与大豆冠层覆盖度和开花期相关联的SNP分子标记与应用

与大豆冠层覆盖度和开花期相关联的snp分子标记与应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种与大豆冠层覆盖度和开花期相关联的snp分子标记与应用。


背景技术：

2.大豆是世界范围重要的粮油兼用作物，是人类优质蛋白及饲用蛋白的主要来源。冠层覆盖度的时序性遗传解析可以为大豆理想株型奠定基础。“高产理想型”大豆叶面积需要前期扩展快，达峰值短，后期下降缓慢(盖钧镒等，1990)，即冠层的“早封垄、晚衰老”。此外作为短日作物，大豆需要严格的光周期条件，存在大豆品种适应范围狭窄，区域性强等特点，限制了大豆品种的引进、培育和大范围种植推广。对全生育期时序性冠层覆盖度和开花期的遗传解析有望为理想株型和广适性高产大豆的选育提供理论依据。
3.限于人工表型鉴定的低效性，时序性冠层覆盖度的遗传解析研究少有报道。近年来，随着无人机田间表型平台的成熟，在时序性大豆冠层覆盖度的研究方面获得了进展。xavier等(2017)利用此技术挖掘到了19个冠层覆盖度qtls。相比之下，大豆花期和生育期相关的基因位点在大豆中研究较为深入，主要有12个基因被功能性验证，分别是e1和e2(bernard，1971)、e3(buzzell，1971)、e4(buzzell和volden，1980)、e5(dissanayaka et al.，2016)、e6(bonato和vello，1999)、e7(cober和voldeng，2001)、e8(cober et al.，2010)、e9(kong et al.，2014)、j(ray et al.，1995)、prr3b(li et al.，2020)和prr3a(lu et al.，2020)等。
4.随着重要产量性状qtl的连锁或关联分子标记的开发和使用，分子标记辅助选择成为了快速育种中的重要手段之一(cregan et al.,1999)。分子标记辅助选择的最大优点是在不需要评估表型特征的情况下，通过确认是否带有目标基因型而鉴定出目标表型的植株。
5.若能证明一个同时与大豆冠层覆盖度和开花期相关联的snp位点，可为大豆在分子鉴定和辅助育种等方面提供有力的技术支持。


