深海微杆菌SUC7及其产生的蔗糖磷酸化酶和应用的制作方法

深海微杆菌suc7及其产生的蔗糖磷酸化酶和应用
技术领域
1.本发明涉及一种深海微杆菌suc7及其产生的蔗糖磷酸化酶和应用，属于海洋微生物技术领域。


背景技术：

2.具有美白及保湿功效的抗坏血酸葡糖苷（aa-2g）、熊果苷（arbutin）和甘油葡糖苷（2-α-gg）价格昂贵，一般添加于高档化妆品中，限制了其广泛的应用。传统的制备方法集中于化学合成和天然材料提取，其中提取法因原材料的限制，难以可持续发展和降低成本；化学合成虽然生产效率高，但容易引入一些化学异构成分和有机溶剂等杂质，造成其后续纯化工艺复杂，提高了其生产成本。随着酶学和合成生物学的发展，通过蔗糖磷酸化酶酶法转化生产成为一条可持续、绿色的制备工艺。酶法转化具有反应条件温和、不会出现异构成分和引入有机溶剂等杂质的优点，因此越来越受到重视。
3.海洋微生物因其生活环境的独特性及环境适应性，故作为产酶微生物资源具有显著的优势：耐压，耐碱，耐盐，耐冷，物种多样性，代谢易调控，低温下有较高活性等特性，赋予海洋微生物酶广泛的应用前景。因此从海洋环境筛选高产蔗糖磷酸化酶的菌株，是今后研究和开发新型蔗糖磷酸化酶的关键。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的能产蔗糖磷酸化酶的来自海洋的微杆菌suc7。
5.本发明要提供的另一个技术问题是提供上述来自海洋的微杆菌suc7产的蔗糖磷酸化酶的方法和应用。
6.本发明是通过如下技术方案来实现的：一种深海微杆菌（microbacterium sp.）suc7，其菌株保藏号为cctcc no：m 2022395。
7.本发明所涉及的菌株suc7是来自马里亚纳海沟深海沉积物中分离筛选到的微杆菌属suc7（microbacterium sp.suc7），该菌株已于2022年4月8日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国湖北省武汉市武昌区八一路299号，电话：(027)-6875 2319。
8.本发明还公开了利用所述微杆菌（microbacteriumsp.）suc7产生的蔗糖磷酸化酶。
9.本发明还提供所述蔗糖磷酸化酶的制备方法，所述方法为接微杆菌suc7到液体种子培养基(ph＝7.0)中，在20-25℃、摇床恒温培养18-24h后，取培养液按照接种量体积比5-10％接入液体发酵培养基中，摇床恒温20-25℃培养24-48h，离心收集菌体，重悬后破碎菌体，离心得到上清液即为蔗糖磷酸化酶粗酶液。
10.进一步，所述液体种子培养基配方为：牛脑12.5g、牛心浸出汁5.0g、蛋白胨10.0g、葡萄糖2.0g、氯化钠5.0g、磷酸氢二钠2.5g、蒸馏水1000ml、ph 6.8-7.2。液体发酵培养基的
配方为：胰蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、蔗糖5.0g、氯化钠 5.0g、蒸馏水1000ml、ph 6.8-7.2。
11.上述蔗糖磷酸化酶具有如下酶学性质：最适反应温度为50℃，在30
−
50℃时该酶表现出高于其最高酶活性的80%。
12.本发明还提供了所述蔗糖磷酸化酶制备α-熊果苷的应用，所述应用方法为以蔗糖和对苯二酚为底物，加入蔗糖磷酸化酶粗酶液，反应体系放置于30-50℃下充分避光反应24
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48h，沸水浴终止反应，过滤后，即可得到α-熊果苷反应液。
13.进一步，所述蔗糖和对苯二酚在反应体系中的质量比为15:1-50:3。
14.进一步，蔗糖磷酸化酶粗酶液的酶活力为100-300 u/ml。
15.进一步，所述反应体系包括mes-naoh缓冲液。
16.本发明与现有技术相比的有益效果：本发明提供了一种新的从马里亚纳海沟沉积物样品中筛选到的高产蔗糖磷酸化酶的海洋微生物菌株微杆菌suc7，并公开了其产酶的方法。该菌株为首次报道的具有产蔗糖磷酸化酶酶活性的微杆菌属微生物，本发明有效地拓宽了蔗糖磷酸化酶的来源。本发明所产蔗糖磷酸化酶具有较优的酶性质，最适反应温度50℃，高于常见的肠膜明串珠菌atcc 12291蔗糖磷酸化酶（35℃）；利用该菌产生的蔗糖磷酸化酶转化制备α-熊果苷，其产量可达到33.2g/l，具有广泛的应用前景。
附图说明
17.图1为蔗糖磷酸化酶的最适反应温度图；图2为α-熊果苷标准品液相图；图3为对苯二酚标准品液相图；图4为α-熊果苷标准曲线图；图5为α-熊果苷反应液液相图。
具体实施方式
