神香草中松香烷二萜及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及大苞荆芥地上部分分离纯化技术领域，是一种神香草中松香烷二萜及其制备方法和应用，其中，神香草中松香烷二萜为所述nepetabrate g的简称。


背景技术：

2.大苞荆芥nepeta bracteata benth.为唇形科(labiatae)荆芥属nepeta植物，维吾尔名为“祖发印地”，为新疆维吾尔医院的一种进口药材，主要分布于巴基斯坦、伊朗、尼泊尔等国家。具有镇咳平喘、清热利湿的作用。常被用于治疗气管炎症、咳嗽气喘、感冒发烧、小便不利。现代药理学研究表明其所含的成分具有显著的抗炎活性。可通过抑制白细胞介素-17(il-17)的分泌，纠正th1/th2型细胞因子失衡，发挥抗炎作用。松香烷二萜类化合物作为大苞荆芥的优势成分。因此，探究大苞荆芥的松香烷二萜类组成份与抗炎作用的关系并进一步挖掘其潜在的药用价值，对于开发利用大苞荆芥具有重要意义。


技术实现要素：

3.本发明提供了一种nepetabrate g及其制备方法和作为制备预防肿瘤和抗肿瘤药物的应用，克服了上述现有技术之不足，本发明首次公开了nepetabrate g，本发明nepetabrate g对脂多糖(lps)刺激的raw 264.7细胞具有较强的抗炎作用，从而使得nepetabrate g能够作为制备预防炎症药物和抗炎药物的应用。
4.本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种具有含环外双键的松香烷结构骨架的nepetabrate g，化学结构式为
[0005][0006]
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：
[0007]
上述nepetabrate g按照下述方法得到：第一步，将大苞荆芥地上部分粉碎过筛并加入乙醇，在室温下浸泡3小时至4小时后，在50℃至60℃条件下加热回流提取3次，每次1小时至3小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将大苞荆芥总浸膏用水分散成混悬液后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，将萃取液浓缩得到各部位浸膏；第三步，取石油醚部位浸膏用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到8个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为1:0、100:1、50:1、25:1、8:1、5:1、1:1、0:1；第四步，将第7个馏分用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到4个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为15:1、5:1、3:1、1:1；第五步，将第四步得到的第3个馏分用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到3个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为10:1、5:1、3:1；第六步，将第五步得到的第1个馏分经高效液相色
谱梯度洗脱后纯化分离，并收集洗脱物，在第26.5分钟处得到nepetabrate g。
[0008]
上述第一步中，每1g大苞荆芥地上部分加入8ml至12ml乙醇。
[0009]
上述第六步中，高效液相色谱梯度洗脱的洗脱液为甲醇和水的混合液，其中，甲醇和水的体积比为85：15。
[0010]
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种nepetabrate g的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：第一步，将大苞荆芥地上部分粉碎过筛并加入乙醇，在室温下浸泡3小时至4小时后，在50℃至60℃条件下加热回流提取3次，每次1小时至3小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将大苞荆芥总浸膏用水分散成混悬液后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，将萃取液浓缩得到各部位浸膏；第三步，取石油醚部位浸膏用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到8个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为1:0、100:1、50:1、25:1、8:1、5:1、1:1、0:1；第四步，将第7个馏分用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到4个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为15:1、5:1、3:1、1:1；第五步，将第四步得到的第3个馏分用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到3个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为10:1、5:1、3:1；第六步，将第五步得到的第1个馏分经高效液相色谱梯度洗脱后纯化分离，并收集洗脱物，在第26.5分钟处得到nepetabrate g。
[0011]
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：
