植物抗病增产相关的OsUBC45蛋白及其相关生物材料与应用

本发明涉及生物中植物抗病增产相关的osubc45蛋白及其编码基因与应用。

背景技术：

1、水稻是主要的口粮作物，稻瘟病等病害严重影响水稻的产量和品质，成为水稻稳产的重要制约因素之一。各水稻栽培区均经常发生稻瘟病，喷施化学杀菌剂和培育抗病品种是防治稻瘟病的主要手段。但是杀菌剂的广泛使用会造成环境污染并影响农产品的品质，所以，培育抗病品种成为防御植物病害最经济有效的选择。也因此探究水稻如何应对稻瘟病，挖掘水稻广谱抗病的优异基因尤为重要。

2、泛素蛋白酶体途径在植物生长发育，及植物应对非生物胁迫和生物胁迫中发挥重要作用。泛素蛋白酶体途径由泛素激活酶，泛素结合酶和泛素连接酶三个酶进行级联催化，最终将泛素小分子加在底物蛋白上，主要通过介导底物蛋白的降解发挥作用。每个泛素连接酶可以有多个底物蛋白，通过介导不同底物蛋白的泛素化修饰和降解，调控不同的信号通路及表型。近年来研究人员发现泛素蛋白酶体途径的关键组分在水稻抗稻瘟病中发挥重要作用。ring类型e3连接酶osbbi1受稻瘟菌诱导表达，在水稻中过表达osbbi1可通过改变细胞壁的防御应答增强水稻对多种稻瘟菌小种的抗性。ebr1也编码ring类型的e3连接酶，ebr1对稻瘟病和白叶枯都表现出高抗性。研究表明osbag4是ebr1的泛素化底物，该模块主要通过调控植物的病原相关分子模式激发的免疫反应发挥广谱抗病作用。上述研究证明泛素相关组分在水稻抗稻瘟病中扮演着重要角色。

3、内质网相关的蛋白质降解过程由定位于内质网膜或通过其他蛋白锚定在内质网膜的泛素结合酶和泛素连接酶催化，在帮助植物正常生长和适应高温、盐和干旱等非生物胁迫中发挥重要作用。研究证明，在拟南芥中，分子模式flg22可以诱导内质网胁迫，上调非折叠蛋白响应相关编码基因bip、cnx、pdi等的表达，暗示非折叠蛋白响应和内质网相关蛋白质降解途径可能参与植物抵抗生物胁迫的过程。研究和利用植物的泛素蛋白酶体途径，发掘更多的泛素相关组分或泛素化底物，并解析它们的工作模式，是培育抗病材料的新突破口。

4、水稻高产和抗病之间常存在拮抗，通常增强防御会伴随植株矮小、产量降低的代价，而高产则抗性不佳。目前鉴定到的能同时高产高抗的基因还很少，转录因子ipa1是一个同时兼顾抗病和增产的优异基因，研究发现ipa1蛋白的磷酸化修饰是平衡水稻产量和抗性的关键枢纽。非磷酸化的ipa1结合发育相关基因dep1的启动子，促进其表达，负责水稻增产；磷酸化的ipa1偏向于结合抗病相关基因wrky45的启动子，促进其表达，负责增强免疫反应。因此，维持好植物抗病与生长之间的平衡，是培育高抗稳产水稻的关键；挖掘更多兼顾抗病高产的优异基因资源对于培育抗病稳产水稻品种意义重大。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的抗病增产。

2、本发明提供了一种蛋白质，名称为osubc45，是如下a1)、a2)或a3)的蛋白质：

3、a1)氨基酸序列是序列表中seq id no.1的蛋白质；

4、a2)将a1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有75％以上的同一性且具有调控植物抗病增产活性的蛋白质；

5、a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。

6、其中，seq id no.1由313个氨基酸残基组成。

7、上述蛋白质可来源于水稻。

8、上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

9、上述蛋白质中，所述75％以上的同一性可为至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的同一性。

