脓肿分枝杆菌编码基因及其应用

本发明涉及基因检测领域，具体涉及对病原菌物种进行鉴定。

背景技术：

1、近年来，非结核分枝杆菌疾病(non-tuberculosis mycobacteria,ntm)呈快速增长的趋势，在全球范围内成为威胁人类健康的严重公共卫生问题，而且其患病率和发病率均呈逐年上升的趋势。日本的一项研究表明，日本ntm病的发病率从2001年的4.6/10万上升到2009年10.1/10万，上升了近2.2倍。而在韩国，2008年ntm病的发病率为6.0/10万，而到2016年这一数据则上升到了19/10 万。根据《非结核分枝杆菌病诊断与治疗指南(2020年版)》，我国目前虽然尚没有大样本的ntm病流行病学调查资料，但据相关的结核病流行病学调查资料，可以看到ntm的分离率从2000年的11.1％增长至2010年的22.9％，这同样反映了我国ntm病呈显著上升的趋势。

2、ntm的感染可引起肺部、淋巴结、皮肤和软组织、关节等器官的损害。而作为最为常见的ntm病，罹患ntm病的患者中约有75％-94％表现为肺部病变。由于ntm肺病的临床表现、胸部影像等酷似于结核病，且痰中可发现抗酸杆菌。因此若无菌种鉴定的结果，ntm病可长期被误诊为结核病及支气管扩张等病症。

3、脓肿分枝杆菌复合群(mycobacteroides abscessus complex，mabc)是一种可导致人体感染致病的快速生长型非结核分枝杆菌(rapidly growing mycobacteria,rgm)，是引起肺部感染疾病的一种重要的ntm病原体。其又分为3个亚种，即脓肿分枝杆菌脓肿亚种(m.abscessus subsp.abscessus)、脓肿分枝杆菌马赛亚种(m.abscessussubsp.massiliense)以及脓肿分枝杆菌博莱亚种(m. abscessus subsp.bolletii)。在美国，脓肿分枝杆菌复合群占致病性rgm的 65％～80％。而在韩国，脓肿分枝杆菌复合群引起的肺部疾病占rgm引起的肺部疾病的70～80％。

4、mabc对一线抗结核药物天然耐药，普通抗菌药物也大多无效，其治疗方案通常以克拉霉素等大环内酯类抗生素为核心的多药联合方案进行治疗。尽管很多ntm菌株在生物学、病理学上都表现出很强的相似性，但是不同菌种对药物的敏感性不同，使得临床治愈率并不高。更为严峻的是，mabc引发的感染易被当做结核病进行治疗，长期的药物不对症使用更加重其耐药性的发生，导致治疗的失败。因此，mabc感染因为药物耐药率高、药物不良反应多、疗程长、预后差，成为最难治疗的感染之一。为防止耐药性的发生，早期完成菌种鉴定和药敏试验分析，对提高mabc肺病的治愈率具有重要意义。

5、目前对mabc的鉴定方法主要有以下三类：1)直接同源基因序列比较法：该方法通过分析同源dna序列差异将致病菌鉴定至种的水平，常用序列包括 16s rdna、16s-23srrna的its区、rna聚合酶的β亚基(rpob)和热休克蛋白65(hsp65)。但其单一序列鉴别能力不足，常需要联合应用多个同源序列进行菌种鉴定。2)间接同源基因序列比较法：该方法设计针对特定同源基因序列的单核苷酸多态性位点探针，并将探针标记在固相基质(芯片)上，通过探针和待测序列的结合情况鉴别菌种。目前已有基于此方法的市场化基因芯片试剂盒，但其难以区分mabc和龟分枝杆菌(m.chelonae)，且需用激光共聚焦扫描仪，操作较为复杂。3)基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术 (maldi-tof-ms)。由于mabc、结核分枝杆菌(m.tuberculosis complex)、鸟分枝杆菌(m.avium complex)和偶发分枝杆菌(m.fortuitum complex)之间的高度相似性，一些ntm菌只能区分至复合群水平，复合群内部菌株无法通过单一基因实现可靠鉴别，同样需要采用多位点基因的联合分析。

6、总之，目前的脓肿分枝杆菌复合群(mabc)鉴定策略具有操作复杂、步骤繁琐、特异性不高、价格高昂等问题。故建立快速、精准、廉价的脓肿分枝杆菌复合群检测方法，有效鉴别mabc中的感染菌，是mabc肺病诊治的前提和基础，也是临床实验室检测脓肿分枝杆菌所亟需完成的新任务。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是提供一种分离的核苷酸，其为脓肿分枝杆菌(atcc 19977)序列特异的编码基因，该基因为mab_3719c(-|3774251-3776008|)，其序列信息可用作脓肿分枝杆菌复合群条形码分子标记，用于鉴别脓肿分枝杆菌复合群，其序列如seq id no.1所示。

