一种纳米大小羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法与流程

1.本发明属医药技术领域，具体涉及一种纳米大小羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法。


背景技术：

2.血管的稳态是由内皮细胞、血小板和凝血系统的动态相互作用来保证的。因此，颗粒材料的血管安全必须解决这一综合系统，这种方法在很大程度上被忽略了。羟基磷灰石由于其与骨骼和牙齿的无机相相似，具有多种生物医学应用。因此，它被广泛用于各种与骨修复有关的应用中，包括单独或作为复合/混合材料修复/再生、增生和涂层材料，以及最近用于牙釉质再矿化剂和牙膏的散装和颗粒制剂。无论是在骨骼或牙齿内的局部应用(在植入材料降解和扩散事件后，或在牙膏使用的口腔环境中的重复应用)，还是在那些以循环策略为目标的应用中，羟基磷灰石颗粒都出现在血管区间。在这里，在尺寸、形态和表面特性方面具有广泛特征的颗粒与复杂的细胞和生化血液环境接触并相互作用。
3.在血管区，内皮细胞、血小板和凝血因子的协同作用确保了血管和组织内稳态的维持。内皮是衬在血管内的单层细胞，是血液和非血管组织之间的动态界面，形成一道屏障，防止血液成分与内皮下细胞外基质接触。此外，它还通过表达和分泌血管活性分子协助维持适当的血流和防止血管内血小板活化和血液凝固，在调节血管张力方面具有关键作用。对这个连续的细胞单层的损害会暴露出内皮下组织，从而触发局部血小板的募集、粘附、激活和聚集。在这种情况下，羟基磷灰石颗粒在血管环境中的存在可能会影响这种动态内稳态，因此对羟基磷灰石颗粒的评估是对其安全性的要求。虽然已经对羟基磷灰石颗粒的生物相容性进行了分析，特别是针对骨组织，而关于其与血管室相互作用的信息却很少，而且很松散，无法确定羟基磷灰石颗粒的血管安全性。


技术实现要素：

4.本发明第一方面的目的，在于提供一种羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法。
5.本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的检测方法在羟基磷灰石颗粒生物安全性评价中的应用。
6.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
7.本发明分析了商用羟基磷灰石颗粒在内皮细胞行为方面的影响，因为它们与临床有关，而关于其血管生物安全性数据却很稀少。
8.本发明的第一个方面，提供一种羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法，包括以下步骤：
9.(1)构建血管内皮细胞单层；
10.(2)在步骤(1)中的血管内皮细胞单层中加入含羟基磷灰石颗粒的培养液，培养；
11.(3)以不加含羟基磷灰石颗粒的培养液与步骤(1)中的血管内皮细胞单层共培养为对照组，仅含有培养液且不含细胞为空白组，检测细胞活性，计算细胞存活率。
12.步骤(1)具体为：将细胞在48孔板内培养至细胞密度不低于80％，去除培养液，即得到血管内皮细胞单层。
13.优选地，所述细胞为huvec细胞、eahy926细胞、hmwc-1、hulec-5a中的至少一种。
14.优选地，步骤(2)中所述羟基磷灰石颗粒的终浓度为1～1500μg/ml。
15.进一步优选地，步骤(2)中所述羟基磷灰石颗粒的终浓度为1～1000μg/ml。
16.优选地，所述含羟基磷灰石颗粒的培养液的制备方法为：将羟基磷灰石颗粒与培养基混合，即得到含羟基磷灰石颗粒的培养液。
17.优选地，步骤(2)中所述培养的条件为37℃培养20～30h。
18.进一步优选地，步骤(2)中所述培养的条件为37℃培养20～24h。
19.优选地，所述羟基磷灰石颗粒为球状形态和/或棒状形态的羟基磷灰石颗粒。
20.优选地，所述棒状形态的羟基磷灰石颗粒的长度分布在10～100nm，宽度分布在5～50nm。
