球孢白僵菌Bb1003及其介导合成纳米金的方法

球孢白僵菌bb1003及其介导合成纳米金的方法
技术领域
1.本发明涉及纳米材料领域，具体涉及一种利用球孢白僵菌合成纳米金的方法。


背景技术：

2.公元5世纪，金首次被提取出来，在当时就被视为世界上最珍贵的物质之一。之后金被分离成粒径小于100 nm的粒子，便成为了更加珍贵的材料，纳米金（aunps）。纳米金凭借独特的光电特性、良好的稳定性及生物相容性，广泛应用于工业催化、生物医学、环境监测等各个领域中。
3.传统的合成纳米金的方法有物理和化学法，但这两种方法都存在各自的缺点，物理法高能耗、成本高，化学法有毒有害，对环境会造成污染。因此，开发绿色低毒、成本低廉、反应条件温和的纳米金合成方法已变得越来越重要。微生物法合成纳米金就有效的结合了纳米技术和生物技术，并凭借环境友好、条件温和、绿色低毒等优势已逐渐成为纳米金合成领域的研究热点。
4.目前已报道了多种微生物具有合成纳米金的能力，包括细菌、真菌、放线菌以及病毒等，它们利用自身分泌的蛋白酶，还原糖等生物成分合成多种不同形态 的纳米金。与其他微生物相比，真菌在合成纳米金过程中更具优势，主要体现在（1）具有极强的生长活性，并且能够产生大量的代谢产物；（2）具有非常强的 金属吸附能力；（3）能够分泌大量丰富的胞内及胞外蛋白质、酶类及还原糖等生物分子，可有效的还原金属离子并合成稳定的纳米颗粒。（4）合成的纳米金粒径范围较均一、形态多样，具有良好的单分散性。到目前为止，已报道的具有纳米金合成能力的真菌有几十种，包括黑曲霉菌、青霉菌、尖孢镰刀菌、木霉菌等。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一株具有纳米金合成能力的球孢白僵菌，以及采用该菌株催化haucl4合成纳米金的方法，在绿色合成纳米金领域具有重要的应用价值。
6.本发明是通过如下技术方案实现的。
7.本发明的球孢白僵菌（beauveria bassiana）bb1003菌株，于2021年9月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.23269，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
8.本发明的球孢白僵菌bb1003是从山西省晋城市阳城县次营镇桑蚕养殖农户偶然发现的僵蚕中分离得到。该菌株接种在产孢培养基中，接种后置于温度为26
±
1℃、全黑暗、相对湿度为75
±
5%的恒温培养箱中培养；5 d后在光学显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子梗形态，菌落颜色为乳白色，菌落底端为淡黄色，菌落边缘薄，中间厚，中间有褶皱，菌落呈同心圆生长（图1）。在光学显微镜下观察，发现产孢细胞单生，很少簇生；产孢轴纤细，膝状弯曲，具小齿突；菌丝透明有隔，隔附近有分支（图2）。分生孢子透明、光滑、呈卵圆或椭圆形（图3）。采用16srdna序列同源性比对，并绘制系统发育树，如图2所示，结果表明：该菌株
与数据库中其他球孢白僵菌株聚为一大支，说明该菌株与数据库中的球孢白僵菌菌株具有较高的相似性。综合形态特征鉴定和its序列相似性分析，将该菌株命名为球孢白僵菌bb1003。
9.利用球孢白僵菌bb1003（beauveria bassiana）合成纳米金的方法，包括以下步骤：（1）活化菌种：将4℃保存的球孢白僵菌bb1003接种到活化培养基中，在28~30℃下活化培养2~5天，备用；（2）制备菌悬液：将步骤（1）制备的活化菌种接种于马铃薯液体培养基中，在28~30℃、150~180 rpm 下发酵培养4~7天，然后将发酵液在转速为4000 rpm下离心30 min，用灭菌的超纯水洗涤2-3次并制备菌悬液；（3）合成纳米金：在步骤（2）制备的菌悬液中加入haucl4进行生物转化反应合成金纳米颗粒，条件为：菌悬液od600值为2.0~2.5，haucl4浓度为1.0~2.0 mmol/l，ph3~9，反应温度为30℃，摇床转速为160 r/min，反应时间为6~9 h，反应液先在3500 rmp下离心5~10 min，取上清液在10000 rmp，离心10~30 min，取其沉淀，添加等量蒸馏水超声，重复离心两次，将所得沉淀产物于50℃ 烘箱中烘干过夜，得到的粉末即为纳米金。
10.所述活化培养基为pda马铃薯固体培养基。
11.所述活化培养的温度优选为28℃，时间优选为3~4天。