18.下面结合具体实例，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。实施例中所用到的培养基：液体种子培养基：牛脑12.5g、牛心浸出汁5.0g、蛋白胨10.0g、葡萄糖2.0g、氯化钠5.0g、磷酸氢二钠2.5g、蒸馏水1000ml、ph 6.8-7.2。
19.固体种子培养基：牛脑12.5g、牛心浸出汁5.0g、蛋白胨10.0g、葡萄糖2.0g、氯化钠5.0g、磷酸氢二钠2.5g、琼脂30g、蒸馏水1000ml、ph 6.8-7.2。
20.液体发酵培养基：胰蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、蔗糖5.0g、氯化钠 5.0g、蒸馏水1000ml、ph 6.8-7.2。
21.实施例1称取1g马里亚纳海沟深海沉积物样品放入50ml 液体种子培养基中，25℃、180r/min培养1-3d。选取培养液的稀释液涂布固体种子培养基（3%琼脂的液体种子培养基）中，25℃培养1-2d，菌落长出后挑取单菌落，接种于液体发酵培养基中，25℃培养1-2d，离心收集菌体，重悬后破碎菌体，进行蔗糖磷酸化酶活性测定，选取酶活力较高的菌株，命名为suc7。
用细菌基因组提取试剂盒提取suc7的基因组，选用扩增原核微生物16s rdna序列的通用引物(27f：5
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agagtttgatcctggctcag-3’和1492r：5
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ggttaccttgttacgactt-3’)进行聚合酶链式反应。反应体系：taq plus ploymerase(0 .4μl)，上下游引物(各1μl)，dntp(1μl)，pcr buffer(2μl)，dna模板(2μl)，超纯水(12 .6μl)。反应条件：94℃变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃5min。将pcr产物琼脂糖电泳纯化回收并构建克隆载体，挑选阳性克隆子送往上海生工测序，将测得的序列反向互补拼接后，获得1417bp的碱基片段；其16s rdna全序列如seq id no:1所示，全长为1417bp。根据其16srdna 序列相似性比对，suc7 的16srdna 与microbacterium oxydans有99% 的同源性，鉴定确定为微杆菌属的细菌，是microbacterium的新菌株。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2022395，保藏地址为：中国湖北省武汉市武昌区八一路299号。
22.该菌株具体有以下特征：菌株为革兰氏阳性杆菌，乳白色菌落；该菌株过氧化氢酶阳性；能水解淀粉、弱水解明胶、不能分解纤维素；能利用乳酸、甘露糖、蔗糖、葡萄糖和甘露醇。该菌株生长温度范围为20-40℃，最适生长温度为25℃；ph生长范围为6-11，最适生长ph为7；nacl浓度范围为0-12％，最适生长nacl浓度为2％。
23.实施例2，一种如实施例1所述来自海洋的微杆菌（microbacteriumsp.）suc7产蔗糖磷酸化酶的方法：将微杆菌suc7接种到液体种子培养基中，装液量为20％，在25℃、180r/min下培养24h得到种子液；将种子液接种至液体发酵培养基中，接种量为8％，装液量为20％，在25℃、180r/min下培养48h，离心收集菌体，重悬后破碎菌体，离心得到上清液即为蔗糖磷酸化酶粗酶液。
24.实施例3，蔗糖磷酸化酶的最适反应温度最适反应温度：将10 μl 蔗糖磷酸化酶粗酶液和90 μl 50 mm 磷酸缓冲液混合后，在不同温度条件下分别水浴中温育10 min，加入100 μl 5% (m/v) 蔗糖溶液充分混合后，30℃下反应10 min，测定相对酶活。
25.测定结果表明，所述蔗糖磷酸化酶最适反应温度为50℃，在30
−
50℃时该酶表现出高于其最高酶活性的80%。结果见图1。与肠膜明串珠菌atcc 12291蔗糖磷酸化酶的最适反应温度35℃相比有较大的提升（kumiko, kitaoka, hideki, et al. purification and characterization of sucrose phosphorylase from leuconostoc mesenteroides atcc 12291 cells, and disaccharides synthesis by the enzyme[j]. journal of applied glycoscience, 1994, 41(2):165-172.）。