21.进一步优选地，所述棒状形态的羟基磷灰石颗粒的长度分布在20～90nm，宽度分布在5～30nm。
22.优选地，所述棒状形态的羟基磷灰石颗粒的比表面积为25～35m2/g。
23.进一步优选地，所述棒状形态的羟基磷灰石颗粒的比表面积为30～35m2/g。
24.优选地，所述球状形态的羟基磷灰石颗粒的长度分布在10～100nm，宽度分布在10～100nm。
25.进一步优选地，所述球状形态的羟基磷灰石颗粒的长度分布在10～90nm，宽度分布在10～90nm。
26.优选地，所述球状形态的羟基磷灰石颗粒的比表面积为80～90m2/g。
27.进一步优选地，所述球状形态的羟基磷灰石颗粒的比表面积为80～85m2/g。
28.优选地，所述羟基磷灰石颗粒表面含有碳(c1s)元素、氧(o1s)元素、钙(ca2p3)元素和磷(p2p)元素。
29.优选地，步骤(3)采用mtt法或cck8法检测细胞活性。
30.本发明第二方面，提供本发明第一方面的检测方法在羟基磷灰石颗粒生物安全性评价中的应用。
31.本发明的有益效果是：
32.本发明直接将血管内皮细胞单层暴露于广泛浓度范围的羟基磷灰石颗粒中，通过检测细胞活性即可评估羟基磷灰石颗粒对血管内皮细胞单层的毒性作用，以评价羟基磷灰石颗粒对血管室的相互作用，该方法具有操作简单、重现性好和判定方便等优点，克服了现有技术关于羟基磷灰石颗粒与血管室相互作用的信息却很少的缺点，可有效解决羟基磷灰石颗粒材料的血管安全性评价的问题。
33.进一步本发明将huvec细胞接种在48孔板上培养至细胞密度为80％以构建血管内皮细胞单层，该建血管内皮细胞单层可以模拟血管室真实的血管内皮单层，方便用于分析与内皮细胞的相互作用以解决生物材料的血管效应。
附图说明
34.图1为不同浓度的羟基磷灰石颗粒(棒状和球状)溶解在无菌生理盐水和dmem培养基溶液中的实图。
35.图2为羟基磷灰石颗粒(棒状和球状)的透射电子显微镜图。
36.图3为羟基磷灰石颗粒(棒状和球状)的长、宽分布统计结果图。
37.图4为羟基磷灰石颗粒(棒状和球状)的xps能谱图。
38.图5为通过浓度梯度法确定huvec细胞密度的表征曲线。
39.图6为不同浓度的huvec细胞铺板2天后的光镜照片。
40.图7为不同浓度羟基磷灰石颗粒(棒状和球状)与huvec单层直接接触培养(暴露)24h的细胞存活率的结果统计图。
具体实施方式
41.以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
42.应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
43.本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
44.实施例1
45.一种纳米大小羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法，包括以下步骤：
46.(1)按每孔4万个细胞将huvec细胞接种在48孔板内，培养至细胞密度大于80％，吸弃原有培养液，pbs冲洗3次，向每孔内加入1ml羟基磷灰石颗粒细胞培养液(含有1000μg/ml羟基磷灰石颗粒)作为实验组，向每孔内加入1ml的dmem培养基作为对照组，向48孔板中的空白孔(即不含有huvec细胞)加入1ml的dmem培养基作为空白组，每个处理3个复孔；
47.(2)将48孔板置于培养箱内37℃5％co2培养24h，吸弃原有培养液，用pbs冲洗3次，加入360ul无血清dmem培养基和40ul的cck8溶液继续培养4h；
48.(3)将上清液转移至96孔板后，测定各孔450nm处的吸光度值(od值)，根据以下计算公式计算细胞存活率，细胞存活率＝(实验组od值-空白组od值)/(对照组od值-空白组od值)
×
100％。
