一种针对新冠病毒omicron株S蛋白的单域抗体VHH-1及编码序列和应用的制作方法

一种针对新冠病毒omicron株s蛋白的单域抗体vhh-1及编码序列和应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学或生物技术应用领域，尤其涉及一种针对新冠病毒omicron株s蛋白的单域抗体及编码序列和应用。


背景技术：

2.2020年初至今，新冠疫情在全球蔓延给人类健康与经济发展带来严峻挑战，新冠病毒的不断变异使其传播能力更强、扩散速度更快、感染范围更广，已经成为全球公共卫生关注的重点和热点领域。新冠的防控离不开实验室的检测与鉴定，更依赖于新冠病例的有效治疗。目前，新冠病毒的主流检测技术是实时荧光pcr法，其特异性、灵敏度和引物探针的设计、体系优化、扩增仪器等密切相关，检测人员也需要严格培训。抗原检测方法的操作与成本相对较低，但目前抗原检测所用的抗体主要是针对保守性n蛋白，其检测的特异性与灵敏度不能满足市场的需要。当前，omicron株是新冠病毒在全球肆虐的主要流行株，因此利用针对新冠病毒s蛋白的单域抗体来研发快速检测试剂盒具有重要的意义，同时，也可以开发广谱性靶向治疗的单域抗体。
3.新冠病毒粒子呈球形（有些呈多形）、表面有突起、电镜下观察形似皇冠的病毒，直径在75-160nm。病毒基因为连续线性单链rna，全基因组序列全长约29000 bp，共包含14个主要的开放阅读框（orf），能够编码27种蛋白质。其中s蛋白在新冠病毒中含量丰富，相对保守，并且具有高度免疫原性，是感染后中和抗体的目标蛋白，也是检测的靶标以及治疗和疫苗设计的重点。
4.单域抗体只包含重链的可变区（vhh），其分子量很小，可以通过分子克隆从骆驼体内分离筛选得到。单域抗体不仅具有传统抗体的特异性及反应性，并且还具有更高的稳定性、可溶性及渗透性等。
5.然而，目前本领域尚缺乏令人满意的针对新冠病毒s蛋白的单域抗体。因此，本领域迫切需要开发新的有效针对s蛋白的特异性单域抗体，用于建立高效的检测方法，并且为研发抗新冠病毒单域抗体药物提供试验依据及候选材料。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种针对新冠病毒omicron株s蛋白的单域抗体，同时提供该单域抗体的编码序列及该单域抗体在检测及治疗中的应用。
7.本发明所采用的技术方案是 ：本发明第一方面，提供了1条 新冠病毒omicron株s蛋白单域抗体的 vhh-1，其特征在于，所述的vhh包含seq id no:7所示的cdr1，seq id no:8所示的cdr2以及seq id no:9所示的cdr3。在一个具体的实施例中，所述的vhh-1的氨基酸序列为含有上述3个cdr的vhh链，且与seq id no:4长度相同且具有95%以上同源性的氨基酸序列；在另外一个具体的实施例中，所述的vhh的氨基酸序列如seq id no:4所示。
8.本发明的第二个方面提供编码上述的单域抗体vhh-1的核酸；在一个具体的实施例中，所述的核酸的序列如seq id no:1所示。
9.本发明的第三个方面是提供制备上述新冠病毒omicron株s蛋白单域抗体的方法，所述的方法是将编码所述vhh-1链的核酸插入表达载体中，将表达载体转入宿主细胞，培养所述的宿主细胞后纯化获得所述的单域抗体。在其中的一个具体的实施例中，所述的表达载体为杆状病毒表达载体pfastbac，所述的宿主细胞为sf9昆虫细胞。
10.本发明的第四个方面提供本发明的新冠病毒omicron株s蛋白单域抗体vhh-1在制备诊断新冠病毒omicron株的产品中的应用。所述的产品包括但不限于试剂盒、试纸条等。
11.本发明的第五个方面是提供本发明所述的本发明的新冠病毒omicron株s蛋白单域抗体vhh-1在制备治疗新冠病毒omicron株的产品中的应用；在一个具体的实施例中，所述的治疗产品包括但不限于口服剂、注射剂、喷鼻剂。
12.本发明的第六个方面提供一种药物组合物，其中包含本发明所述的本发明的新冠病毒omicron株s蛋白单域抗体vhh-1以及药学上可接受的载体。
13.本发明的有益效果：本发明利用已建立的羊驼外周血淋巴细胞建立的天然单域抗体噬菌体展示库，用生物素化s蛋白作为抗原，经过3轮免疫淘选后，再将s蛋白包被elisa板，用淘选后单克隆菌落表达的抗体作为一抗，筛选阳性的单克隆菌落，并将相应菌液扩增后测序，最终获得针对s蛋白特异性单域抗体 vhh 链的基因序列。将特异性单域抗体扩增克隆至杆状病毒表达载体中，获得了在昆虫sf9细胞中高效表达的针对s蛋白的特异性单域抗体。经wb试验鉴定，本抗体具体良好的免疫检测效果，为建立快速、准确的检测新冠病毒的抗原方法奠定了关键基础。
