用于生物样本处理之组合物及使用其之核酸扩增方法
【专利摘要】本发明提供用于生物样本处理之组合物及使用其之扩增核酸之方法，该用于生物样本处理之组合物包括至少一种卤烃化合物、至少一种聚醚以及至少一种表面活性物质，其中该卤烃化合物的含量为该组合物总重量的1～70重量%。根据本发明，可于单一管中以单一步骤完成生物样本的胞解与均质化，并可于同一管中直接添加核酸扩增用之试剂，藉此简化操作流程，降低污染风险及操作时间，得到背景干扰低之核酸扩增结果。
【专利说明】用于生物样本处理之组合物及使用其之核酸扩增方法
[0001]【技术领域】本发明关于简化处理生物样本之组合物及使用该组合物进行核酸扩增之方法。
【背景技术】
[0002]习知用于核酸扩增反应的市售试剂，例如Qiagen等，通常包含数种作用不同的溶液。例如，用于样本处理的溶液，包括蛋白质酶或胞解(Iysis)缓冲液，以及用于核酸扩增之溶液，包括聚合酶、脱氧核糖核酸、缓冲液等。
[0003]然而，目前市售试剂多以多管进行，而使操作过程中发生样本污染的机率增加。而且，由于样本需经过多种溶液处理，将无法避免因处理溶液所造成的背景干扰而影响最终结果的灵敏度。
[0004]因此，为了降低操作中的污染风险、减少背景干扰、及简化操作步骤，有发展新颖试剂的需求。
【发明内容】
[0005]本发明一实施形态提供一种用于生物样本处理之组合物，包括:至少一种卤烃化合物、至少一种聚醚以及至少一种表面活性物质，其中该卤烃化合物的含量为该组合物总
重量的I~70重量％。
[0006]本发明另一实施形态提供一种核酸扩增之方法，包括:于一生物样本中添加含有至少一种卤烃化合物、至少一种聚醚以及至少一种表面活性物质之组合物，使其均匀混合，形成一均质溶液；以及于该均质溶液中添加核酸扩增反应之试剂，使其均匀混合，进行核酸扩增反应；其中，该卤烃化合物的含量为该组合物总重量的I~70重量％。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]第I图为显示使用本发明一实施例之组合物与市售试剂处理生物样本后经PCR扩增所得之DNA样本的电泳图。
[0008]第2图为显示使用本发明一实施例之组合物处理多种样本体积后经PCR扩增所得之DNA样本的电泳图。
[0009]第3图显示使用本发明一实施例之组合物处理血液样本后经实时PCR扩增所得之18S RNA的扩增图。
[0010]第4图显示使用本发明一实施例之组合物处理血液样本后经实时PCR扩增所得之GAPDH区间的扩增图。
[0011]第5图显示使用本发明一实施例之组合物与市售试剂处理登革热病毒样本后经RT-PCR扩增所得之DNA样本的电泳图。
[0012]第6图为显示使 用本发明一实施例之组合物与市售试剂处理血液及脾组织样本后经RT-PCR扩增所得之18S RNA、GAPDH的电泳图。
[0013]第7图为显示使用本发明一实施例之组合物与市售试剂处理血清样本后经多重PCR扩增所得之GAPDH、β -激动蛋白Ol基因、β -激动蛋白02基因的电泳图。
[0014]第8图为显示本案一实施例之组合物处理植物组织样本后经PCR扩增所得之多种基因的电泳图。
[0015]第9图为50倍光学显微镜拍摄(PCR反应前)，PCR试剂已包覆于油球内，白色部分为突光染剂及所包覆的核酸，黑色部分为背景及凝胶样物质(gel-like material)。
[0016]第10图为20倍显微镜照片，其中Targetl为DNA-探针_Cy3，标记为探针l_Cy3 ；Target2为DNA-探针_Cy5，标记为探针2_Cy5 ；NC (阴性对照)为油球，标记为FAM染料；WL为白光。【具体实施方式】
[0017]本发明之具体实施详细说明如下，然而以下的实施例仅用于进一步揭露本发明之技术内容，不应藉以限制本案的发明范畴。
[0018]习知用于核酸扩增之试剂，例如Qiagen等，主要包括用于样本处理的试剂及用于核酸扩增的试剂。用于样本处理的试剂通常包含分解蛋白杂质的蛋白酶K、使组织样本均质的均质溶液、造成组织胞解(Iysis)的胞解溶液、与核酸分子连结(binding)的缓冲液、洗漆液(washing buffer)及冲提液(elution buffer)。用于核酸扩增的试剂则通常包含使核酸延长、扩增之聚合酶(polymerase)、脱氧核糖核酸(dNTPs)及缓冲液。
[0019]然而，根据市售试剂之操作手册，其操作需分管进行，因此提高样本污染的机率以及增加操作时间。再者，必须使用酚、氯仿等的有毒溶剂，对操作者及环境并不友善。其次，习知的核酸分离方法局限于单一类型样本且其纯化样本耗时耗力始可得到较佳的纯化结果，不利于同时操作多种不同样本类型以及微量或大量的样本体积者。