[0012]
上述第一步中，每1g大苞荆芥地上部分加入8ml至12ml乙醇。
[0013]
上述第六步中，高效液相色谱梯度洗脱的洗脱液为甲醇和水的混合液，其中，甲醇和水的体积比为85：15。
[0014]
本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种nepetabrate g作为制备预防炎症药物的应用。
[0015]
本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：一种nepetabrate g作为制备抗炎药物的应用。
[0016]
本发明的技术方案之五是通过以下措施来实现的：一种nepetabrate g作为制备防治炎症保健品的应用。
[0017]
本发明首次公开了具有含环外双键的松香烷结构骨架的nepetabrate g，本发明nepetabrate g对脂多糖(lps)刺激的raw 264.7细胞具有较强的抗炎作用，从而使得nepetabrate g能够作为制备预防炎症药物和抗炎药物的应用。
附图说明
[0018]
附图1为本发明nepetabrate g的化学结构图。
[0019]
附图2为本发明nepetabrate g的hr-ms图谱。
[0020]
附图3为本发明nepetabrate g的1h-nmr谱图。
[0021]
附图4为本发明nepetabrate g的
13
c-apt谱图。
[0022]
附图5为本发明nepetabrate g的h
1-h
1 cosy谱图。
[0023]
附图6为本发明nepetabrate g的hsqc谱图。
[0024]
附图7为本发明nepetabrate g的hmbc谱图。
[0025]
附图8为本发明nepetabrate g的noesy谱图。
[0026]
附图9为本发明nepetabrate g对raw264.7细胞的毒性作用柱状图。
[0027]
附图10为本发明nepetabrate g对lps诱导的raw264.7细胞的tnf-α水平影响图。
具体实施方式
[0028]
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现有技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的百分数如没有特殊说明，均为质量重量百分数；本发明中的溶液若没有特殊说明，均为溶剂为水的水溶液，例如，盐酸溶液即为盐酸水溶液；本发明中的常温、室温一般指15℃到25℃的温度，一般定义为25℃。
[0029]
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
[0030]
实施例1：该nepetabrate g，化学结构式为
[0031][0032]
实施例2：作为上述实施例的优化，按照下述方法得到：第一步，将大苞荆芥地上部分粉碎过筛并加入乙醇，在室温下浸泡3小时至4小时后，在50℃至60℃条件下加热回流提取3次，每次1小时至3小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将大苞荆芥总浸膏用水分散成混悬液后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，将萃取液浓缩得到各部位浸膏；第三步，取石油醚部位浸膏用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到8个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为1:0、100:1、50:1、25:1、8:1、5:1、1:1、0:1；第四步，将第7个馏分用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到4个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为15:1、5:1、3:1、1:1；第五步，将第四步得到的第3个馏分用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到3个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为10:1、5:1、3:1；第六步，将第五步得到的第1个馏分经高效液相色谱梯度洗脱后纯化分离，并收集洗脱物，在第26.5分钟处得到nepetabrate g。
[0033]
实施例3：作为上述实施例的优化，第一步中，每1g大苞荆芥地上部分加入8ml至12ml乙醇。
[0034]
实施例4：作为上述实施例的优化，第四步中，高效液相色谱梯度洗脱的洗脱液为甲醇和水的混合液，其中，甲醇和水的体积比为85：15。
[0035]
实施例5：该nepetabrate g的制备方法按照下述方法进行：第一步，将大苞荆芥地上部分粉碎过筛并加入乙醇，在室温下浸泡3小时至4小时后，在50℃至60℃条件下加热回流提取3次，每次1小时至3小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将大苞荆芥总浸膏用水分散成混悬液后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，将萃取液浓缩得到各部位浸膏；第三步，取石油醚部位浸膏用硅胶柱色谱梯度洗脱分离