12.本发明利用球孢白僵菌bb1003催化haucl4合成纳米金颗粒，为纳米金的合成提供了一种新的微生物资源，在生物合成纳米材料领域尤其是绿色合成纳米金领域具有重要应用价值。
13.本发明球孢白僵菌（beauveria bassiana）bb1003菌株生物合成纳米金的相关试验1、菌株的分离鉴定和分子生物学鉴定（1）菌株的分离鉴定本发明的球孢白僵菌（beauveria bassiana）bb1003菌株分离自山西省晋城市阳城县次营镇桑蚕养殖农户偶然发现的僵蚕中。采用浓度梯度稀释法从自然感染白僵菌的家蚕中分离纯化球孢白僵菌菌株。具体操作步骤：在超净工作台将上述白僵蚕用无菌钵杵在无菌研钵中研磨，充分研磨后，得到粉碎虫体；称取白僵蚕粉末 0.1 g，在超净工作台中，加少量1%的吐温-80的无菌水继续研磨，充分研磨后配制成 10 ml 原液，配成10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
、10-8
、10-9
。取各级稀释液100μl涂布于培养基上于温度为26
±
1℃、全黑暗、相对湿度为75
±
5%的恒温培养箱中培养，进行单孢子培养。待单孢子形成菌落后，挑取各单孢子菌落上的孢子，分别转接至新的培养基上进行培养，至目测和镜检确定平板上长出的菌落形态特征一致，得到纯种菌体，置于4℃冰箱保存备用。用接种环挑取分离纯化后的菌株接种在产孢培养基中，接种后置于温度为26
±
1℃、全黑暗、相对湿度为75
±
5%的恒温培养箱中培养；5 d后在光学显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子梗形态；10 d后挑取成熟分生孢子观察分生孢子的形态与大小。在光学显微镜下观察，发现产孢细胞单生，很少簇生；产孢轴纤细，膝状弯曲，具小齿突，菌丝透明有隔，隔附近有分支（图2）。分生孢子透明、光滑、呈卵圆或椭圆形（图3）。
14.（2）菌株分子生物学鉴定
取20 mg干燥的分离纯化的白僵菌菌体，用液氮充分研磨成粉末，然后用生工生物工程(上海) 股份有限公司的真菌基因组 dna 快速抽提试剂盒提取 dna。采用真菌核糖体 rdna 区通用引物 its1 ( 5'-tccgtaggtga
‑ꢀ
acctgcgg-3') 和 its4( 5'-tcctccgctta ttgat
‑ꢀ
atg c-3')，克隆菌株包含 its1-5.8s-its2 的全序列以及和部分 18s 和 28s rdna 在内的片段。
15.pcr反应体系25μl包括：1μl模板dna，7μl taq plus dna polymerase（5u/μl），0.5μl 50 mm mgso4，2.5μl 10
×
pcr buffer，2.5μl dntp (each 10 mm)，引物its1（5'-tccgtaggt gaacct gcgg3'，sqe id no.3）/its4（5'-tcctccgcttattga tatgc-3'，sqe id no.4）各1μl（20μmol/l），ddh2o 9.5μl。
16.反应条件：95℃变性5 min；94℃变性30 s，57℃复性30 s，72℃延伸90 s；进行30个循环，72℃修复延伸10 min。
17.用1%琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒纯化回收后，委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。
18.将所测得的 rdna its 序列提交 genbank 网站，并使用blast软件，将测得的序列与 genbank 数据库进行比对。取供试菌株和 genbank 数据库中与其序列相似的菌株，用mega 7.0 软件的最大似然法( maximum likelihood，ml) 构建基于部分18s rdna-its1-5. 8s-its2、部分 28s rdna 序列的系统发育树。图4为球孢白僵菌bb1003的系统发育树。