附图说明
14.图1新冠病毒omicron株s蛋白单域抗体在sf9细胞中表达纯化及western blot特异性鉴定；图2 新冠病毒omicron株s蛋白单域抗体的中和活性鉴定（中和效价为1:64）。
具体实施方式
15.下面结合具体实施例和说明书附图对本发明所述作进一步说明，但应该理解，本发明的保护范围并不限于以下实施例。
16.实施例 1：针对 s蛋白的天然单域抗体的免疫淘选过程（1）将已建立的天然单域抗体噬菌体文库进行扩增：100
µ
l甘油菌文库加入2
×
yt培养基，od600=0.5时，加入20 moi辅助噬菌体，静置30min，离心后将沉淀用2
×
yt培养基重悬，再培养1h，再加抗生素培养16h后离心，其上清经预冷peg-nacl（1/4体积）沉淀，1ml pbs重悬即为扩增的单域抗体文库；（2）免疫管淘选：将s蛋白（omicron株s基因orf全长表达、带生物素标签并且纯化）50
µ
g/管包被免疫管过夜，去除包被液后洗涤3次，用2ml bsa(1% )封闭2h，pbst洗涤3次，加入100
µ
l（1）步扩增的单域抗体文库作为一抗，37℃作用2h，pbst洗涤3次，用glycine-hci(ph2.2)洗脱，洗脱液用tris-hci调节至ph 7.4，获得淘选的第一轮天然单域抗体文库；
（3）将（2）步获得的第1轮天然单域抗体文库按照（1）步进行扩增，获得第1轮天然单域抗体重悬文库，然后重复（2）步免疫管淘选步骤，只是一抗加入的是100
µ
l扩增的第1轮天然单域抗体重悬文库，最后获得淘选的第2轮天然单域抗体文库；（4）将（3）步获得的第2轮天然单域抗体文库按照（1）步进行扩增，获得第2轮天然单域抗体重悬文库，然后重复（2）步免疫管淘选步骤，只是一抗加入的是100
µ
l扩增的第2轮天然单域抗体重悬文库，最后获得淘选的第3轮天然单域抗体文库。
17.实施例 2：单个克隆的elisa鉴定（1）淘选的单个阳性克隆摇菌扩增用于抗体表达：将实施例1中淘选的第3轮天然单域抗体文库接种于2
×
yt培养基，od
600nm
=0.5时，加入20 moi辅助噬菌体，静置30min，离心后将沉淀用2
×
yt培养基重悬，再培养1h，然后涂布于含抗生素的2
×
yt平板，培养过夜，次日挑选40个单菌落接种到2
×
yt培养基中，od600=0.5时，加入20 moi辅助噬菌体，静置30min，离心后将沉淀用2
×
yt培养基重悬，再培养，并加入iptg进行诱导表达8h。
18.（2）elisa鉴定：将s蛋白（omicron株s基因orf全长表达、带生物素标签并且纯化、浓度1ng/
µ
l）100
µ
l/孔包被elisa板过夜，去除包被液后洗涤3次，用200
µ
l/孔 bsa(3% )封闭2h，pbst洗涤3次，加入100
µ
l/孔 （1）步分别扩增的单域抗体文库作为一抗（文库构建载体带m13），37℃作用2h，pbst洗涤3次，二抗加入m13-hrp，终止后检测od450nm值，结果判读：比对照组od450nm值高出3倍判为阳性（结果见表1）。
19.表1：elisa实验筛选获得阳性克隆实施例 3：阳性克隆的测序鉴定将实施例 2中经elisa检测为阳性的克隆对应相应菌液提取质粒，利用质粒载体的通用引物进行测序。根据序列比对软件 mega 6.0 分析各个克隆株的基因序列，把 cdr1、 cdr2、cdr3 序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，最终获得3株针对s蛋白特异性单域抗体序。其抗体的核苷酸序列为seq id no：1-3，氨基酸序列为 seq id no：4-6，其中包含所示的cdr1-cdr2-cdr3区，构成主体的vhh链。
20.实施例 4 ：s蛋白单域抗体在sf9昆虫细胞中表达纯化及鉴定(1) 针对s蛋白单域抗体的pfastbac-vhh重组质粒构建：以seq id no：1对应的克隆菌液，提取的质粒作为模板，采用vhh链的引物vhh-f：ggatccgatg tgcagctgca ggagtctgg（seq id no:16）和vhh-r：aagcttgctg gagacggtga cctgggttc (seq id no:17)
进行扩增，上、下游引物带有bamh i和hind iii酶切位点，扩增片段为400bp左右。另外，将pfastbac载体经bamh i和hind iii双酶切后，回收片段，然后将vhh片段插入到pfastbac载体中构成pfastbac-vhh重组质粒。