[0020]为了解决上述长期存在的技术问题，本发明人等提供一种新颖且有效率处理生物样本之组合物及使用该组合物之核酸扩增方法。根据本发明，可于单一管中以单一步骤完成生物样本的胞解与均质化，并可于同一管中直接添加核酸扩增用之试剂，藉此简化操作流程，降低污染风险及操作时间。根据本发明，可得背景干扰低之核酸扩增结果，提高灵敏度，其可操作的样本体积至约I~30μ I的范围，符合日渐成熟之核酸扩增反应的需求。
[0021]具体地说，本发明一实施形态提供用于生物样本处理之组合物，包括:至少一种卤烃化合物、至少一种聚醚以及至少一种表面活性物质。
[0022]本发明所述之齒烃化合物可包括氟烃化合物、氯烃化合物、溴烃化合物或碘烃化合物等，其中以全氟化烃为佳。全氟化烃习知系作为电子产品的冷却液，被广泛地应用于电子产业。然本发明人等在研发生物样本处理之时，了解到全氟化烃可去除蛋白质的干扰，而且在高温及低温环境中具有化学稳定性且不残留于纯化过程中，藉此可提高从生物样本中分离的核酸纯度。
[0023]本发明所使用之全氟化烃可包括碳数I~12的全氟烷类，包括四氟甲烷、六氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷或全氟辛烷等；以及碳数3~12的全氟环烷类，例如全氟环丙烷、全氟环丁烷、全氟环戊烷、全氟环己烷、全氟环庚烷或全氟环辛烧等。
[0024]本发明所述之聚醚可例如多聚甲醒(paraformaldehyde)、聚甲醒(po lyoxymethy Iene)、聚乙缩醒(polyacetal)、聚乙二醇、聚环氧乙烧(polyethyleneoxide)、聚氧乙烯(polyoxyethylene)、聚丙二醇、聚环氧丙烷(polypropylene oxide)、聚氧丙烯(polyoxypropylene)、聚四甲基二醇(polytetramethylene glycol)、聚四甲基醚二醇(polytetramethylene ether glycol)、聚四氢呋喃(polytetrahydrofuran)、或上述之组合，但不限于此。
[0025]本发明所述之表面活性物质可包括适用于核酸分离的表面活性物质，没有特别限制，具体例如硫酸月桂酸钠(sodium lauryl sulfate)、十二烷基硫酸锂(lithiumdodecyl sulfate)、聚山梨糖醇酯(polysorbate)(例如 Tween 或 Tween80)、聚乙二醇对(I, I, 3, 3-四甲基丁基)苯基醚(polyethyleneglycol4- (I, I, 3, 3-tetramethylbutyl) -phenyl ether)(例如TritonX-lOO)、或上述之组合等。
[0026]本发明所述之用于生物样本处理的组合物中，该卤烃化合物的含量较佳为该组合物总重量的I~70重量％，更佳为10~60重量％，再更佳为20~50重量％。本案所述之聚醚的含量，相对于该组合物的总重量，较佳为I~50重量％,更佳为5~45重量％,再更佳为10~40重量％。本发明所述之表面活性物质的含量，相对于该组合物的总重量，较佳为0.01~5重量％，更佳为0.1~4重量％，再更佳为I~3重量％。
[0027]本发明所述之用于生物样本处理的组合物可进一步包括至少一种用于核酸扩增反应之试剂。该用于核酸扩增反应之试剂没有特别限制，可使用实验室自行调配之试剂，也可使用市售试剂。本发明所述之用于核酸扩增反应之试剂具体可包含例如聚合酶、脱氧核糖核酸、缓冲液或上述之组合。
[0028]对于本发明所述之用于生物样本处理的组合物与用于核酸扩增反应之试剂的调配比例，没有特别限制。但为了获得背景干扰低、灵敏度高的结果，本发明之用于生物样本处理的组合物与用于核酸扩增反应之试 剂的调配比例较佳为1:1~1000，更佳为1:1~500，再更佳为1:1~200。
[0029]本发明所述之核酸扩增反应可包括目前所有可进行核酸扩增之反应，具体例如聚合酶链反应(PCR)、实时聚合酶链反应(real time-PCR)、定量实时聚合酶链反应(real-time quantitative PCR)、多重聚合酶链反应(multiplex PCR)、定量多重聚合酶链反应(multiplex quantitative PCR)、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、乳液 PCR (EmulsionPCR)、固相PCR (Solid PCR)或定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)、核酸测序(Sequence)。