19.球孢白僵菌bb1003的its序列为：attcgaggtcacgttcagaagttgggtgttttacggcgtggccgcgtcggggtcccggtgcgagctgtattactgcgcagaggtcgccgcggacgggccgccactccatttcagggccggcggtgtgctgccggtccccaacgccgacctccccaaggggaggtcgagggttgaaatgacgctcgaacaggcatgcccgccagaatgctggcgggcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcactggattctgcaattcacattacttatcgcgtttcgctgcgttcttcatcgatgccagagccaagagatccgttgttgaaagttttgattcatttgttttgccttgcggcgtattcagaagatgctggaatacaagagtttgaggtccccggcgggccgctggtccagtccgcgtccgggctggggcgagtccgccgaagcaacgataggtaggtcaca采用16srdna序列同源性比对，该菌株与数据库中其他球孢白僵菌株聚为一大支，说明该菌株与数据库中的球孢白僵菌菌株具有较高的相似性。综合形态特征鉴定和its序列相似性分析，将该菌株命名为球孢白僵菌bb1003。
20.影响球孢白僵菌（beauveria bassiana）bb1003菌株合成纳米金因素的试验（1）氯金酸浓度与反应时间对合成金纳米的影响
①ꢀ
活化菌种：用接种环挑取一株4℃保存的球孢白僵菌bb1003斜面菌种划线接种于马铃薯固体培养基(pda)上，在30℃下倒置培养5d以活化菌种。
21.②ꢀ
制备菌悬液：将活化好的菌株于超净台中接种到250ml的含有100ml pdb液体培养基的三角瓶中，在30℃、160 rpm下振荡培养4d，得到发酵液。然后将发酵液在转速为4000rpm下离心30min，收集菌体，用灭菌的超纯水洗涤2-3次，将20g湿菌体加入100 ml超纯水中得到菌悬液；
③ꢀ
合成纳米金：将上述制备的菌悬液作为反应基质，将氯金酸溶液与菌悬液按体积比1:1混合,使体系中氯金酸浓度分别为0.5 mmol/l、1.0 mmol/l、2.0 mmol/l、4.0 mmol/l、8.0 mmol/l，于30℃，160 rmp摇床中避光反应18 h。合成过程中观察反应液的颜色
变化（生成纳米金的颜色为紫色及深紫色），将上述不同氯金酸浓度的反应混合液于 3000 rpm 离心 5 min，可将纳米级金颗粒留在上清液中，较大的金颗粒和菌体收集于底部沉淀中。采用紫外-可见分光光度计分别于1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h对反应液进行全波长扫描，检测范围为350~800 nm，扫描间隔为1.0 nm，将5组反应液的全波长扫描结果进行比较。结果如图5~10所示。结果显示该菌株与不同浓度体系的氯金酸在1h时还没有开始生成纳米金，3 h时氯金酸浓度为1.0 mmol/l、2.0 mmol/l的反应液有纳米金生成，全波长扫描结果显示生成的紫色物质在500~600 nm之间有特征吸收峰，证明有金纳米颗粒生成，反应时间增加生成纳米金的量没有明显增加。且氯金酸浓度过高或过低都不利于合成金纳米颗粒。
22.（2）ph值对合成纳米金的影响
①
、
②
两步骤同（1）氯金酸浓度与反应时间对合成金纳米的影响。
23.③
合成纳米金：在上述制备的球孢白僵菌bb1003菌悬液中加入氯金酸，使其浓度为2.0mmol /l，分别调节ph值为2、3.1（自然ph）、7、9，在30℃下避光反应6h。合成过程中观察反应液的颜色变化（生成纳米金的颜色为紫色及深紫色），将上述反应混合液于 3000 rpm 离心 5 min，用紫外-可见分光光度计对反应液进行全波长扫描，检测范围为350~800nm，扫描间隔为1.0nm，将4组反应液的全波长扫描结果进行比较，结果见图11。颜色变化见图12。结果显示当ph=2时未出现峰值，结合图12颜色变化说明未生成金纳米颗粒。随着反应体系ph的增加，纳米金的紫外吸收光谱曲线的吸收峰的峰值先增大后减小，ph=7时峰值最大，且颜色最深，ph=9时次之，ph=3.1（自然ph）时峰值最低且颜色为浅紫色。综合上面的实验结果，可以说明 ph =7时相对适合纳米金的合成。
24.（3）球孢白僵菌生物法合成纳米金的稳定性实验将合成的纳米金室温 25℃避光放置30d。然后肉眼观察，纳米金分散性较好，没有出现沉淀，颜色没有明显的改变，紫外全波长扫描检测结果如图13，说明该菌生物法合成的纳米金稳定性良好。
25.（4）纳米银的x射线粉末衍射（xrd）表征分析将合成的纳米金粉末烘干后研磨成粉末进行xrd检测分析，条件为以cuk
ɑ
为辐射源（λ=1 .54056
ꢀå
）；cu靶x光管电压≤40 kv、电流≤40 ma；2θ角扫描范围为5
°
~ 90
°