后得到8个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为1:0、100:1、50:1、25:1、8:1、5:1、1:1、0:1；第四步，将第7个馏分用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到4个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为15:1、5:1、3:1、1:1；第五步，将第四步得到的第3个馏分用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到3个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为10:1、5:1、3:1；第六步，将第五步得到的第1个馏分经高效液相色谱梯度洗脱后纯化分离，并收集洗脱物，在第26.5分钟处得到nepetabrate g。
[0036]
实施例6：该nepetabrate g作为制备预防炎症药物的应用。
[0037]
实施例7：该nepetabrate g作为制备抗炎药物的应用。
[0038]
实施例8：该nepetabrate g作为制备防治炎症保健品的应用。
[0039]
实施例9：该nepetabrate g按照下述方法得到：第一步，将6kg大苞荆芥地上部分粉碎过筛并加入40l乙醇，在室温下浸泡3小时后，在50℃条件下加热回流提取3次，每次2小时，合并每次回流提取液并减压回收、浓缩，得大苞荆芥总浸膏；第二步，将437.0g大苞荆芥总浸膏用水分散成混悬液后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，将萃取液浓缩得到各部位浸膏；第三步，取134.8g石油醚部位浸膏用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到8个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为1:0、100:1、50:1、25:1、8:1、5:1、1:1、0:1；第四步，将第7个馏分用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到4个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为15:1、5:1、3:1、1:1；第五步，将第四步得到的第3个馏分用硅胶柱色谱梯度洗脱分离后得到3个馏分，其中，硅胶柱色谱梯度洗脱液包括石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比依次为10:1、5:1、3:1；第六步，将第五步得到的第1个馏分经高效液相色谱梯度洗脱后纯化分离，并收集洗脱物，在第26.5分钟处得到nepetabrate g。
[0040]
将本发明实施例9得到的nepetabrate g进行核磁共振氢谱(1h-nmr)和核磁共振碳谱(
13
c-apt)分析。hr-ms图谱、1h-nmr谱图、
13
c-apt谱图、h
1-h
1 cosy谱图、hsqc谱图、hmbc谱图、noesy谱图如图2至图8所示。
[0041]
结合图2、图5、图6、图7、图8对图3和图4进行图谱解析，将图3和图4各峰进行归属，图3和图4的峰归属如表1所示。通过图3、图4和表1的数据可知，本发明nepetabrate g的化学结构式如图1所示，本发明nepetabrate g为无定形粉末，易溶于氯仿、甲醇。
[0042]
将本发明nepetabrate g进行体外细胞毒性实验和抗炎药效学实验，体外细胞毒性实验利用mtt比色法。elisa法测定细胞上清液炎症因子tnf-α水平。
[0043]
以nepetabrate g为实验组，以吲哚美辛(抗炎药物)为对照组，同时设立空白组，取对数生长期的raw264.7细胞,移液枪吹打收集至离心管中,稀释计数,计算细胞悬浮液中细胞密度,用完全培养基配成2
×
105/ml的细胞悬浮液,接种于96孔板中,100μl/孔,置培养箱中培养。12h后,弃去孔中上清液,分别加入100μl浓度为200、100、50、25、12.5、6.25μg/ml的nepetabrate g培养基或空白培养基,即给药组和空白对照组,每组设置3个复孔,置培养箱中培养24h,弃去上清液,每孔加入100μl dmem培养基20μl mtt溶液(5mg/ml),继续培养4h,弃去上清液,每孔加入150μl二甲基亚砜(dmso),在摇床上震荡10min后,紫色结晶充分溶解,于酶标仪490nm处检测各孔的光密度d(λ)值。
[0044]
取对数生长期的raw264.7细胞,用移液枪吹打收集至离心管中,稀释计数,计算细胞悬浮液中细胞的密度,用完全培养基配成1
×
106/ml的细胞悬浮液,接种于96孔板中,100μl/孔,置培养箱中培养。12h后,弃去孔中上清液,分别加入200μlnepetabrate g培养基含lps 1μg/ml,浓度为4μg/ml的阿司匹林的培养基含lps1μg/ml,含lps 1μg/ml培养基和培养基,即给药组、阳性对照组、模型组和空白对照组,每组设置3个复孔,置培养箱中培养,24h后按试剂盒测定细胞分泌的tnf-α水平。
[0045]
本发明nepetabrate g对raw264.7细胞的毒性作用柱状图如图9所示。图9可以看出nepetabrate g对脂多糖(lps)刺激的raw 264.7细胞具有较强的抗炎作用。
[0046]
本发明nepetabrate g对lps诱导的raw264.7细胞的tnf-α水平影响图如图10所示。图10可以看出，nepetabrate g与模型组比较,各给药组tnf-α分泌量显著降低。
[0047]
综上所述，本发明首次公开了nepetabrate g，本发明nepetabrate g对脂多糖(lps)刺激的raw 264.7细胞具有较强的抗炎作用，从而使得nepetabrate g能够作为制备预防炎症药物和抗炎药物的应用。
[0048]
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
[0049]
表1
[0050]