10、上述蛋白质中，所述蛋白质标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白质一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白质的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白质标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等，部分可用标签的氨基酸序列见表1。

11、表1标签的序列

12、

13、

14、上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

15、与蛋白质osubc45相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

16、本发明所提供的与蛋白质osubc45相关的生物材料，为下述b1)至b5)中的任一种：

17、为下述b1)至b5)中的任一种：

18、b1)编码所述蛋白质osubc45的核酸分子；

19、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

20、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；

21、b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；

22、b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

23、其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

24、上述生物材料中，b1)所述dna分子为如下b1)-b3)中任一所示的基因：

25、b1)编码链的编码序列是seq id no.3的cdna分子或dna分子；

26、b2)核苷酸是seq id no.3的dna分子；

27、b3)核苷酸是seq id no.2第3001-5899位的dna分子。

28、上述生物材料中，b2)所述的含有所述dna分子的表达盒(osubc45基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达osubc45的dna分子，该dna分子不但可包括启动osubc45基因转录的启动子，还可包括终止osubc45转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：基因osubc45的自身启动子(核苷酸序列如seqid no.2第1-3000位所示)；花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plant physiology 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白质酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利2007 10099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白质、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(beachy等人(1985)embo j.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv 35s终止子、tml终止子、豌豆rbcs e9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i985)nature 313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genes dev.,5:141；mogen等人(1990)plant cell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleic acids res.17:7891；joshi等人(1987)nucleic acid res.,15:9627)。

29、可用现有的植物表达载体构建含有所述蛋白质osubc45编码基因或所述蛋白质osubc45编码基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体可为gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pcg1301、pgwb411、pgwb412、pgwb405、pbin438、pcambia1302、pcambia2300、pcambia2301、pcambia1301、pgwb18、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb。使用osubc45构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛生素基因ubiqutin启动子(pubi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

30、为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

31、上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌；如所述细菌可以为农杆菌eha105菌株。

32、上述的蛋白质、或上述生物材料的下述c1-c2中的任一种中的应用也属于本发明的保护范围：

33、c1)调控植物抗病性和/或植物产量中的应用；

34、c2)制备调控植物抗病性和/或植物产量的产品中的应用。

35、本发明中，所述调控可为上调或增强或提高。

36、本发明还提供一种提高植物抗病性和/或植物产量的方法，所述方法包括步骤m，所述步骤m为增强、提高或上调目的植物中osubc45蛋白的活性和/或含量，或/和，增强、提高或上调osubc45蛋白的编码基因的表达量，来提高植物抗病性和/或植物产量。

37、上述方法中，所述植物可为禾本科植物，具体可为水稻。

38、上述方法中，所述抗病性，具体可表现为感染稻瘟病病原菌后目的植物叶片上的病斑长度(病斑面积)较受体植物短(小)，目的植物叶片上稻瘟病病原菌生物量较受体植物少。所述产量，具体可表现为目的植物的穗长较受体植物长，目的植物的种子长度较受体植物长，目的植物的种子千粒重较受体植物重，目的植物的单株产量较受体植物高。

39、为了解决上述技术问题，本发明还提供了植物试剂，其作用为调控植物抗病增产性。

40、本发明所提供的植物试剂含有所述的蛋白质或/和所述的蛋白质相关的生物材料。

41、上述植物试剂的活性成分可为所述的蛋白质或/和所述的蛋白质相关的生物材料，上述植物试剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述植物试剂的其他活性成分本领域技术人员可根据植物抗病增产效果确定。

42、所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物，具体可为水稻。

43、过表达水稻中osubc45基因的实验证明，过表达osubc45蛋白的转基因水稻与受体水稻相比，对稻瘟病的抗性增强，同时产量不仅没有减少，反而有所增加，说明osubc45蛋白是与植物抗病增产相关的基因，过表达osubc45蛋白提升植物的抗病性同时增产。本发明的方法操作简单，成本低，大大加快了育种进程，具有广泛的应用前景。