[0030]本发明所述之组合物可处理之生物样本亦没有特别限制，可包括例如细胞、组织、血液、血清、尿液、羊膜液、淋巴液、唾液、粪便、头发、指甲或这些的组合。
[0031]本发明所述之核酸可例如单股核酸，例如RNA ;双股核酸，例如DNA ;或者这些核酸的片段。
[0032]藉由本发明所提供之用于生物样本处理之组合物，可于单一管、单一步骤完成对生物样本的均质化、胞解，以利后续对该生物样本中之核酸的处理。
[0033]因此，本发明发明另一实施形态提供新颖的核酸扩增之方法，包括下列步骤:
[0034]于一生物样本中添加含有至少一种卤烃化合物、至少一种聚醚以及至少一种表面活性物质之组合物，使其均匀混合，形成一均质溶液；以及
[0035]于该均质溶液中添加核酸扩增反应之试剂，使其均匀混合，进行核酸扩增反应。
[0036]所述之卤烃化合物、聚醚及表面活性物质同上述定义。包含该卤烃化合物、聚醚及表面活性物质之组合物之组合比例及酸碱度亦同上定义。[0037]根据本发明所述之核酸扩增之方法，可简化生物样本的处理时间，并减少处理溶液所造成的背景干扰，因此经扩增反应后，可有效地获得高纯度的核酸分子。
[0038]本发明所述之用于核酸扩增反应之试剂没有特别限制，可使用实验室自行调配之试剂，也可使用市售试剂。本发明所述之用于核酸扩增反应之试剂具体可包含例如聚合酶、脱氧核糖核酸、缓冲液或上述之组合。
[0039]本发明所述之包含卤烃化合物、聚醚及表面活性物质之组合物与核酸扩增反应之试剂的调配比例，没有特别限制。但为了获得背景干扰低、灵敏度高的结果，本发明之包含卤烃化合物、聚醚及表面活性物质之组合物与核酸扩增反应之试剂的调配比例较佳为1:1~1000，更佳为1:1~500，再更佳为1:1~200。
[0040]本发明所述之核酸扩增反应可包括目前所有可进行核酸扩增之反应，具体例如聚合酶链反应(PCR)、实时聚合酶链反应(real time-PCR)、定量实时聚合酶链反应(real-time quantitative PCR)、多重聚合酶链反应(multiplex PCR)、定量多重聚合酶链反应(multiplex quantitative PCR)、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、乳液 PCR(EmulsionPCR)、固相PCR (Solid PCR)或定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)、核酸测序(Sequence)。
[0041]为了获得背景干扰低、灵敏度高的结果，本发明之含有至少一种卤烃化合物、至少一种聚醚以及至少一种表面活性物质之组合物与核酸扩增反应之试剂的调配比例较佳为1:1~1000，更佳为1:1~500，再更佳为1:1~200，但不限于此。
[0042]本发明所述之生物样本可包括例如细胞、组织、血液、血清、尿液、羊膜液、淋巴液、唾液、粪便、头发、指甲或这些的组合。
[0043]又本发明所述之核酸可包括例如单股核酸，例如RNA ;双股核酸，例如DNA ;或者这些核酸的片段。
[0044][实施例1]与市售试剂之比较
[0045](I)使用本案之组合物进行核酸纯化
[0046](1-1)组合物(I)之制备
[0047]取12.5μ1全氟己烷(FluorinertTM)UOyl的聚四甲基二醇(polytetramethylene glycol)及 0.1 μ I 的 Triton X-100,均匀混合后，形成组合物(I)。
[0048](1-2)小鼠血液扩增反应
[0049]取小鼠血液10 μ 1、血清10 μ 1，分别加入上述制备之组合物(I)，均匀混合后，静置3分钟，再分别与12.5μ I核酸扩增反应试剂(10mM(NH4) 2S04、IOmM KCl、2mM MgS04、
0.l%Triton X_10020mM、Tris-HCl pH8.8、聚合酶酵素)均匀混合进行下述的PCR扩增反应。
[0050](1-3) PCR 扩增反应
[0051]进行下述条件之聚合酶链反应(PCR)扩增反应，扩增目标基因GAPDH。
[0052]PCR 条件:
[0053]使用上述核酸扩增反应试剂及市售扩增GAPDH的引子对ImM (Fermentas:标准GAPDH引子)，于PCR扩增机台(ABI9700)依下述PCR条件进行扩增:
[0054]维持温度1:95 °C、15分钟；
[0055]循环温度:95°C、10秒；
[0056]58O、30 秒；及
[0057]72O、30 秒。[0058]循环次数:40次。
[0059]维持温度2:72 °C、7分钟。
[0060]将上述PCR反应后之溶液进行电泳(TAE胶，75V)，获得第I图所示之电泳图。
[0061](2)利用市售商品进行核酸纯化