[0026]
实施例4，利用微杆菌suc7转化制备α-熊果苷的方法，步骤如下：取18 g蔗糖和1.2 g对苯二酚溶解于ph为7.0、含有200 u/ml 上述蔗糖磷酸化酶粗酶液的mes-naoh缓冲液中，反应总体系为30 ml，将反应体系放置于40℃下充分避光反应24 h，沸水浴 5 min 终止反应。用0.22 μm 过滤器过滤后，即可得到α-熊果苷反应液，其含量用高效液相色谱的方法进行检测，经过测定，α-熊果苷产量达到33.2g/l。
[0027]
液相色谱检测条件：将岛津高效液相色谱仪配备的紫外检测器设置波长280 nm，使用kromasil 100-5c18色谱柱（4.6
×
250 mm）。流动相为甲醇乙酸混合溶液，其中水：甲醇：乙酸的体积比为95:5:1，流速为0.5 ml/min。控制柱温为30 ℃，进样量为10 μl。
[0028]
产物α-熊果苷标准品的hplc图谱如图2所示，其出峰时间为11.58min。糖基受体底物对苯二酚的hplc图谱如图3所示，其出峰时间分别为15.05min。同样条件下，以α-熊果苷
标准品水溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标制备标准曲线，结果见图4所示。α-熊果苷反应液hplc图谱如图5所示。从色谱图中可以看出，蔗糖和对苯二酚在蔗糖磷酸化酶的作用下，产生了α-熊果苷。
[0029]
16srdna ：gggactgcggcgtgcttacacatgcagtcgaacggtgaacacggagcttgctctgtgggatcagtggcgaacgggtgagtaacacgtgagcaacctgcccctgactctgggataagcgctggaaacggcgtctaatactggatatgtgacgtgatcgcatggtctgcgtctggaaagaatttcggttggggatgggctcgcggcctatcagcttgttggtgaggtaatggctcaccaaggcgtcgacgggtagccggcctgagagggtgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcaacgccgcgtgagggacgacggccttcgggttgtaaacctcttttagcagggaagaagcgaaagtgacggtacctgcagaaaaagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggtttgtcgcgtctgctgtgaaatccggaggctcaacctccggcctgcagtgggtacgggcagactagagtgcggtaggggagattggaattcctggtgtagcggtggaatgcgcagatatcaggaggaacaccgatggcgaaggcagatctctgggccgtaactgacgctgaggagcgaaagggtggggagcaaacaggcttagataccctggtagtccaccccgtaaacgttgggaactagttgtggggtccattccacggattccgtgacgcagctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggcggagcatgcggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatatacgagaacgggccagaaatggtcaactctttggacactcgtaaacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgttctatgttgccagcacgtaatggtgggaactcatgggatactgccggggtcaactcggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgtcttgggcttcacgcatgctacaatggccggtacaaagggctgcaataccgtgaggtggagcgaatcccaaaaagccggtcccagttcggattgaggtctgcaactcgacctcatgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcaagtcatgaaagtcggtaacacctgaagccggtggcctaacccttgtggagggagccgtacga。