2、本发明的其他目的包括提供可用于扩增上述编码基因的特异性pcr引物以及提供一种检测或鉴定样品中是否存在脓肿分枝杆菌复合群的检测方法；本发明还提供与上述编码基因相关的检测试剂盒和上述基因的应用。

3、根据本发明的一个方面，通过比较基因组学分析研究，发现了atcc 19977 中一个序列差异较大的蛋白编码序列，该基因能有效地将mabc与其它ntm 区分开来。该基因是一个脓肿分枝杆菌atcc 19977mab_3719c (-|3774251-3776008|)，经ncbi-blastp分析发现该基因属于具体功能并不明确的假定功能蛋白，其序列在genbank的同源性较低。经比较基因组学研究发现该基因序列能将脓肿分枝杆菌复合群(mabc)菌株与其它ntm菌种鉴别开来。

4、具体地，设计能对mabc的mab_3719c(-|3774251-3776008|)基因实现特异性扩增引物，即为本发明所提出的引物，引物序列为：

5、f:5’-acgtggggggattggcccggatcta-3’；

6、r:5’-tgtaaagcccgaagcagataccgac-3’。

7、根据待测样品中的该基因dna序列pcr产物的有无或dna序列的差异，可以快速准确鉴定mabc。

8、根据本发明的另一个方面，基于上述脓肿分枝杆菌atcc 19977新的标准编码基因，本发明具体地建立了检测或鉴定脓肿分枝杆菌复合群的方法，步骤如下：

9、(1)从待测样品中分离提取基因组dna；

10、(2)以步骤(1)获得的dna为模板，采用下述引物进行pcr扩增：

11、f:5’-acgtggggggattggcccggatcta-3’(seq id no.3)；

12、r:5’-tgtaaagcccgaagcagataccgac-3’(seq id no.4)。

13、(3)对步骤(2)扩增得到的dna产物进行凝胶电泳分析，大小与理论大小一致；

14、(4)对步骤(2)扩增得到的dna产物进行测序分析，并与条形码基因 mab_3719c(-|3774251-3776008|)进行比对，如果同源性大于90％，判定待测样品含有脓肿分枝杆菌复合群。

15、进一步地，上述检测方法，根据dna条形码原理，初步对pcr产物进行电泳分析，如果待测菌株没有目标条带，说明该菌株不是mabc；如果有条带，则可进一步测序验证，将测序得到的序列与mab_3719c(-|3774251-3776008|)的标准序列进行同源比较和比对，获得序列间的相似性，若序列同源性大于99％，即可判定菌株可能为mabc；根据待鉴定菌株的dna条形码序列与标准序列聚类情况来区分mabc与结核分枝杆菌h37rv、其它ntm菌以及呼吸道常见病原菌。

16、该检测方法即可用于对脓肿分枝杆菌复合群的菌种鉴定研究，也可用于临床快速检验。待测样品可以是mabc菌株、h37rv菌株、其它ntm菌株以及其他呼吸道常见病原菌。

17、在上述方法的基础上，本发明也提供检测试剂盒。试剂盒容器内装有用以检测脓肿分枝杆菌atcc 19977标准编码基因的试剂，与之同时提供的可以是经药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。例如，采用pcr扩增后，直接检测样品中mab_3719c(-|3774251-3776008|)基因的试剂，例如可含有扩增引物、dntp、用于pcr反应的dna聚合酶及其缓冲液、酶切反应和/或测序反应所需试剂等的一种或多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，例如，所述引物可以采用上述特异性pcr引物，所述的用于pcr反应的dna聚合酶是能够用于pcr扩增的酶。本发明的编码基因的检测也可以以集成的例如基因芯片的方式提供。

18、有益效果：本发明提供了一种用作脓肿分枝杆菌复合群(mycobacteriumabscessus complex,mabc)分子鉴定的标准基因及分子鉴定方法，该基因能有效地将mabc与结核分枝杆菌h37rv及其它ntm菌区分开来，应用该基因的鉴定方法克服了现有脓肿分枝杆菌鉴定过程中的引物设计多重性、结果重复性差等缺点，具有通用、易扩增、易比对的特点，可以准确地将该类群从亲缘关系很近的其它ntm菌或其它呼吸道感染病菌中鉴定出来，为结核流行病学调查及临床结核病患者快速诊断、鉴别提供有力的技术手段和研究工具。