[0062](2-1)小鼠血液的扩增反应
[0063]另一方面，取小鼠血液10 μ 1、血清10 μ I,分别依Fermentas Mixima_?试剂盒
及其操作手册处理。之后进行下述条件之聚合酶链反应(PCR)扩增反应，扩增目标基因GAPDH。
[0064](2-2) PCR 扩增反应
[0065]进行下述条件之聚合酶链反应(PCR)扩增反应，扩增目标基因GAPDH。
[0066]PCR 条件:
[0067]使用Fermentas master mix试剂盒及市售扩增GAPDH的引子对ImM (Fermentas Mixima?试剂盒GAPDH标准引子)，于PCR扩增机台(ABI9700)依下述PCR条件进行扩增:
[0068]维持温度1:95°C、15分钟；
[0069]循环温度:95°C、10秒；
[0070]58O、3O 秒；及
[0071]72O、30 秒。
[0072]循环次数:40次。
[0073]维持温度2:72 °C、7分钟。
[0074]将上述PCR反应后之溶液进行电泳(TAE胶，75V)，获得第I图所示之电泳图。
[0075](3)分析经上述纯化的DNA样本
[0076]根据第I图所示，其中第L栏表示样品条带(ladder)，第1-3栏表示使用Fermentas Mixima?试剂盒处理血清(serum)后之DNA样本，第4-6栏表示使用Fermentas Mixima?试剂盒处理血液(blood)后之DNA样本,第7_9栏表示使用组合物
(I)处理血清(serum)后之DNA样本(Itri PCR)，第10-12栏表示使用组合物(I)处理血液(blood)后之 DNA 样本(Itri PCR)。
[0077]根据第I图所示，由组合物(I)处理的血液、血清，经PCR扩增后所得的DNA样本量明显优于使用市售试剂处理者。
[0078]如本实施例之结果所示，本案组合物可于单一管中以单一步骤完成生物样本的胞解与均质化，并可于同一管中直接添加核酸扩增用之试剂，藉此简化操作流程，降低污染风险及操作时间。
[0079][实施例2~5]处理的样本体积范围
[0080]将实施例1所制备之组合物(I)以下表1所示之体积与样本血液之等体积混合后，再与核酸扩增反应试剂混合。之后，以扩增GAPDH的引子对ImM(Fermentas Mixima?试剂盒GAPDH标准引子)于PCR机台(ABI9700)进行95°C变性；58°C黏合，循环次数40的PCR反应，扩增血液内标记引子的DNA样本。将上述PCR反应后之溶液进行75V、TAE胶的电泳，获得第2图所示之电泳图。[0081][表1]
[0082]
【权利要求】
1.一种用于生物样本处理之组合物,包括: 至少一种卤烃化合物(halocarbons)、至少一种聚醚以及至少一种表面活性物质,其中该卤烃化合物的含量为该组合物总重量的I~70重量％。
2.权利要求1所述之用于生物样本处理之组合物，其中该卤烃化合物包括全氟化烃。
3.权利要求2所述之用于生物样本处理之组合物，其中该全氟化烃包括四氟甲烷、六氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷、全氟辛烷或上述之组合。
4.权利要求1所述之用于生物样本处理之组合物，其中该聚醚包括多聚甲醛(paraformaldehyde)、聚甲醒(polyoxymethyIene)、聚乙缩醒(polyacetal)、聚乙二醇、聚环氧乙烧(polyethylene oxide)、聚氧乙烯(polyoxyethylene)、聚丙二醇、聚环氧丙烷(polypropylene oxide)、聚氧丙烯(polyoxypropylene)、聚四甲基二醇(polytetramethyIene glycol)、聚四甲基醚二醇(polytetramethylene ether glycol) >聚四氢呋喃(polytetrahydrofuran)、或上述之组合。
5.权利要求1所述之用于生物样本处理之组合物，其中该表面活性物质包括硫酸月桂酸钠(sodium lauryl sulfate)、十二烷基硫酸锂(lithium dodecyl sulfate)、聚山梨糖醇酯、聚乙二醇对(1，1，3，3_四甲基丁基)苯基醚、或上述之组合。
6.权利要求1所述之用于生物样本处理之组合物，其中该聚醚的含量为该组合物总重量的I~50重量％。
7.权利要求1所述之用于生物样本处理之组合物,其中该表面活性物质的含量为该组合物总重量的0.01~5重量％。
8.权利要求1所述之用于生物样本处理之组合物，其中该组合物更包括至少一种用于核酸扩增反应之试剂。
9.权利要求8所述之用于生物样本处理之组合物，其中该用于核酸扩增反应之试剂包括聚合酶、脱氧核糖核酸、缓冲液或上述之组合。