技术实现要素：

6.本发明提供与大豆冠层覆盖度和开花期相关联的snp分子标记与应用，可实现快速检测大豆冠层覆盖度和开花期，为大豆在分子鉴定和辅助育种等方面提供有力的技术支持。
7.本发明提供一种与大豆冠层覆盖度和开花期相关联的snp分子标记，所述snp分子标记含有如seq id no.1所示序列第342位的多态性为t和c的核苷酸序列。
8.根据本发明提供的一种与大豆冠层覆盖度和开花期相关联的snp分子标记，具有所述多态性的位点的基因型为tt，对应于相对冠层覆盖度低且开花期早的表型；具有所述多态性的位点的基因型为cc，对应于相对冠层覆盖度高且开花期晚的表型。
9.本发明提供一种用于扩增上述snp分子标记的引物。
10.优选的，所述用于扩增上述snp分子标记的引物为kasp引物组合。
11.进一步优选的，所述用于扩增上述snp分子标记的kasp引物组合包括如下引物：如seq id no.2所示的等位基因正向引物1：tcccgattcaccacagttgtaa；如seq id no.3所示的等位基因正向引物2：tcccgattcaccacagttgtag；如seq id no.4所示的通用反向引物：gaggcagcaatggtaggagg。
12.优选的，如seq id no.2所示的等位基因正向引物1、如seq id no.3所示的等位基因正向引物2分别含有不同的荧光基团。
13.进一步优选的，如seq id no.2所示的等位基因正向引物1含有荧光基团fam，如seq id no.3所示的等位基因正向引物2含有荧光基团hex。
14.本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物。
15.本发明提供上述snp分子标记、上述引物、上述试剂盒在鉴定大豆冠层覆盖度表型中的应用。
16.本发明提供上述snp分子标记、上述引物、上述试剂盒在鉴定大豆开花期表型中的应用。
17.本发明提供上述snp分子标记、上述引物、上述试剂盒在大豆种质资源鉴定、改良或定向育种中的应用。比如，将携带优异等位基因的南方大豆材料与其他材料(北方或者国际品种)杂交和回交，就能创制出携带优异等位基因的大豆材料。
18.本发明提供上述snp分子标记、上述引物、上述试剂盒在大豆分子标记辅助育种、全基因组选择育种中的应用。
19.本发明提供上述snp分子标记、上述引物、上述试剂盒在筛选和/或培育冠层覆盖度高且开花晚的大豆中的应用。
20.根据本发明上述的应用，所述大豆为任一大豆品种。本发明所述分子标记、引物、试剂盒具有普适性，可以适用于种植在任意环境的任一大豆品种。
21.本发明提供一种鉴定大豆冠层覆盖度和/或开花期表型的方法，所述方法包括如下步骤：
22.1)在待测样品中检测上述的snp分子标记的多态性位点的基因型；
23.2)依据步骤1)所得到的基因型判断待测样品的冠层覆盖度和开花期；
24.具体判断方法为：若所得到的基因型为tt，则所述待测大豆为候选的相对冠层覆盖度低且开花期早的大豆；若所得到的基因型为cc，则所述待测大豆为候选的相对冠层覆盖度高且开花期晚的大豆。
25.本发明的有益效果：
26.(1)本发明通过对我国栽培大豆品种的全基因组关联分析发现snp位点chr08-11602352与全生育期冠层覆盖度、大豆开花期显著相关联。本发明发现的snp位点对于大豆在分子鉴定和辅助育种方面，具有非常重要的指导意义。
27.(2)本发明所述检测大豆冠层覆盖度和开花期的方法简单、快速、准确。
28.(3)经进一步统计分析证明，本发明提供的引物可以特异检测大豆中chr08-11602352位点的基因型，也可以作为不同生育期育种中的标记辅助选择的新遗传资源，具有非常重要的积极意义
具体实施方式
29.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.实施例1snp位点的挖掘
31.从phytozome(http://www.phytozome.net)下载glyma.08g150600基因序列，该snp位点chr08-11602352位于glyma.08g150600基因核苷酸序列(seq id no.1)的第342位，其基本信息见表1。
32.表1 chr08-11602352的单核苷酸多态性位点基本信息
[0033][0034]
本发明通过对我国大豆栽培品种的全基因组进行关联分析，发现一个snp位点，与大豆冠层覆盖度和开花期显著相关联。该snp位点的位点为基因组版本glycine max wm82.a2.v1(soybean，http://www.phytozome.net)的chr08:11602352，该位点的等位基因为t和c，主要有tt和cc两种基因型。
[0035]
所述snp位点及其两端的侧翼序列如seq id no.1所示。
[0036]
seq id no.1：
[0037]
》glyma.08g150600position＝gm08:11602011..11602587(+strand)
[0038][0039]
注：[t/c]为snp“chr08:11602352”。序列表seq id no.1中snp多态性位点为t，其实际多态性为t/c。
[0040]
实施例2snp位点在鉴定或辅助鉴定大豆冠层覆盖度和开花期中的应用
[0041]
1、chr08-11602352位点基因型与冠层覆盖度和大豆开花期显著相关。
[0042]
(1)鉴定大豆品种的冠层覆盖度和开花期
[0043]
为了验证snp位点的可靠性，对528份基因遗传关系聚类为中国南方的大豆地方品
种分别进行开花时间和冠层覆盖度的调查，调查地点和性状为：安徽省农业科学院合肥基地(116.5645
°
e 33.26584
°
n)(hf)(2018年和2019年的花期)和江西省农业科学研究所南昌基地(nc)(115.8935