。根据对纳米金的tem图（图14）和xrd图谱（图15）进行分析，在与jcpds标准卡对照后，可以看出2θ在38.32
°
、44.40
°
、64.76
°
、77.68
°
和81.90
°
处，出现的5个衍射峰均为金的特征衍射峰，分别与面心立方（fcc）结构au（111）、（200）、（220）、（311）和（222）晶面相对应，由此确定产物为单质金。
26.（5）傅里叶变换红外（ftir）光谱表征分析将合成的纳米金粉末与溴化钾按1: 100比例混合、研磨均匀，压片后置于红外光谱仪中进行检测分析。结果如图16所示，纳米金的ftir光谱图在波长范围为4000~500 cm-1
存在一些明显的吸收峰，它们由不同类型的化学键的伸缩振动而引起。在3000~3500cm-1
范围内出现强而宽的吸收带，在1632.48cm-1
处有强而窄的吸收峰，分别对应羟基组的伸缩振动和碳氧双键的伸缩振动，在2166.54 cm-1
处的吸收峰是碳氮键(氨基)的伸缩振动，说明在球孢白僵菌bb1003还原合成贵金属纳米金颗粒的反应过程中，多羟基化合物、蛋白类物质参与了还原反应过程。而球孢白僵菌自身的吸附性对金颗粒的团聚有一定的阻碍作用。
27.（6）纳米金的抗菌性能试验
受试菌种的活化：分别选择大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌将保存于4℃斜面的3种受试菌接种至lb液体培养基中振荡培养24 h以活化菌种。
28.抑菌圈试验：采用滤纸片抑菌法测试纳米金对于致病菌的抑菌活性。将3株致病菌（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌）于超净台分别接种于100mllb液体培养基中37℃160rpm摇床培养24h后，分别移取10
µ
l的菌液均匀涂布于lb固体培养基上，用镊子将已灭菌的滤纸片放置于固体培养基上，事先将滤纸片浸泡在500mg/l的纳米金溶液，对照为球孢白僵菌菌悬液，试验重复3次测量抑菌圈，计算平均值，结果见图17-19和表1，图17-19中左上菌落为对照组。
29.表1本发明方法合成的纳米金对致病菌的抑菌活性（n=3）病原菌500mg/l纳米金球孢白僵菌发酵液大肠杆菌11.3
±
0.58/枯草芽孢杆菌12.1
±
0.85/金黄色葡萄球菌11.8
±
1.25/注：抑菌圈直径大小（单位mm）由表1和图14-16可知，用本发明方法合成所得的纳米金，对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌）均具有抑制作用。
30.最小抑菌浓度( mic) 测定：采用试管稀释法测试本发明制备所得的纳米金对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌这三种菌的最小抑菌浓度。配制不同浓度的纳米金溶液，在每个试管中加入lb液体培养基 3 ml，纳米金的最终浓度为50、100、300、500、1000 mg /l。然后分别在每个试管内加入试验菌悬液 10
µ
l，振荡均匀，置于 37℃ 恒温摇床中培养 24 h。同时设不加试验菌的阴性对照和加菌不加纳米金的阳性对照。结果判定，以试管内肉眼未见细菌生长的最低抗菌剂浓度为 mic 值。结果如表2，本发明制备的纳米金对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的 mbc 值均为 300mg /l。
31.表2本发明方法合成的纳米金对致病菌的最小抑菌性试验结果注:
ꢀ“ꢀ
+
ꢀ”
代表有菌生长，
“ꢀ
－
ꢀ”
代表无菌生长。
32.由以上实施例可知，本发明提供了一种球孢白僵菌bb1003及其介导纳米金生物合成的应用。本发明首次发现从白僵蚕中分离纯化的球孢白僵菌具备生物合成纳米金的能力，经过对影响纳米金合成的条件进行优化得到的纳米金产量较高、尺寸较小。且该纳米金对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均具有抑制作用，可以作为纳米抗菌材料。
附图说明
33.图1是本发明球孢白僵菌bb1003的菌落形态图。
34.图2是本发明球孢白僵菌bb1003的菌丝形态图。
35.图3是本发明球孢白僵菌bb1003的孢子形态图。
36.图4是本发明球孢白僵菌bb1003的系统发育树。
37.图5是本发明的球孢白僵菌bb1003菌悬液为反应液与不同浓度氯金酸反应1h时合成纳米金的紫外吸收光谱图。
