的阳性标准品做阳性对照，以灭菌的去离子水做阴性对照，以dna提取的空白对照做提取方法的对照组；(3)real-time pcr反应结束后，设置threshold为自动，读取蒙古白丽蘑、双孢蘑菇和质控相应探针的ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的ct；只有当质控ct≤40和阳性对照ct≤40，阴性对照和空白对照ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的ct≤40，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的ct≤40，结果判定为具有相应两蘑菇；
17.(4)利用蒙古白丽蘑和双孢蘑菇阳性标准品做dna定量的标准曲线；
18.(5)利用蘑菇中的相应蘑菇源性的ct值和标准曲线中的公式可以得到蘑菇中相应蘑菇源性的定量检测结果。
19.进一步地，real-time pcr扩增参数为：预变性温度94℃，30s，变性温度94℃，5s，退火延伸温度60℃，31s，40个循环。
20.进一步地，real-time pcr反应体系为：probe qpcr预混液10μl、seq id no.1所示的正向引物1μl，浓度为10μmol/l；seq id no.2所示的反向引物1μl，浓度为10μmol/l；seq id no.3所示的蒙古白丽蘑探针0.5μl，浓度为10μmol/l；、seq id no.4所示的双孢蘑菇探针0.5μl，浓度为10μmol/l和seq id no.5所示的质控探针0.5μl，浓度为10μmol/l；dna模板2μl，灭菌的去离子水4.5μl，总体积20μl。
21.本发明通过比对蒙古白丽蘑、双孢蘑菇、香杏丽菇、秀珍菇、香菇、杏鲍菇、金针菇、海鲜菇、白玉菇、大白桩菇、金钱菇、虫草菇、牛肚菇、松茸、羊肚菇、茶树菇和姬松茸等17种食用菌its基因组，每种食用菌选取10个品种或品系的its基因组序列。通过生物信息软件比对上述170条序列，筛选出蒙古白丽蘑和双孢蘑菇保守和特异的序列，利用引物设计软件进行引物和探针的设计。设计的创新性在于需要在100-150bp的序列上筛选出两端保守和中间特异的序列，两端保守的位置设计引物，中间特异的位置设计探针。保守的引物和特异的探针可以有效的减少引物之间的错配以及多个pcr反应对反应资源的竞争，可以保证多重实时荧光定量pcr反应的进行。多重实时荧光定量pcr反应是多源性成分检测的基础。引物和探针的退火温度控制在55-60℃和65-70℃，并且没有影响退火效率的二级结构，而且要保证引物和探针在its基因上具有高度的特异性，上述设计保证引物和探针可以用于后续的定性和定量检测。
22.本发明研发了蒙古白丽蘑、双孢蘑菇及质控等3通道检测引物和探针，优化多通道
多蘑菇检测和同管质控检测的引物和探针组合。在此过程中克服了同一pcr反应体系中多种引物和探针之间的影响以及对模板以及pcr反应资源的竞争的问题，达到pcr反应体系可以同时进行多重实时荧光pcr的效果。
23.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
24.本发明的引物、探针的特异性强、灵敏度高，可以实现蘑菇中蒙古白丽蘑和双孢蘑菇的定性和定量检测，并且可以进行蒙古白丽蘑、双孢蘑菇和质控的同时检测，节省了工序，降低了成本。
附图说明
25.图1利用hex和tamra修饰探针标记蒙古白丽蘑、fam和mgb修饰探针标记双孢蘑菇及rox和bhq2修饰探针标记质控对照对香杏丽菇、秀珍菇、香菇、杏鲍菇、金针菇、海鲜菇、白玉菇、大白桩菇、金钱菇、虫草菇、牛肚菇、松茸、羊肚菇、茶树菇及姬松茸等15种蘑菇(其它蘑菇)进行的实时荧光定量pcr的检测，蒙古白丽蘑中出现扩增曲线，其它蘑菇都没有出现扩增曲线，说明蒙古白丽蘑引物和探针具有特异性。
26.图2利用hex和tamra修饰探针标记蒙古白丽蘑、fam和mgb修饰探针标记双孢蘑菇及rox和bhq2修饰探针标记质控对照对香杏丽菇、秀珍菇、香菇、杏鲍菇、金针菇、海鲜菇、白玉菇、大白桩菇、金钱菇、虫草菇、牛肚菇、松茸、羊肚菇、茶树菇及姬松茸等15种蘑菇(其它蘑菇)进行的实时荧光定量pcr的检测，双孢蘑菇中出现扩增曲线，其它蘑菇都没有出现扩增曲线，说明双孢蘑菇引物和探针具有特异性。
27.图3利用hex和tamra修饰探针标记蒙古白丽蘑对蒙古白丽蘑dna(100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0005ng、0.00025ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，蒙古白丽蘑探针可以检测到1pg的蒙古白丽蘑dna。以上结果说明蒙古白丽蘑探针在蘑菇检测方面具有较高的灵敏度。
28.图4利用fam和mgb修饰探针标记双孢蘑菇对双孢蘑菇dna(100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng、0.0005ng、0.00025ng、0.0001ng和0.00001ng)进行检测灵敏度扩增实验，双孢蘑菇探针可以检测到0.25pg的双孢蘑菇dna。以上结果说明双孢蘑菇探针在蘑菇检测方面具有较高的灵敏度。
29.图5蒙古白丽蘑检测标准曲线：用于蘑菇中蒙古白丽蘑的定量检测。
30.图6双孢蘑菇检测标准曲线：用于蘑菇中双孢蘑菇的定量检测。
具体实施方式