21.（2）针对s蛋白单域抗体的bacmid-vhh杆粒筛选：pfastbac-vhh重组质粒无菌提取后，转化入dh10bac 感受态细胞中，涂布于luria agar选择性平板，48 h后挑选白斑接种于选择性ktg/lb培养液中，培养后提取质粒，用m13引物来扩增并测序鉴定，阳性克隆即bacmid-vhh杆粒。
22.（3）s蛋白单域抗体的重组病毒包装：利用2ml/孔的完全培养基将sf9细胞在6孔板中培养至80%，将所得重组bacmid-vhh质粒利用脂质体cellfectine 试剂转染sf9细胞，96 h后细胞出现肿胀、变圆，折光性增强，细胞间紧密连接消失，细胞核增大、核内出现空泡、感染晚期细胞逐渐脱落等典型的cpe，而正常对照sf9细胞大小均匀、细胞核致密，无细胞病变出现，表明重组杆状病毒包装成功。
23.（4）s蛋白单域抗体的分泌表达及鉴定：重组杆状病毒包装成功后，利用pfastbac载体(载体带6
×
his标签)，因此可以用抗his的抗体对基因的表达进行鉴定。将重组杆状病毒感染sf9细胞后的上清和细胞进行了western blot检测，结果显示在感染重组病毒的sf9细胞上清和细胞中出现15kd的目的条带（见图1a： marker：蛋白marker； lane 1：蛋白电泳对照； lane 2：s蛋白单域抗体sds电泳），与单域抗体的分子量一致。
24.（5）s蛋白单域抗体的纯化：将high five细胞传至t75细胞瓶中，待细胞贴壁生长至70 % ~ 80 %丰度后，用重组杆状病毒bacmid-vhh以moi = 8感染high five细胞，感染96 h后high five细胞出现变大、变圆、脱落等病变后，收集感染细胞培养上清，于4 ℃ 2000 rpm离心10 min，收取培养上清，先用35 %的硫酸铵沉淀，再过ni
+-nta亲和层析柱纯化，并且利用qubit 2.0定量试剂盒进行每次回收纯化蛋白的定量。
25.实施例 5：s蛋白单域抗体的特异性鉴定s蛋白单域抗体的western blot鉴定特异性：a蛋白电泳：将纯化的s蛋白、甲型流感ha蛋白、乙型流感ha蛋白、副流感病毒hn蛋白、呼吸道合胞病毒的g蛋白分别用6 x sds蛋白电泳加样缓冲液稀释至60μg, 100 ℃煮沸5 min, 预染marker 2
ꢀµ
l ，进行蛋白电泳浓缩胶80 v，分离胶120 v。
26.b. 转膜：将凝胶放在硝酸纤维素膜（nc膜）上，上下各放3张whatman 3 mm滤纸，将上述物品放至转膜电泳缓冲液中浸泡15min，以驱除留于滤膜上的气泡。按顺序安装电转移装置，在阴性电极板上依次放置3张滤纸、凝胶、nc膜、3张滤纸，确保各层精确对齐（从下到上），并驱除各层间气泡，标记方位，合上阳极板。2 ma/cm2恒流2 h条件下转膜。
27.c. western blot鉴定：先用5 %脱脂奶粉、4 ℃过夜封闭；再加纯化后带his标签的的s蛋白单域抗体（5 %脱脂奶以1: 3000稀释），室温下孵育膜3 h；再用pbst（吐温为1
ꢀ‰
）洗膜三次，每次10 min；然后加羊抗his的dy800抗体（5 %脱脂奶以1: 20000稀释），室温下避光孵育40 min；最后利用odyssey的700和800两个荧光通道进行扫描鉴定（见图1b，其中 lane 3：s蛋白上样wb鉴定； lane 4~lane7：甲型流感ha蛋白、乙型流感ha蛋白、副流感病毒hn蛋白、呼吸道合胞病毒的g蛋白的wb鉴定。），说明s蛋白单域抗体与s蛋白特异性结合，与其他4种呼吸道病原体的蛋白没有发生交叉的反应。
28.实施例 6：s蛋白单域抗体的中和活性及稳定性鉴定
在p3实验室采用微量细胞中和试验进行验证。将s蛋白单域抗体用生理盐水进行倍比稀释1:2~1:128，将1份免疫血清作为阳性对照，也进行1:2~1:128的倍比稀释，每个稀释度设置5个重复。在稀释好待检样本的培养板各孔中均加入含100tcid
50 的病毒液，同时设置阴性血清对照的倍比稀释孔，补加等量的稀释液。将所有培养板放入37℃ 细胞培养箱中和2 h。中和后每孔加vero 细胞悬液，放置37℃培养箱培养5 d。同时设正常细胞对照。5d后观察并计数每个培养孔是否发生病变，即能够保护50% 细胞不受100tcid
50
病毒感染的血清最高稀释度为该血清的抗体滴度，全程试验重复3次。图2是新冠病毒omicron株s蛋白单域抗体的中和活性鉴定中和活性试验结果。s蛋白单域抗体最终检测效价为1:64、阳性对照血清的中和效价为1:32（≧1：4判定为阳性）。表明s蛋白单域抗体具有较高的中和效价（1:64），3次重复试验的变异系数《3%，说明该单域抗体具有优异的稳定性。
29.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。