38.图6是本发明的球孢白僵菌bb1003菌悬液为反应液与不同浓度氯金酸反应3h时合成纳米金的紫外吸收光谱图。
39.图7是本发明的球孢白僵菌bb1003菌悬液为反应液与不同浓度氯金酸反应6h时合成纳米金的紫外吸收光谱图。
40.图8是本发明的球孢白僵菌bb1003菌悬液为反应液与不同浓度氯金酸反应9h时合成纳米金的紫外吸收光谱图。
41.图9是本发明的球孢白僵菌bb1003菌悬液为反应液与不同浓度氯金酸反应12h时合成纳米金的紫外吸收光谱图。
42.图10是本发明的球孢白僵菌bb1003菌悬液为反应液与不同浓度氯金酸反应18h时合成纳米金的紫外吸收光谱图。
43.图11是本发明的球孢白僵菌bb1003菌悬液为反应液在不同ph条件下合成纳米金的紫外吸收光谱图。
44.图12是本发明的球孢白僵菌bb1003菌悬液为反应液在不同ph反应条件下的颜色变化。
45.图13是本发明的球孢白僵菌bb1003菌悬液为反应液合成的纳米金放置30天后的紫外吸收光谱图。
46.图14本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液为反应液合成的纳米金的tem图。
47.图15是本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液为反应液合成的纳米金的xrd图。
48.图16是本发明的球孢白僵菌bb1003发酵液为反应液合成的纳米金的ftir光谱图。
49.图17是本发明合成的纳米金对大肠杆菌的抑菌效果图。
50.图18是本发明合成的纳米金对枯草芽孢杆菌的抑菌效果图。
51.图19是本发明合成的纳米金对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。
具体实施方式
52.下面结合实施例对本发明作进一步说明。
53.实施例1本发明的球孢白僵菌bb1003是从山西省晋城市阳城县次营镇桑蚕养殖农户偶然发现的僵蚕中分离得到。采用16srdna序列同源性比对，鉴定为beauveria bassiana。该菌株于2021年9月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmcc no.23269，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
54.实施例2利用球孢白僵菌bb1003（beauveria bassiana）合成纳米金的方法，包括以下步
骤：（1）活化菌种：将4℃保存的球孢白僵菌bb1003接种到pda马铃薯固体培养基中，在28~30℃下活化培养2~5天，备用；（2）制备菌悬液：将步骤（1）制备的活化菌种接种于马铃薯液体培养基中，在28~30℃、150~180 rpm 下发酵培养4~7天，然后将发酵液在转速为4000 rpm下离心30 min，用灭菌的超纯水洗涤2~3次并制备菌悬液；（3）合成纳米金：在步骤（2）制备的菌悬液中加入haucl4进行生物转化反应合成金纳米颗粒，条件为：菌悬液od600值为2.0~2.5，haucl4浓度为1.0~2.0 mmol/l，ph3~9，反应温度为30℃，摇床转速为160 r/min，反应时间为6~9 h，反应液先在3500 rmp下离心5~10 min，取上清液在10000 rmp，离心10~30 min，取其沉淀，添加等量蒸馏水超声，重复离心两次，将所得沉淀产物于50℃ 烘箱中烘干过夜，得到的粉末即为纳米金。
55.实施例3利用球孢白僵菌bb1003（beauveria bassiana）合成纳米金的方法，包括以下步骤：（1）活化菌种：将4℃保存的球孢白僵菌bb1003接种到pda马铃薯固体培养基中，在28℃下活化培养3~4天，备用；（2）制备菌悬液：将步骤（1）制备的活化菌种接种于马铃薯液体培养基中，在28~29℃、170~180 rpm 下发酵培养5~6天，然后将发酵液在转速为4000 rpm下离心30 min，用灭菌的超纯水洗涤3次并制备菌悬液；（3）合成纳米金：在步骤（2）制备的菌悬液中加入haucl4进行生物转化反应合成金纳米颗粒，条件为：菌悬液od600值为2.0~2.5，haucl4浓度为1.0~2.0 mmol/l，ph3~9，反应温度为30℃，摇床转速为160 r/min，反应时间为6~9 h，反应液先在3500 rmp下离心5~10 min，取上清液在10000 rmp，离心25~30 min，取其沉淀，添加等量蒸馏水超声，重复离心两次，将所得沉淀产物于50℃ 烘箱中烘干过夜，得到的粉末即为纳米金。