10.权利要求8所述之用于生物样本处理之组合物，其中该组合物与该用于核酸扩增反应之试剂的比例为1:1~1000。
11.权利要求8所述之用于生物样本处理之组合物，其中该核酸扩增反应包括聚合酶链反应(PCR)、实时聚合酶链反应(real time-PCR)、定量实时聚合酶链反应(real-timequantitative PCR)、多重聚合酶链反应(multiplex PCR)、定量多重聚合酶链反应(multiplex quantitative PCR)、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、乳液PCR(Emulsion PCR)或定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)。
12.权利要求1所述之用于生物样本处理之组合物，该生物样本包括细胞、组织、血液、血清、尿液、羊膜液、淋巴液、唾液、粪便、头发、指甲或这些的组合。
13.权利要求1所述之用于生物样本处理之组合物，该核酸包括单股核酸、双股核酸、核酸片段、或这些的组合。
14.一种核酸扩增之方法，包括下列步骤: 于一生物样本中添加含有至少一种卤烃化合物、至少一种聚醚以及至少一种表面活性物质之组合物，使其均匀混合，形成一均质溶液；以及 于该均质溶液中添加核酸扩增反应之试剂，使其均匀混合，进行核酸扩增反应； 其中，该卤烃化合物的含量为该组合物总重量的I~70重量％。
15.权利要求14所述之核酸扩增之方法，其中该卤烃化合物包括全氟化烃。
16.权利要求15所述之核酸扩增之方法，其中该全氟化烃包括四氟甲烷、六氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷、全氟辛烷或上述之组合。
17.权利要求14所述之核酸扩增之方法，该聚醚包括多聚甲醛(paraformaldehyde)、聚甲醒(polyoxymethyIene)、聚乙缩醒(polyacetal)、聚乙二醇、聚环氧乙烧(polyethylene oxide)、聚氧乙烯(polyoxyethylene)、聚丙二醇、聚环氧丙烷(polypropylene oxide)、聚氧丙烯(polyoxypropylene)、聚四甲基二醇(polytetramethylene glycol)、聚四甲基醚二醇(polytetramethylene ether glycol) >聚四氢呋喃(polytetrahydrofuran)、或上述之组合。
18. 权利要求14所述之核酸扩增之方法，其中该表面活性物质包括硫酸月桂酸钠(sodium lauryl sulfate)、十二烷基硫酸锂(lithium dodecyl sulfate)、聚山梨糖醇酯、聚乙二醇对(1，1，3，3_四甲基丁基)苯基醚、或上述之组合。
19.权利要求14所述之核酸扩增之方法，其中该聚醚的含量为该组合物总重量的I~50重量％。
20.权利要求14所述之核酸扩增之方法，其中该表面活性物质的含量为该组合物总重量的0.01~5重量％。
21.权利要求14所述之核酸扩增之方法，其中该核酸扩增反应之试剂包括聚合酶、脱氧核糖核酸、缓冲液或上述之组合。
22.权利要求14所述之核酸扩增之方法，其中该组合物与该核酸扩增反应之试剂的比例为1:1~1000。
23.权利要求14所述之核酸扩增之方法，其中该核酸扩增反应包括聚合酶链反应(PCR)、实时聚合酶链反应(real time-PCR)、定量实时聚合酶链反应(real-timequantitative PCR)、多重聚合酶链反应(multiplex PCR)、定量多重聚合酶链反应(multiplex quantitative PCR)、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、乳液PCR(Emulsion PCR)或定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)。
24.权利要求14所述之核酸扩增之方法，其中该生物样本包括细胞、组织、血液、血清、尿液、羊膜液、淋巴液、唾液、粪便、头发、指甲或这些的组合。
25.权利要求14所述之核酸扩增之方法，其中该核酸包括单股核酸、双股核酸、核酸片段、或这些的组合。
【文档编号】C12N15/10GK103571825SQ201310213700
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年5月31日 优先权日:2012年8月9日
【发明者】陈奕璋, 蔡秀娟 申请人:财团法人工业技术研究院