°
e 28.6896
°
n)(2020年的花期和冠层覆盖度)。其中行长1.5米(两行)，株距0.1米，行距0.55米。田间管理采用当地常规管理，保证实验材料正常生长、成熟。田间表型鉴定参考“大豆种质资源描述规范和数据标准”调查出开花期(qiu et al.，2006，开花期为50％植株开始开花。大豆冠层覆盖度分别在播种后61、63、65、68、70天，利用大疆精灵四多光谱版无人机采集图像，利用公式(egi,(2g-r-b)/g)(meyer and neto,2008)提取冠层覆盖度，其中egi为0.05。其中未成熟和出苗率过低材料，当作缺失处理。
[0044]
(2)利用实施例1提供的基因型鉴定方法检测上述528份大豆的chr08-11602352基因型，结果如表2所示。
[0045]
表2 528份大豆chr08-11602352位点基因型与花期和冠层覆盖度
[0046]
[0047]
[0048]
[0049]
[0050]
[0051]
[0052]
[0053]
[0054]
[0055]
[0056]
[0057]
[0058]
[0059]
[0060]
[0061]
[0062]
[0063]
[0064]
[0065][0066]
备注：两种性状：ft，cc分别表示花期和冠层覆盖度，das表示播种后天数。hf，nc分别表示合肥和南昌。na表示相关信息缺失。
[0067]
表2中涉及的大豆品种均记载在如下文献中：王国勋.中国大豆品种资源目录.北京:中国农业出版社，1982；常汝镇，孙建英.中国大豆品种资源目录:续编一.北京:农业出版社，1991；常汝镇，孙建英，邱丽娟，陈一舞.中国大豆品种资源目录:续编二.北京:中国农业出版社，1996。
[0068]
利用全基因组重测序方法检测chr08-11602352位点在528份材料的基因型，其中tt基因型416份，cc基因型112份。
[0069]
在合肥环境下，2018年tt基因型具有开花期表型材料316份，开花时间为(17～63)天，平均开花时间为(36.76
±
8.1)天；cc基因型具有开花期表型材料56份，开花时间为(28～64)天，平均开花时间为(42.43
±
9.3)天；2019年tt基因型具有开花期表型材料329份，开花时间为(12～64)天，平均开花时间为(36.38
±
7.2)天；cc基因型具有开花期表型材料64份，开花时间为(27～61)天，平均开花时间为(42.38
±
8.9)天。wilcoxon秩和检验(wilcoxon rank sum test)单尾测试表明，tt基因型材料的2018开花时间显著早于cc基因型材料的开花时间(p《2.8e-5)；tt基因型材料的2019开花时间显著早于cc基因型材料的开花时间(p《1.2e-6)。
[0070]
在南昌环境下，2020年tt基因型具有开花期表型材料407份，开花时间为(24～65)天，平均开花时间为(38.7
±
7.2)天。cc基因型具有开花期表型材料106份，开花时间为(27～58)天，平均开花时间为(42.6
±
6.7)天。wilcoxon秩和检验(wilcoxon rank sum test)单尾测试表明，tt基因型材料的开花时间显著早于cc基因型材料的开花时间(p《2.6e-7)。
[0071]
在南昌环境下，2020年具有冠层覆盖度表型的tt基因型材料416份，cc基因型材料112份。其中播种后61天，tt基因型冠层覆盖度为(0.28～0.98)，平均冠层覆盖度为(0.74
±
0.09)天。cc基因型冠层覆盖度为(0.53～0.92)，平均冠层覆盖度为(0.78
±
0.07)天；播种后63天，tt基因型冠层覆盖度为(0.28～0.94)，平均冠层覆盖度为(0.74
±
0.09)天。cc基因型冠层覆盖度为(0.44～0.91)，平均冠层覆盖度为(0.78
±
0.07)天；播种后65天，tt基因型
冠层覆盖度为(0.43～0.94)，平均冠层覆盖度为(0.77
±
0.10)天。cc基因型冠层覆盖度为(0.49～0.94)，平均冠层覆盖度为(0.81
±
0.08)天；播种后68天，tt基因型冠层覆盖度为(0.35～0.95)，平均冠层覆盖度为(0.73
±
0.10)天。cc基因型冠层覆盖度为(0.44～0.93)，平均冠层覆盖度为(0.77
±
0.08)天；播种后70天，tt基因型冠层覆盖度为(0.40～0.96)，平均冠层覆盖度为(0.77
±
0.11)天。cc基因型冠层覆盖度为(0.52～0.96)，平均冠层覆盖度为(0.82
±
0.08)天。wilcoxon秩和检验(wilcoxon rank sum test)单尾测试表明，tt基因型冠层覆盖度为在播种后61天(1.4e-7)，播种后63天(9.3e-7)，播种后65天(1.1e-6)，播种后68天(3.2e-07)，播种后70天(1.6e-09)均显著小于cc基因型。
[0072]
因此可以确定，利用本发明所提供的snp位点对待测大豆进行大豆冠层覆盖度和开花期的检测是可行且准确的。
[0073]
利用本发明所提供的snp位点对待测大豆进行大豆冠层覆盖度和开花期检测的具体方法如下：用实施例1所提供的全基因组重测序方法对待测大豆基因组dna进行鉴定，获得样品基因型：若所得到的基因型为tt，则所述待测大豆为候选的相对冠层覆盖度低且早花；若所得到的基因型为cc，则所述待测大豆为候选的相对冠层覆盖度高且晚花。
[0074]
大豆中chr08-11602352位点的基因型，可以作为大豆不同种植密度、生育期育种中的标记辅助选择的新遗传资源，具有非常重要的指导意义。
[0075]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。