49.羟基磷灰石颗粒细胞培养液的制备方法为：在精密称量仪上量取10mg棒状的羟基磷灰石颗粒(命名为rods形态的羟基磷灰石颗粒，购买自sigma公司，货号为900194)，用70％乙醇配制成10mg/ml羟基磷灰石颗粒溶液，按照浓度梯度稀释法，获得浓度为1000μg/ml的羟基磷灰石颗粒溶液；将上述羟基磷灰石颗粒溶液室温保存24h；1000rpm离心5min，弃掉70％乙醇溶液，加入羟基磷灰石颗粒溶液等体积的无菌生理盐水冲洗羟基磷灰石颗粒，重复冲洗3次，1000rpm离心5min，弃掉无菌生理盐水，得到无菌的羟基磷灰石颗粒；加入羟基磷灰石颗粒溶液等体积的dmem培养基重悬羟基磷灰石颗粒，得到含有1000μg/ml羟基磷灰石颗粒的羟基磷灰石颗粒细胞培养液(图1)。
50.实施例2
51.一种纳米大小羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法，与实施例1唯一的区别在于：羟基磷灰石颗粒细胞培养液的中含有500μg/ml羟基磷灰石颗粒。
52.实施例3
53.一种纳米大小羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法，与实施例1唯一的区别在于：羟基磷灰石颗粒细胞培养液的中含有250μg/ml羟基磷灰石颗粒。
54.实施例4
55.一种纳米大小羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法，与实施例1唯一的区别在于：羟基磷灰石颗粒细胞培养液的中含有100μg/ml羟基磷灰石颗粒。
56.实施例5
57.一种纳米大小羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法，与实施例1唯一的区别在于：羟基磷灰石颗粒细胞培养液的中含有50μg/ml羟基磷灰石颗粒。
58.实施例6
59.一种纳米大小羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法，与实施例1唯一的区别在于：羟基磷灰石颗粒细胞培养液的中含有10μg/ml羟基磷灰石颗粒。
60.实施例7
61.一种纳米大小羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法，与实施例1唯一的区别在于：羟基磷灰石颗粒细胞培养液的中含有1μg/ml羟基磷灰石颗粒。
62.实施例8
63.一种纳米大小羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法，与实施例1唯一的区别在于：羟基磷灰石颗粒为球状形态的(命名为spheres形态的羟基磷灰石颗粒，购买自sigma公司，货号为677418)。
64.实施例9
65.一种纳米大小羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法，与实施例8唯一的区别在于：羟基磷灰石颗粒细胞培养液的中含有500μg/ml羟基磷灰石颗粒。
66.实施例10
67.一种纳米大小羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法，与实施例8唯一的区别在于：羟基磷灰石颗粒细胞培养液的中含有250μg/ml羟基磷灰石颗粒。
68.实施例11
69.一种纳米大小羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法，与实施例8唯一的区别在于：羟基磷灰石颗粒细胞培养液的中含有100μg/ml羟基磷灰石颗粒。
70.实施例12
71.一种纳米大小羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法，与实施例8唯一的区别在于：羟基磷灰石颗粒细胞培养液的中含有50μg/ml羟基磷灰石颗粒。
72.实施例13
73.一种纳米大小羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法，与实施例8唯一的区别在于：羟基磷灰石颗粒细胞培养液的中含有10μg/ml羟基磷灰石颗粒。
