地衣芽孢杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种地衣芽孢杆菌及其应用，来源于深海的地衣芽孢杆菌（Bacillus?licheniformis）SWJS33于2013年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7388。该地衣芽孢杆菌能应用于液体发酵生产蛋白酶中，经单因素实验优化了地衣芽孢杆菌（Bacillus?licheniformis）SWJS33产蛋白酶的条件，其培养、发酵条件简单，遗传性质稳定。由于该菌株来源于深海，所分泌蛋白酶在pH6.0-11.0均有较好的稳定性，可广泛应用于食品、酿造、医药、纺织、皮革、洗涤剂、饲料以及水产加工等多个行业。
【专利说明】地衣芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物筛选及发酵领域，具体涉及地衣芽孢杆菌licheniformis) SWJS33及在液体发酵产蛋白酶的应用。
【背景技术】
[0002]蛋白酶(Protease)属于水解酶类，是最重要的三大工业用酶之一，销售额约占全球酶制剂市场的60%。目前，已被结晶和纯化的蛋白酶超过100种。蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。20世纪90年代后，随着基因工程的发展，新型发酵设备的发明以及发酵技术的进步，利用微生物所产的酶成为了酶制剂的主要来源。微生物来源的酶制剂，相比于木瓜、猪胰脏等动植物来源的酶制剂有其不可替代的优势。首先，微生物生长繁殖速度快，产酶量较高；其次，微生物无处不在，几乎在所有的环境中都有微生物存在，由于环境的不同，微生物的种类以及所产酶也不尽相同，从而不同类型以及特性的酶制剂几乎都能从微生物中获得，如高温酶、中温酶、低温酶、耐高盐酶、耐碱酶等；再次，微生物培养条件容易控制，可进行连续的发酵，并且可以大批量生产，不仅能降低生产成本，而且能保证酶制剂的供应量。
[0003]碱性蛋白酶(AlkalineProtease)是一类适宜于在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类,广泛存在于微生物及动、植物中，在工业用酶中占十分重要的地位。1945年瑞士 Dr.Jaag等人在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中发现了碱性蛋白酶。随着工业的发展，碱性蛋白酶在制革、洗涤和食品等行业中有着广泛的用途。由于微生物所产蛋白酶均为胞外酶，不仅来源广、酶类型丰富、菌体易培养、产量大，而且下游技术处理较动、植物蛋白酶简单，同时更有易于大批量生产。并且，碱性蛋白酶较中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力，因此，碱性蛋白酶的研究已成为蛋白酶研究的热点。
【发明内容】
[0004]本发明目的之一是提供了一种可产碱性蛋白酶的海洋菌株即地衣芽孢杆菌。
[0005]本发明中可生产蛋白酶的深海菌株,为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SWJS33，该菌于2013年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCCN0.7388。
[0006]对该菌进行形态学及生理生化鉴定，保藏号为CGMCC N0.7388的菌株有以下特征:
(I)菌落形态:白色，直径较小，呈圆形，表面光滑，低凸起，不透明，边缘整齐；(2)细胞形态:杆状，单个排列，单端生鞭毛，革兰氏阳性；(3):生理生化特征:生长温度为4-40°C，好氧，能耐受7% (wt)氯化钠，能水解明胶、淀粉、酪素，能利用硫酸铵、硝酸铵，可利用果糖、葡萄糖为碳源，不能利用甘露醇和木糖，吲哚反应为阴性，甲基红试验、接触酶和氧化酶试验为阳性，产过氧化氢酶，不产硫化氢。
[0007]保藏号为CGMCC N0.7388菌株经16S rDNA鉴定，测得基因片段长度为1049bp，具体基因序列见序列表。将获得的基因序列输入Genbank,应用Blast程序将获得的基因序列与数据库中基因序列进行对比。结果显示与地衣芽孢杆菌rifeciBtts licheniformis)的16S rDNA序列的同源性为99%。将此结果结合菌株形态学及生理生化鉴定特征，确定该菌为地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)。
[0008]本发明目的之二是提供了所述地衣芽孢杆菌在液体发酵产蛋白酶的应用。
[0009]通过单因素试验对保藏号为CGMCC N0.7388菌株的液体发酵产蛋白酶条件进行了优化。
[0010]本发明公开了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) SWJS 3 3产蛋白酶的条件，其培养、发酵条件简单，遗传性质稳定。由于该菌株来源于深海，所分泌蛋白酶在PH6.0-11.0均有较好的稳定性，可广泛应用于食品、酿造、医药、纺织、皮革、洗涤剂、饲料以及水产加工等多个行业。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为不同种子液培养时间对地衣芽孢杆菌licheniformis) SWJS33产蛋白酶的影响曲线。
[0012]图2为不同装 液量对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) SWJS33产蛋白酶的影响曲线。