31.1、检测方法：
32.(1)提取蘑菇样品的dna，设立提取空白对照(后续做提取方法的对照组)。
33.(2)检测dna的浓度和质量，并将浓度稀释至100-200ng/μl。
34.(3)利用多重荧光定量pcr引物和探针对稀释dna进行扩增检测，利用蒙古白丽蘑和双孢蘑菇阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用dna提取的空白对照做提取方法的对照组，real-time pcr反应体系如表1所示，real-time pcr扩增参数如表4所示。
35.表1 real-time pcr反应体系(蒙古白丽蘑、双孢蘑菇和质控的同时检测)
36.成分体积(微升)probe qpcr预混液10正向引物1反向引物1蒙古白丽蘑探针0.5双孢蘑菇探针0.5质控探针0.5dna2灭菌的去离子水4.5总体积20
37.表2 real-time pcr反应体系(蒙古白丽蘑以及质控同时检测)
[0038][0039][0040]
表3 real-time pcr反应体系(双孢蘑菇以及质控同时检测)
[0041]
成分体积(微升)probe qpcr预混液10正向引物1反向引物1双孢蘑菇探针0.5质控探针0.5dna2灭菌的去离子水5总体积20
[0042]
表4 real-time pcr扩增参数
[0043][0044]
(4)real-time pcr反应结束后，设置threshold为自动，读取蒙古白丽蘑、双孢蘑菇和质控相应探针的ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的ct；只有当质控ct≤40和阳性对照ct≤40，阴性对照和空白对照ct为0时才可以进行相应蘑菇探针结果的判定；当相应探针的ct≤40，结果判定为具有相应蘑菇源性，同时有多个探针的ct≤40，结果判定为具有相应两蘑菇源性。
[0045]
2、引物和探针序列的设计
[0046]
由于真菌的dna在its上的差异较小，所以选择真菌dna its基因组设计蒙古白丽蘑、双孢蘑菇和质控检测引物和探针。引物和探针的合成方法：委托北京睿博兴科生物公司按照发明的序列进行合成和纯化。
[0047]
正向引物：5'cttgcgctccttggtattc 3'(seq id no.1)，
[0048]
反向引物：5'gctaatgywtttmagaggagc 3'(seq id no.2)，
[0049]
蒙古白丽蘑探针：5'cttttcagcttttgcgagttggattg 3'(seq id no.3)，
[0050]
双孢蘑菇探针：5'tattctcaactctccaatactttgtt 3'(seq id no.4)，
[0051]
质控探针：5'aggagcatgcctgtttgagtgtcat 3'(seq id no.5)；
[0052]
蒙古白丽蘑、双孢蘑菇和质控探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为fam、hex、rox或cy5中的任意一种，所述淬灭基团为tamra、mgb、bhq1或bhq2中任意一种。
[0053]
3、引物和探针的特异性检测
[0054]
单蘑菇源性检测的real-time pcr反应体系如下表所示
[0055]
成分体积(微升)probe qpcr预混液10正向引物1反向引物1相应蘑菇源性探针0.5质控探针0.5dna2灭菌的去离子水4.5总体积20
[0056]
利用hex和mgb修饰探针标记蒙古白丽蘑、fam和mgb修饰探针标记双孢蘑菇及rox和bhq2修饰探针标记质控对照对蒙古白丽蘑、双孢蘑菇、香杏丽菇、秀珍菇、香菇、杏鲍菇、金针菇、海鲜菇、白玉菇、大白桩菇、金钱菇、虫草菇、牛肚菇、松茸、羊肚菇、茶树菇和姬松茸进行qpcr的检测。
[0057]
检测结果如下：
[0058][0059][0060]
ct值：平均值(三组数据)
±
标准差；
[0061]
结果说明：ct小于40(不为0)说明样品中有相应蘑菇源性。检测结果符合样品蘑菇来源。在蒙古白丽蘑检测出蒙古白丽蘑源性，在双孢蘑菇中检测出双孢蘑菇源性，而在其蘑菇中没有检测到蒙古白丽蘑源性和双孢蘑菇源性。
[0062]
4、相应蘑菇源性检测的引物和探针的检测限度实验
[0063]
将蒙古白丽蘑和双孢蘑菇的基因组dna加灭菌ddh2o稀释，使其浓度为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl、0.001ng/μl、0.0005ng/μl、0.00025ng/μl、0.0001ng/μl和0.00001ng/μl，共稀释10次，进行引物和探针的检测限度扩增实验。由以下结果可知，蒙古白丽蘑探针可以检测到样品中1pg的蒙古白丽蘑dna，双孢蘑菇探针可以检测到样品中0.25pg的双孢蘑菇dna。以上结果说明自主研发的蒙古白丽蘑和蘑菇引物和探针的检测限度达到pg水平，检测的灵敏度较高。
[0064]
检测结果如下：
[0065]
[0066][0067]
ct值：平均值(三组数据)
±
标准差；n/a:不适用于检测
[0068]
5、利用hex和mgb修饰探针标记蒙古白丽蘑和fam和mgb修饰探针标记双孢蘑菇分别建立蒙古白丽蘑和双孢蘑菇的标准曲线。
[0069]
检测结果如下：
[0070][0071]
扩增效率接近90％-110％，线性拟合r2≥0.98，以上结果说明自主研发的蒙古白丽蘑和双孢蘑菇引物和探针的标准曲线好，能够进行定量检测。