74.实施例14
75.一种纳米大小羟基磷灰石颗粒的血管内皮细胞单层毒性检测方法，与实施例8唯一的区别在于：羟基磷灰石颗粒细胞培养液的中含有1μg/ml羟基磷灰石颗粒。
76.效果实施例
77.1.实施例1和实施例8的羟基磷灰石颗粒的粒径分布、比表面积、表明化学元素
78.为了获得粒径分布，用透射电子显微镜(tem)观察羟基磷灰石颗粒的大小和形，采用imagej软件对100个羟基磷灰石颗粒进行分析。使用micromeritics的加速表面积系统2020通过n2吸附法测定比表面积，其中平衡时间为15s，120℃下排气120min。用x-射线光电子能谱仪(xps)检测ha纳米粒子的表面化学元素。
79.通过透射电子显微镜观察羟基磷灰石颗粒的大小和形态，实施例实施例1和实施例8的羟基磷灰石颗粒的形态主要分为棒状和球状两个形态，其中棒状形态的羟基磷灰石颗粒的长度分布在20～90nm，宽度分布在5～30nm，球状形态的羟基磷灰石颗粒的长度分布在10～90nm，宽度分布在10～90nm(图2和图3)。棒状和球状形态的羟基磷灰石颗粒的比表面积分别为32.3m2/g和83.4m2/g。通过x-射线光电子能谱仪检测了所使用的羟基磷灰石颗粒的表面化学元素，结果如图4所示，棒状和球状形态的羟基磷灰石颗粒表面含有碳(c1s)、氧(o1s)、钙(ca2p3)和磷(p2p)。
80.2.huvec细胞
81.按每孔4万个细胞将huvec细胞(p3)接种至48孔板中，37℃5％co2培养2天后孔中细胞密度长至80％，收集细胞，用浓度梯度法稀释细胞悬液，稀释液为pbs，铺96孔板，每个细胞浓度4个复孔；孵育3h后，大部分细胞均已贴壁，加入10μl cck-8和90μl无血清dmem继续孵育4h，测定450nm处的吸光度值，结果如表1所示，随着细胞数量的增加，od值逐渐增大(图5)，其中4
×
104个/ml的od值在1.5～2.5，该细胞密度符合血管内皮细胞单层的细胞密度，可用于测定羟基磷灰石颗粒对血管内皮细胞单层的毒性。
82.表1不同huvec细胞数量与cck-8试剂孵育4h后的吸光度
[0083][0084]
进一步为了证明本发明将4
×
104个/mlhuvec细胞在48孔板中培养至细胞密度为80％可以模拟血管内皮细胞单层的事实，发明人提供了以不同细胞浓度(1
×
104个/ml、2
×
104个/ml、3
×
104个/ml、6
×
104个/ml、6
×
104个/ml、8
×
104个/ml和1
×
105个/ml)的huvec细胞铺板培养2天后的光镜图，可以看出，不同浓度的huvec细胞在48孔板中培养2天后的细胞密度存在一定差异(图6)，其中，以4
×
104个/ml培养至80％细胞密度更符合血管内皮细胞单层的细胞密度。表明使用测定羟基磷灰石颗粒对该细胞密度的uvec细胞的细胞毒性，可有效评估羟基磷灰石颗粒进入血管内皮细胞单层后的毒性。
[0085]
3.不同浓度羟基磷灰石颗粒对huvec细胞的细胞毒性
[0086]
通过利用实施例1～14的细胞毒性检测方法评估不同浓度的羟基磷灰石颗粒对huvec细胞的细胞毒性，结果如图7所示，棒状形态的羟基磷灰石颗粒在1～1000μg/ml浓度范围对huvec细胞的细胞毒性较小，几乎没有毒性作用，且各浓度之间无明显差异。而球状形态的羟基磷灰石颗粒在1～50μg/ml浓度范围对huvec细胞的细胞毒性较小，且该浓度范
围内的羟基磷灰石颗粒对细胞的毒性作用无明显差异；随着羟基磷灰石颗粒浓度的增加至100μg/ml，其对huvec细胞的细胞毒性作用较大；当羟基磷灰石颗粒浓度为250～1000μg/ml时，huvec细胞的细胞活性约为50％，表明该浓度范围内球状形态的羟基磷灰石颗粒的细胞毒性较大。综上所述，本发明提供的检测方法可有效评估羟基磷灰石颗粒进入血管内皮细胞单层后的毒性。
[0087]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。