[0013]图3为不同发酵温度对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) SWJS33产蛋白酶的影响曲线。
[0014]图4为不同发酵时间对地衣芽抱杆菌SWJS33产蛋白酶的影响曲线。
具体实施例
[0015]富集及种子培养基:蛋白胨5g，酵母膏lg，硫酸铁0.lg，人工海水1L，pH7.6-7.8。
[0016]酪蛋白培养基:酪蛋白10g，牛肉浸粉3g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2g，琼脂15g，去尚子水 L, pH7.3-7.5。
[0017]发酵培养基:麦芽糖5g，酵母粉10g，氯化钙2.8g，氯化钠lg，SE 170 1.5g，去离子水 1L，pH7.5。
[0018]编号CGMCC N0.7388菌株的分尚、筛选
细菌的富集:取少许海泥于含无菌去离子水的锥形瓶中，加入几粒无菌玻璃珠，37°C、150rpm摇床中分散30min。吸取Iml上清液接种于富集培养基中(25ml/250ml)，37°C、150rpm摇床中培养24h。
[0019]初筛:取Iml富集液适当稀释后涂布于酪蛋白培养基上。若细菌产蛋白酶，在菌落周围出现透明水解圈，根据水解圈直径(D)与菌落直径(d)的比值(D / d)大小确定产蛋白酶能力较强的菌株。
[0020]分离纯化:挑取D / d比值较大的菌株，连续划线分离三次以上，得纯培养物。将其于接种于斜面上，4°C保藏。
[0021]复筛:将上述保藏的菌株接种于种子培养基中，37°C，150rpm，活化12h后，以1%的接种量接种于发酵培养基中(25ml/250ml)，发酵培养48h。将发酵完成液于4°C，IOOOOrpm条件下高速离心lOmin，过滤得上清液，即粗酶液。采用福林-酚法测发酵液中性蛋白酶酶活，筛选出酶活较高的菌株。
[0022]编号CGMCC N0.7388菌株的鉴定
将活化的编号CGMCC N0.7388的菌株接种于L-B培养基中，37°C，150rpm培养12h，经L-B培养液传代培养2-3次后，取1.5mL对数生长末期的菌体培养物，4°C，IOOOOrpm离心5min，收集菌体，去尽培养液。菌体经SDS及蛋白酶K裂解、酚-氯仿-异戊醇抽提、转移上清、0.6倍体积异丙醇析出DNA沉淀后短暂离心、70%乙醇洗涤、TE溶解模板DNA。电泳检测后采用通用引物进行PCR (正向引物:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物:5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。
[0023]扩增总反应体系为(20 ii L):模板基因DNA 0.5liL;上下游引物(20iimol/l)各
l.0uL ；Taq DNA 聚合酶 0.2 y L ； 10 X buffer 2.0 u L ;4 种脱氧核苷酸混合物 dNTP (各 2.5mmol/L) 1.6 u L, 25 mmol/L MgCl2 1.6 y L，双蒸水(ddH20) 12.1 y L。PCR扩增条件:95°C 5min ；95°C 30 s ；55°C 30 s ；72°C 1.5 min ；72°C 10 min ;10°C，共30个循环。PCR产物纯化后完成测定的16S rDNA基因基因片段长度为1049bp,与licheniformis strain相似性最高，同源性达99%，具体序列见序列表。结合菌株形态学、生理生化特征，判定编号CGMCC N0.7388 的菌株为地衣芽抱杆菌licheniformis)。
[0024]地衣芽孢杆菌CGMCC N0.7388液体发酵产蛋白酶条件优化
种龄的优化:将菌株接种于种子液中，37°C，150rpm，分别培养4h、8h、12h、16h、24h后，接种于发酵培养基发酵48h，测定其酶活。结果见图1。种龄在8-12h时，发酵液中的蛋白酶活力较高。
[0025]摇瓶装液量的优化:采用250ml锥形瓶进行摇瓶发酵，装液量分别为10%、20%、30%、40%、60%、80%，在371 :，150印111条件下发酵48h。测定发酵液中蛋白酶酶活，结果如图2，装液量为10%时酶活最高，随着装液量的增加，蛋白酶酶活迅速降低。
[0026]发酵温度的优化:将发酵液分别置于25 °C、30 °C、37 °C、40 °C、45 °C、50°C下，150rpm，装液量为10%，发酵培养48h。测其发酵液中蛋白酶酶活，结果如图3，在37°C下发酵，发酵液中蛋白酶活较高。
[0027]发酵时间优化:将接种后的装液量为10%的发酵液放于37°C，150rpm，培养72h，每隔6h取样，测其蛋白酶酶活。结果如图4，蛋白酶活在48h时达到最大，随着时间延长，酶活有较小幅度下降。
[0028]编号CGMCC N0.7388菌株的遗传稳定性
将保藏的编号CGMCC N0.7388菌株连续传代培养，并测其酶活，以酶活力作为评价遗传稳定性的指标。结果如表1，传代8次，蛋白酶力保持在400U/ml左右，表明菌株有较好的遗传稳定性。
[0029]表I
【权利要求】
1.地衣芽抱杆菌该菌于2013年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.7388。
2.权利要求1所述地衣芽孢杆菌yidmi/orffiidSWJSSS在液体发酵生产蛋白酶的 应用。
【文档编号】C12N9/56GK103451121SQ201310214063
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年6月3日 优先权日:2013年6月3日
【发明者】崔春, 赵谋明, 钟泓波, 赵海峰, 任娇艳 申请人:华南理工大学